우리는 플라이 주식에 대한 제스퍼 Kronhamn 댄 Hultmark, 마이클 Galko 및 블루밍턴 증권 센터 감사합니다. 통계 분석과 조언을 코트니 오노 데라 특별 감사. 우리는 원고의 중요한 읽기 카트리나 골드, 그리고 칼 파나 마히 자니, ​​카트리나 골드, Derynck 실험실의 구성원, 그리고 원고에 대한 토론과 의견 Nystul 실험실의 구성원을 감사드립니다. 이 작품은 혁신적인 생물 의학 연구 (PBBR), 넓은 센터, 헬만 재단, 미국 암 학회 (American Cancer Society) RSG DDC-122595, 미국 심장 협회 (American Heart Association) 13BGIA13730001, 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 1326268, 건강 1R01GM112083-01의 국립 연구소와의 UCSF 프로그램에서 보조금에 의해 지원되었다 (KB에) 1R56HL118726-01A1.

1. 혈구 블리드 / 긁 분석 <ol><li> 슬라이드의 준비 : <ol><li> 타일​​ 스캔 기능이없는 현미경 옵션 1 : 각각의 유충을 분석 할 경우, 현미경의 분야의 관찰 영역에 대응하는 2mm 사각형 각각 약 5 자궁암 펜 웰으로 한 유리 슬라이드를 준비; 각 (그림 1A)에 S2 미디어의 10 μL - 약 5를 추가합니다. 마르지 우물을 방지하기 위해 습기 챔버에서 슬라이드를 유지합니다. </li><li> 타일​​ 스캔 기능을 가진 현미경 옵션 2 : 각각의 유충을 분석 할 경우, 3 ~의 3 ~ 4 팹 펜 우물 하나의 유리 슬라이드 준비 - 4 mm의 사각형을 각각; 각 웰 (그림 1B)에 S2 미디어의 20 μL - 약 15를 추가합니다. 마르지 우물을 방지하기 위해 습기 챔버에서 슬라이드를 유지합니다. 참고 : 우물 위의 권장 수 ~ 2.5, 유충 당 최대 3,000 혈구의 합계 (후반 2 차의 령 유충에 충분하다 - larv의 대부분을 라벨 3mm 길이, 형질 전환 유전자알 혈액 세포). 큰 혈액 세포 수를 평가하는 경우, 더 웰 위에 크라우 딩을 피하기 위해 필요할 수도있다. </li></ol></li><li> 유충의 컬렉션 : <ol><li> 페트리 접시에 애벌레와 플러시 유충을 포함하는 비행 유리 병에 물을 분출, 또는 페트리 접시에 애벌레가 들어 약간의 음식을 특종과 물총 병을 사용하여 물을 희석. </li><li> 조심스럽게 붓을 사용하여 페트리 접시에서 유충을 선택하고 공동 접시에 또는 감기 블록에서 슬라이드에 물에 배치합니다. 참고 : 유충은 물이나 차가운 블록에 제한된 시간 동안 유지 될 수있다; 애벌레 사망 또는 혈구에 원치 않는 효과를 방지하기 위해 45 분 이내에 시료를 사용합니다. </li></ol></li><li> 해부: <ol><li> 차가운 금속 블록에 형광 현미경으로 유충을 선택합니다. 원하는 경우 크기와 이미지 유충을 측정합니다. </li><li> ( &quot;블리드&quot;) 혈구 세포를 순환의 분리 : <ol><li> 유충이 선택되면, 최초의 자궁 펜도 (그림 1C 한 유충을 배치2A). </li><li> 유충의 후방 및 전방 양쪽 끝에서 절개를 2 깨끗한 바늘 또는 해부 가위와 집게를 사용합니다. 상주 혈구 세포를 방해하지 않도록하기 위해, 유충의 복부 측면에서 이러한 절개를하게하는 것이 가장 좋습니다. 일관된 결과를 들어, 모든 유충에 대해 동일한 위치에 절개를합니다. 1 차 령 애벌레를 들어, (복부 앞쪽에) 1 절개는 충분하다. </li><li> 유충은 어떤 압력이나 물리적 교반 (그림 2A)없이 몇 초 동안 피하도록 허용합니다. 참고 : 여러 유충에서 작업하는 경우는 샘플 &#39;무결성에 영향을 미칠 수있는 너무 오래 얼음에 유충을 유지 피하기 위해 다음 단계를 진행하기 전에 각각에 대해이 절개를 확인하는 것이 좋습니다. </li><li> 조심스럽게 바늘이나 집게로 유충을 들어 올려 남아있는 순환 혈구 세포를 씻어 두 번째 우물에 그것을 찍어. 그 후, 상주 혈구 세포의 출시와 함께하십시오. </li></ol></li><lI&gt; 상주 혈구의 분리 ( &quot;다 쳤어요&quot;) : <ol><li> 조심스럽게 다음 잘 (그림 2C)에 유충을 전송합니다. </li><li> 일반적으로 유충의 앞쪽 끝에서 약 1/3있는 유충의 임파선을 확인하고, 애벌레 몸 벽을 통해 등쪽으로하는 형광 수 있습니다. (그림 2C)을 천공 피하기 위해 임파선에 가능한 한 가까운 바늘로 유충을 달아하여 주민 혈구 세포를 해제하면서 임파선을 피하십시오. 참고 : 임파선 혈구 세포의 성숙이 애벌레 혈구 세포에 비해 지연되고, 차별화 된 혈구 세포의 형광 기자는 어린 유충의 임파선의 신호가 표시되지 않을 수 있습니다 정상적인 개발하는 동안. 이러한 경우, 덜 관심이 예상된다 임파선 혈구 세포로 분화 형광 표지 애벌레 혈구없이 오염으로 임파선에 지불해야합니다. </li><li> dissecti에 거주하는 혈액 세포를 분리긁어 및 / 또는 찌르는 과정에. 필요에 따라 효과적으로 림프 글 랜드 근처 유충 (위 참조) 또는 다른 신체 부분을 아래로 핀 하나의 바늘을 사용합니다. 혈구 세포를 분리하는 것을 목표로, 애벌레 몸 벽 (그림 2C, E)를 통해 볼 수 있습니다 혈구의 클러스터에서 잽을 다른 바늘을 사용합니다. 혈구는 스크 레이 핑 운동에 출시 할 수 있습니다. 그러나, 초기에 표피를 찢어하면 자동 계산이 더 도전 할 수있는 혈액 세포의 큰 클러스터를 공개 할 수 있습니다. 참고 : 유충의 연령과 유전자형에 따라, 전체 혈구 세포의 수는 달라질 수 있습니다. 단일 세포 이미지 분석을 더 어렵게 만들 수있는 혈액 세포와 일부 웰의 혼잡을 피하기 위해 여러 웰 위에 상기 박리 공정을 배포한다. </li><li> 몇 혈구 세포가 최종 시체에 남아있는 경우, 수동 집계 카운터 (그림 2E)의 현미경 사용을 통해 관찰하여 이러한 혈구 세포를 계산합니다. 카운팅, P를 용이같은 슬라이드 청정 영역에, 카 커스를 레이스와 광학면의 개수를 감소시키기 위해 가능한 한 얇게 확산. </li><li> 세포가 우물 이미징 전에 정착 (그러나 반드시 준수되지 않음)에 대해 10 분 - 해부가 완료되면, 5 ~ 기다립니다. 건조를 방지하기 위해 습기 챔버에서 슬라이드를 품어 및 정착 혈구 세포를 방해 할 수있는 슬라이드의 거친 취급을 피하십시오. 주 : 결정 혈구 계수는, 세포를 고정 해제되지 않고, 세포가 바람직 유충으로부터 해제 후 30 분 이내에, 곧 박리 후에 묘화해야 할 때. 웰에서 매질의 광학면을 중심으로 확인해야 10 분, - 중간 및 셀 특성의 부피에 따라, 세포의 대부분은 5 내에 정착된다. 하지만, 혈액 세포의 분획은,이 시간에 의해 슬라이드면에 고려 될 필요가 사실을 부착 한 경우 세포의 고정 기반 approache 본 프로토콜 수정의. </li></ol></li></ol></li><li> 부량: <ol><li> 형광 현미경 (그림 2B, D, F)에서 정착 혈구의 이미지를 가져 가라. ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 혈구의 정량화에 따릅니다. </li><li> ImageJ에 셀 계산 알고리즘에 대한 이미지를 준비합니다 <ol><li> 잘 사용 ImageJ에 열기 이미지 : → → 열기를 (파일을 찾아 선택) 파일. </li><li> 이미지 (들)은 8 비트 또는 16 비트인지 확인합니다. 이미지를 선택하여 이미지에 대한 임계 값을 조정 한 후 조정을 선택 임계 값을 누릅니다. &quot;임계 값 창&quot;(그림 3A)를 관찰한다. </li><li> &quot;어두운 배경&quot;옵션을 선택합니다. &quot;레드&quot;를 선택하고 이미지의 각 셀이 빨간색 점 (그레이 스케일로 알 수있다 적용되지 않는 세포도 3B)가 표시 될 때까지 (검은 색 화살표 참조) 낮은 임계 값 레벨을 증가시킨다. 낮은 임계 값으로일부 세포가 표시되지 않은이 될 것 증가한다. 이 낮은 임계 값을 설정하는 방법까지에 대한 지표가 될 수 있습니다. 주 : 때때로 세포의 클러스터가 해결 될 수 없으며, 입자 계수기에 의해로 계산 한 것이다. 그러한 경우에, 클러스터에있는 세포 수는 이미지를 검사 (필요한 경우 줌) 및 수동 카운팅 탤리 계수기를 사용하여 추정 될 수있다. 대안 적으로, 낮은 임계 셀 클러스터를 해결하기 위해 증가 될 수있다; 이 조작으로 인한 표시되지 않은 세포를 집계 카운터를 사용하여 계산 될 수있다. </li></ol></li><li> ImageJ에를 사용하여 세포 수를 분석 : <ol><li> 세포 (그림 3C)를 계산하는 입자 분석기를 시작합니다. 분석 선택과 입자 분석을 클릭합니다. 선택적으로 입자에게 알고리즘 수 (그림 3D)를 참조하기 위해 &quot;오버레이 개요&quot;를 선택합니다. 또는, 장치의 크기 나 화소 영역에 제한을 설정 (예,., 휴대폰, 알고리즘 세포 등)의 덩어리가 계산합니다. </li><li> 확인을 클릭합니다. 수 (그림 3E)와 요약 창을 준수하십시오. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. 혈구 장애 분석 <ol><li> 혈구 세포를 선택 유충을 방해하고 유리 구슬 (212-600 μm의) 약 0.5 g을 2 ML의 microcentrifuge 관에 배치하고, 0.5 ml의 물을 추가합니다. </li><li> 1 분 동안 속도 10, 손으로, 튜브를 소용돌이. </li><li> 페트리 접시에 microcentrifuge 관의 내용을 유출하고 붓으로 유충을 선택하여 유리 구슬의 유충을 검색합니다. </li><li> 복구 단계의 경우, 플라이 음식의 소량 이전에 제조 된 배양 접시에 애벌레를 놓습니다. 유충은 45 분 또는 원하는 기간 동안 자신의 혈구 패턴을 다시 설정하도록 허용합니다. 주 :이 과정에서 사망 한 바와 같이, 이동을 중지 어떤 유충을 폐기하십시오. 그러나, 우리는 일반적으로 L 참조ittle 손상 텍싱의 1 분 후 (아래 참조 및 보충 그림 1). </li><li> 제 1 절에서 상술 한 바와 같이 회복 기간 후, 블리드 / 긁 분석을 계속합니다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

여기서는 정량적 단일 초파리 유충으로부터 거주자 순환 혈액 세포를 회수하고, 이들 두 혈구 개체군을 정량화하는 첫 번째 방법을 설명한다. 프로토콜은 촬상 및 자동 셀 카운팅 하였다 순환 주민 혈구 연속 방출을 포함한다. 60 분간의 회복 기간을 6 - 유충 상주 혈구 세포는 일시적으로, 기계적 교란에 의해 순환에 주로 30에서 반전 될 것으로 알려진 프로세스를 동원 할 수있다. 따라서,이 프로토콜은 두 가지 방법으로 시험 하였다 (1) 유충 및 유충 발달의 과정 혈구 세포 순환 분획 당 총 혈구 수를 평가함으로써, (2) 실험적으로 자동화 된 방법을 사용하여 상주 혈구 세포를 빠지 의해 확정 된 혈구의 현지화 및 주민의 혈구 수와 순환 인구의 긴밀한 상관 관계. 또한, 본 방법의 재현성이 입증되었다 CO생물 복제의 두 데이터 세트를 mparing. 과거에는, 실험실 유생 6,13,21 혈구 세포를 정량화하는 방법의 범위를 사용 하였다. 이 프로토콜은 검색하고 쉽게 적응할 플랫폼을 제공 초파리 유충으로부터 거주자 순환 혈액 세포 집단을 정량화하는 공통 표준을 정한다. 설명하는 방법은 상주 혈구과 미세 환경의 역할에 초점을 연구에 중요하다, 조혈 4-6 포켓, 형광 단백질 야생 타입 유전자 운반 초파리 균주 및 유전자 변형 배경을 연구하기에 적합합니다. 이 프로토콜은 또한 거주자 혈구 세포 또는 (4 검토) 총 혈구 수의 변화 동원을 유발 면역 도전이나 부상, 유전 또는 환경 적으로 유도 신호 후 혈구 동원에 초점을 연구 관련이있다. 이는 조기 디 경우에 주목해야한다임파선 계통 대 배아 / 애벌레를 구별 fferentiation과 임파선에서 혈구 세포의 방출은, 사용 된 형광 혈구 기자의 발현 패턴에 의해 제한 될 수 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 영상 라이브, 형광 표지 된 혈구 세포에 의존한다. 향후, 이는 면역 세포 화학을 이용하여, 예를 들어, 고정 해제 후 세포의 검출을 허용하도록 변형 될 수있다. 방법은 혈구 세포의 검색과 그 조작 EX 할 수 있으므로이 경우, 프로토콜은 접착 배양 시간을 증가 및 콘 카나 발린 A의 같은 접착제 슬라이드 코팅을 추가하여, 예를 들어 혈구의 완전한 접착 성을 보장하도록 구성 될 필요가있다 생체, 그것이 발달, 세포 생물학, 생화학 적 연구의 다양한 혜택. 주민과 순환 혈액 세포는 모든 초파리의 postembryonic 발달 단계 및 기타 무척추 동물 (22), suggesti 동안 발견NG이 방법의 적응은 초파리 애벌레 조혈 시스템 연구 이후 다양한 혜택.

무척추 동물 모델 초파리 melanogaster의 연구는 선천성 면역 (1)의 검색을 구동하고 있으며, 2-4. 초파리 조혈은에 유래 배아 / 유생 혈구 세포의 혈통로 분할 될 수 혈액 세포 발달의 여러 측면의 이해를 용이하게했다 배아 및 유충에 확장 한 임파선의 혈통은 4,5 혈구. 여기, 우리는 초파리 유충에 주로 plasmatocytes (대 식세포) 거의 결정 세포 (4)을 포함 애벌레 / 배아 혈구 세포의 혈통에 초점을 맞춘 프로토콜을 제시한다. 표피와 애벌레 몸 벽 5,6의 근육 층 사이에있는 유충에서 배아의 혈구가 지속 및 식민지 6063 반복 터미널 조혈 포켓 (HP의). 자기 갱신 대 식세포 (6), 지방 조직의 미세 환경 (6)에서의 주된 거주지로 그 성격을 바탕으로개발 중에 6,8- 나오는 초기 혈액 세포에서 7 일 및 그 혈통,이 혈액 세포 집단은 척추 자기 갱신 조직 대 식세포, 최근 종 4,9,10 다양한 식별 독립적 골수성 리니지 유사한 것으로 간주된다. 하지만, 초파리에서, 이러한 일부 또는 모든 셀 거주자 또한 소성은 액정 셀 (11, 12)과 같은 다른 혈액 세포 유형을 야기 할 나타낸다. 유생 혈구 세포는 주로 상주 (고착)이지만, 다양한 HP의 사이의 동적 안정 상태에있다. 3 차 령 유충이 pupariation 5-7에 접근 그들은 점진적으로 특히, 순환으로 방출된다. 체액 4,6,13에 면역 가역 후자의 경우에 도전, 조기 부상 또는 기계적 교란 납, 주민 혈구 세포의 동원. 이전의 연구는 주민 제안 및 순환 한애벌레 혈구 세포는 같은 혈통이지만, 자신의 접착제 또는 유도 속성 6,7,13,14 다르다. 상주 혈구 대 순환의 선택적 분리는 말초 신경계의 감각 신경 세포 클러스터를 표피와 근육 층으로 지어 더욱 항구 된 HP의 6. 초파리 애벌레 HP의에서 유도 단서에 노출을 제안, 주민 혈구 인구에 확산의 높은 수준을 보여 (PNS) 및 간 기능은 oenocytes 6 닮은. 기능적으로, 돌연변이와 유전자 세포 제거 실험은 HP의에 존재하는 감각 뉴런이 애벌레 혈구 6의 영양 생존과 현지화를 지원하는 것을 증명하고있다. 여기에서 우리는 특정 고립과 주민의 정량화 및 단일 초파리 유충에서 순환 혈구 세포 및 기계 혈구 동원을위한 프로토콜하는 방법을 설명합니다. 방법은 생체 외에서 사용될 수있다그리고 혈구 세포의 연구는 또한 이러한 번데기 성인 및 다른 시스템과 같은 다른 무척추 초파리 발달 단계에 적용 할 수있다. 이전의 연구는 거주자 순환 혈구 세포를 구별하지 않았기 때문에,이 프로토콜은 상주 혈액 세포의 연구를위한 공통 표준을 제공하고 무척추 혈액 세포 연구의 일관성을 증가시키는 것을 도울 것이다. 우선, 혈구 블리드 / 긁 세이 차동 분리 및 형광 단백질 표시된 거주자 단일 초파리 유충 혈구 집단 순환 자동 정량 설명; 프로토콜은 일반 타일 스캔 갖춘 현미경을위한 두 가지 옵션 (그림 1)를 제공합니다. 결과적으로, 순환 혈구 세포의 백분율 및 애벌레 당 혈구 세포의 총 수를 얻을 수있다. 방법은 혈액 세포 중에서 형광 단백질을 발현 형질 전환 초파리 유충에 의존인구. 혈구 드라이버 또는 리포터의 선택은 혈액 세포의 집단을 가시화하고 정량하는, 즉 결과를 판정한다. 주로 레이블을 지정하려면 대 식세포 주민과 초파리 유충 (6)의 순환 혈구 인구의 대다수를 포함한다 (plasmatocytes)는, 적합한 유전자는 (기준 HML Δ-을 DsRed 6 HmlΔ -GAL4 15 Pxn -GAL4 16 Crq-GAL4 포함 H. Agaisse 16), 또는 먹는-GAL4 (17); 액정 셀의 비교적 작은 모집단을 표지 용, 적합한 라인 BcF6-CFP 및 -GFP (18), 또는 (J. 폴록 19) LZ-GAL4이고; 라벨링 lamellocytes 위해 특화된 세포 유형은 주로 면역 도전 부상 (13)에 의해 유도는, 예를 들면, MSNF9mo mCherry-17을 사용할 수있다. 일부 형질 드라이버는 차별화 된 혈액의 범위로 표현되는유생 모든 혈액 세포 (20)의 약 80 % 레이블 GAL4 20, - 예컨대 그와 같은 세포 및 전구 세포. GAL4 드라이버가 사용되는 경우 UAS-GFP 또는 다른 형광 단백질 UAS - 유전자와 결합이 필요하며, 모든 경우에주의하시기 바랍니다. 결과 섹션에서,이 방법은 유충 발달의 과정을 통해 혈액 세포 수 및 순환 동작을 모니터링하기 위해 사용된다. (- 60 분 30) (6) 둘째, 혈구 방해 분석 이후에 다시 부착하고 집에 HP의에 제한된 시간 내에 혈구의 능력에 대한 평가를 할 수 있습니다 외부 조작에 의해 주민 혈구 세포를 분리하도록 설계 이전 단계에 대해 설명합니다. 일반적으로 상기 분석은 당 유충 혈구 세포 순환의 비율을 결정하기 위해 블리드 / 긁 분석으로 이어진다. 우리는 소용돌이로 교반 재치에 의해 방해를 사용하여이 분석 (그림 1D)에 대한 단순화 된 프로토콜을 제시H 유리 비드보다는 페인트 브러시 단일 유충의 조작 이전에 설명 된 바와 같이 6. 결과 섹션에서,이 분석은 체액에 그 일시적으로 분리 된 혈구 세포 부유물을 입증하기 위해 사용되며, 순환 혈구 세포의 분획에서 회수 할 수있다. 분석은 예를 들어, 다양한 유전 적 배경이 나 자극 조건을 비교 상주 사이트에 자신의 유도 / 접착 혈구의 차이를 정량화하는 것이 유용하다. 이 기계 조작 가역 과정을 반영하고 일반적으로 짧은 시간 4,13에 되돌릴 수없는 infection-이나 부상에 의한 주민 혈구 동원, 구별됩니다.

<table><tbody><tr><td>6 cm/9 cm Petri dishes</td><td></td><td></td><td>One for each genotype to be evaluated</td></tr><tr><td>Water squirt bottle</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metal spoon/spatula</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thin paintbrush</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;e.g.,&lt;/em&gt; a &quot;liner&quot;</td></tr><tr><td>Glass cavity dish</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAP pen: Super PAP PEN IM3580</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass slides</td><td></td><td></td><td>Each slide will have 5 or more PAP PEN squares drawn on them. Size of squares depends on the imaging objective and magnification of the microscope camera; &lt;em&gt;e.g.,&lt;/em&gt; 2 mm squares.</td></tr><tr><td>Moist chamber</td><td></td><td></td><td>This will be used to prevent slides and wells from drying out: sealed container with wet paper towels lining the sides/bottom</td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; cell culture media</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cold block</td><td></td><td></td><td>This is a metal block (a.k.a. heating block) chilled in bucket containing ice; preferably black-colored or other dark, non-reflective color</td></tr><tr><td>2 x 1 ml syringes with needles (27 G &amp;frac12;&quot;)</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>For dissections.</td></tr><tr><td>Optional: Surgical spring scissors (cutting edge 2 mm)</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass beads, 212 - 600 &amp;mu;m</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ml Eppendorf tubes</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>One per genotype evaluating</td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transgenic Drosophila larvae with fluorescently marked hemocytes.</td><td></td><td></td><td>Suitable transgenes include: Hml&amp;Delta;-DsRed (Makhijani &lt;em&gt;et al.,&lt;/em&gt; 2011), MSNF9mo-mCherry (Tokusumi &lt;em&gt;et al.,&lt;/em&gt; 2009), BcF6-CFP and -GFP (Gajewski &lt;em&gt;et al.,&lt;/em&gt; 2007), or Hml&amp;Delta;-GAL4 (Sinenko and Mathey-Prevot, 2004), Pxn-GAL4 (Stramer &lt;em&gt;et al.,&lt;/em&gt; 2005), He-GAL4 (Zettervall &lt;em&gt;et al.,&lt;/em&gt; 2004), Crq-GAL4 (by H. Agaisse (Stramer &lt;em&gt;et al.,&lt;/em&gt; 2005)), or eater-GAL4 (Tokusumi &lt;em&gt;et al.,&lt;/em&gt; 2009) combined with UAS-GFP or other fluorescent protein transgenes.</td></tr><tr><td>Fluorescence dissecting microscope</td><td>Leica</td><td></td><td>Here: Leica M205, optional with camera, imaging software and measuring module</td></tr><tr><td>Inverted fluorescence microscope with camera attachment</td><td>Leica or Keyence</td><td></td><td>With or without tile scanning function (&lt;em&gt;e.g.,&lt;/em&gt; Leica DMI series, Keyence BIOREVO BZ-9000 series)</td></tr></tbody></table>

assaying blood cell populations of the drosophila melanogaster larva

척추 동물에서 조혈는 유도 미세 환경 (틈새)에 의해 조절된다. 마찬가지로, 무척추 동물 모델 생물 초파리에서 애벌레 조혈 포켓 (HP의)로 알려진 유도 미세 환경은 자기 갱신 식세포 혈통 특히 개발 및 혈액 세포 (혈구)의 규제 해부학 사이트로 확인되었다. HP의이 6063과 같은 말초 신경계의 감각 뉴런을 포함 유충의 표피와 근육층 사이 주머니를 반복했다. 유충에서, 상주 (고착) 혈구 세포는 항 세포 사멸, 접착제이 감각 신경 세포에서 증식 단서 및 라이닝 근육과 상피 층과 HP의 잠재적으로 다른 구성 요소에 노출되어있다. HP의 연료에서 정상적인 개발, 주민 혈구 세포의 점진적 해제하는 동안 개월의 릴리스에서 절정 순환 혈구 세포의 인구,변태의 시작 부분에 상주 혈구의 일. 면역 공격, 부상 또는 기계적 장애는 혈액 순환에 상주 혈구 세포의 조기 석방을 트리거합니다. 거주 장소와 순환 사이 유생 혈구 세포의 스위치를 선택적으로 분리하고 단일 초파리 유충으로부터 혈액 세포의 이러한 두 집단을 정량화하는 표준 공통 / 절차에 대한 필요성을 제기한다. 따라서,이 프로토콜은 해제하고 하나의 유충에서 주민과 순환 혈구 세포를 정량화 할 수있는 자동화 된 방법을 설명합니다. 상기 방법은 생체 외 접근법을 용이하게하고, 초파리 발달 단계 및 다른 무척추 동물 유기체의 다양한 서비스를 제공하도록 적응 될 수있다.

설명 방법의 전형적인 결과를 설명하기 위해, 우리는 먼저 애벌레 혈구 수의 진행과 애벌레 개발의 과정을 통해 자신의 기숙사 (그림 4) 윤곽을 혈구 블리드 / 쳤어요 분석을 사용했다. 주민과 애벌레 혈구 인구 순환이 하나의 유충에서 분리 하였다 (HML Δ-GAL4, UAS-GFP, 그는-GAL4는 레이블을 광대 한 애벌레 혈구의 대부분)와 ImageJ에를 사용하여 정량화. 유충의 동료는 (~ 48 시간의 AEL 또는 1 차 령), 2.5 mm (~ 80 시간의 AEL 또는 늦게 2 차의 령), 3.5 mm (~ 96 시간의 AEL 또는 3 차 령)을 조사 하였다 (그림 4) 1.2 mm의 크기 . 혈구의 숫자와 상관 염료 염색 유충 7 애벌레 표피 (6)을 통해 형광 단백질 표지 혈구의 라이브 계수의 광학 현미경을 기반으로 기존 추정치를 상회 애벌레 개발의 과정을 통해 확대. 1 차 기능에순환 혈구 세포의 분획은 점진적 이전 공보 -6,7- 부합 유충 발달 과정 (도 4B, C) ​​위에 증가하면서 타르 유충 거의 모든 혈구 세포가 상주했다. 다음으로 우리는이 방법은 충실하게 주민과 순환 인구 사이의 혈구 세포의 변화를 모니터링 여부를 조사했다. 거주자 혈구 세포가 일시적으로 기계적 교란에 의해 분리 될 수 있고, 그들의 상주 사이트 자발적 6-부착 재한다는 현상을 활용, 우리는 혈구 장애 분석에서 기술 된 바와 같이, 유리 비드 텍싱하여 거주자 혈구 세포를 분산. 실제로, 유충의 기계적인 방해가 상주 혈구의 비용 (그림 5)에서 혈구 세포를 순환의 인구의 급격한 증가로했다. 45 분간의 회복 기간 후, 혈구 세포는 주로 시각적 검사와 같은 양으로, 그들의 접착 상태로 돌아왔다순환 세포에 규정하는 비율 (그림 5D, E). 예상 한 바와 같이, 전체 혈구 번호는 순환 및 집단 거주 혈구 세포 사이의 이동에도 불구하고, 시간이 지남에 안정적이었다. 몇 가지 추가 고려 사항이 고려되었다. 유리 구슬이 다​​양한 시간주기들 (1, 5, 20 분)에 대한 트립 판 블루 (시그마)의 존재하에 수행 하였다 텍싱하여, 주요 조직 손상을 유발하지 않았다 텍싱을 확인하는 방법. 20 분 텍싱이 양성 대조군 (보충 그림 1)으로 사용 바늘 바늘로 인한 손상을 닮은, 손상의 작은 영역의 결과 동안 모두 1과 5 분 볼텍스, 명백한 조직의 파괴가 발생하지 않았다. 표피 또는 표피 손상없이 다른 조직의 내부에 손상을 배제 할 수는 없지만,이 시나리오는 애벌레 무결성 타협하지 않았다 제안, 1 분, 5 분 처리 유충 재 부착 된 예상 패턴 및 시간 프레임에서의 혈구 오히려 가능성이 보인다D (보충 그림 1). 대조적으로, 유충 재 부착의 부족으로 고통을 20 분 동안 볼 텍싱하고, 14 이전에 설명 된 바와 같이, 심지어, 표피 창상 부위에 순환 혈구 세포의 부착을 나타내지 않았다. 마지막으로, 방법의 재현성을 입증하기 위해, 우리는 서로 다른 실험자에 의해 수행되었다 위의 두 실험에서 2.5 mm의 유충의 생물 복제를 비교했다. 기업도 2에 도시 된 바와 같이, 모두 비교 코호트는 총 애벌레 당 혈구 세포의 숫자 및 순환 혈구 세포의 백분율을 보여 주었다. 스튜던트 T 테스트 방법은 재현성 넓게 적용될 수 있다는 것을 시사 통계적으로 유의 한 차이가 없었다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52733/52733fig1highres.jpg" width="500" /> 그림 1. 혈구 블리드 / 긁고 장애 분석의<html> etup 및 회로도. (A) 단일 이미지 슬라이드 설정 : 5 배 목적으로 이미징을위한 다섯 2mm 사각형 (B) 타일 스캔 슬라이드 설정 :. 영상 블리드 네 3mm 사각형 / 타일 스캔 현미경 ≤2.5 MM 유충의 긁힌 자국. 이미징을위한 권장 목표 5 배 또는 10 배. (C) / ImageJ에를 사용하여 긁어 분석 회로도와 결과 정량화 블리드. (D) 장애 분석에 있으며, 혈구 패턴을 기계적으로 유리 구슬과 유충을 텍싱에 의해 파괴된다. 애벌레는 혈구 세포는 조혈 포켓에 다시 부착하는 동안 45 분의 기간 동안 복구 할 수 있습니다. 혈구 세포의 접착 특성 외란 후 순환 혈구 세포의 비율을 정량화,이 방법에 의해 평가 될 수있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52733/52733fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 방법 &quot;&gt; <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52733/52733fig2highres.jpg" width="700" /> 그림 2. 블리드 / 긁 분석은 순환과 주민 혈구 분리합니다. (A) 유충을 피가 유충의 후방 및 전방 단부에서 복부 절개 (위 기호) 제조된다. (B) 혈구 절개 유출과 슬라이드의 표면에 정착된다 순환한다. (C) 림프 글 랜드 (LG 전자)에 위치하고 천공하지 않고, 아래로 고정됩니다. 주민의 혈구 세포를 찌르고 및 / 또는 바늘로 유충을 긁어에 의해 방출된다. 슬라이드 (D) 주민 혈구. (E, F)의 모든 거주자의 혈구 세포가 해제 될 때까지 긁어 과정이 반복된다. 그대로 림프 글 랜드를 포함하는 애벌레 시체가 남아있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52733/52733fig2highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 그림 3. ImageJ에를 사용하여 혈구 세포의 정량을 자동화. (A는, B) ImageJ에에서 혈구 이미지 파일을 연 후, 하한 임계 레벨은 이미지의 모든 셀을 고려하여 조정된다. (C, D) 입자는 셀 픽셀 크기, 원형, 그 결과 판독 설정 요구 분석 형식 (예를 들어, 오버레이 개요). (E) 혈구의 수를 표시하는 요약 창. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52733/52733fig3highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52733/52733fig4highres.jpg" width="700" /> 그림 4. 대표 결과 (1). 혈구 번호 위에 상주 상태<html> 애벌레 개발의 과정. (A)를 사용 애벌레 단계의 개요; 1 차 령 (48 시간의 AEL; ~ 1.2 mm의 길이); 2 차 령 (80 시간의 AEL 2.5 mm의 길이); 3 차 령 (96 시간 AEL; ~ 3.5 mm의 길이). 유전자형은 HML Δ-GAL4, UAS-GFP이다 그는-GAL4. 단계가 애벌레 mouthhooks를 평가하여 확인 하였다. 각각의 애벌레 단계에서 순환 및 주민 혈구 번호 (B) 바 다이어그램. 혈구 순환 (C) 비율입니다. 순환 혈구 세포의 비율이 애벌레 개발의 과정을 통해 불균형이 증가합니다. (D) 총 혈구 세포를, 유충 당 순환과 주민 혈구의 합으로 인한. 혈구는 블리드 / 쳤어요 방법을 사용하여 정량 하였다 N ≥ 6 유충 / 조건은, 오차 막대는 표준 편차, 3 독립적 인 복제 실험에서 확인 된 결과를 보여줍니다.JPG &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52733/52733fig5highres.jpg" width="700" /> 그림 5. 대표 결과 (2). 혈구 기숙사에 기계적인 교란의 효과. (AC) 전 45 분 복구 한 다음 유리 구슬과 텍싱 후 유충의 예 () 아니오 방해 제어 할 수 있습니다.; 혈구 세포는 조혈 주머니에 지역화 (B) 혼란 혈구 패턴을 0 분에서 유리 구슬과 물 현탁액에 유충을 텍싱 후 복구 후 장애의 45 분의 (C) 혈구 패턴..; 많은 혈구 세포는 조혈 포켓에 이전했다; 확대 등의 혈관 관련 클러스터와 초 후 방해 축적 (화살표)의 지배적 인 위치이다 등의 줄무늬를 확인합니다. 유전자형은 HML Δ-GAL4, UAS-GFP입니다; 그는-GAL4의 X YW. 블리드 / 긁 방법에 의해 정량화 혈구 순환 (D) 비율입니다. (E) 총 혈구, 유충 당 순환과 주민 혈구의 합으로 인한. N ≥ 4 유충 / 조건은, 오차 막대는 표준 편차, 3 독립적 인 복제 실험에서 확인 된 결과를 보여줍니다. 학생의 t- 테스트가 의미를 확인하기 위해, NS (중요하지), ** (0.05 ≤ P), ** (0.01 ≤ P)는. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52733/52733fig5highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

의 시금 혈액 세포 집단<em&gt; 초파리</em&gt; 유충

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

12.3K 조회수.  University of California San Francisco. Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

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Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize mammalian adaptive immunity. Drosophila and mammalian hematopoiesis occur in spatially and temporally distinct phases to produce several blood cell lineages. Both systems maintain reservoirs of blood cell progenitors with which to expand or replace mature lineages. The hematopoietic system allows Drosophila and mammals to respond to and to adapt to immune challenges. Importantly, the transcriptional regulators and signaling pathways that control the generation, maintenance, and function of the hematopoietic system are conserved from flies to mammals. These similarities allow Drosophila to be used to genetically model hematopoietic development and disease.
Here we detail assays to examine the hematopoietic system of Drosophila larvae. In particular, we outline methods to measure blood cell numbers and concentration, visualize a specific mature lineage in vivo, and perform immunohistochemistry on blood cells in circulation and in the hematopoietic organ. These assays can reveal changes in gene expression and cellular processes including signaling, survival, proliferation, and differentiation and can be used to investigate a variety of questions concerning hematopoiesis. Combined with the genetic tools available in Drosophila, these assays can be used to evaluate the hematopoietic system upon defined genetic alterations. While not specifically outlined here, these assays can also be used to examine the effect of environmental alterations, such as infection or diet, on the hematopoietic system.

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Drosophila and mammalian hematopoietic systems share many common features, making Drosophila an attractive genetic model to study hematopoiesis. Here we demonstrate dissection and mounting of the major larval hematopoietic organ for immunohistochemistry. We also describe methods to assay various larval hematopoietic compartments including circulating hemocytes and sessile crystal cells.

방법은 림프 글 랜드와 혈구 세포에서를 검사합니다<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

연구

발생학

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

의 애벌레 먹이 회로의 기능적 분석 초파리</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

신경과학

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or complete loss of viability at different stages of development. Our lab has developed a method to assess viability in Drosophila from embryo to fully mature adult. The method relies on quantifying the number of progeny present at different stages during development, starting with hatched embryos. After embryos have been quantified, additional stages are counted, including L1/L2, pupae, and mature adults. After all stages have been examined, a statistical analysis such as the chi-square test is used to determine if there is a significant difference between the starting number of progeny (hatched embryos) and later stages culminating in the observed number of adults, thus rejecting or accepting the null hypothesis (that the number of hatched embryos will be equal to the number of larvae, pupae, and adults recorded throughout the stages of development). The primary advantage of this assay is its simplicity and accuracy, as it does not require an embryo rinse to transfer them to the food vial, avoiding losses from technical errors. Although the protocol described here does not directly examine L2/L3 larvae, additional steps can be added to account for these. Comparing the number of hatched embryos, L1, pupae, and adults can help determine if viability was compromised during the L2/L3 stages for further studies (the use of colored food helps with visual identification of larvae). Overall, this method can help Drosophila researchers and educators determine when viability is compromised during the fly life cycle. Routine assessment of stocks using this assay can prevent accumulation of secondary mutations that may affect the phenotype of the originally isolated mutant, especially if the original mutations affect fitness. For this reason, our lab maintains multiple copies of each of our Dm ime4 alleles and routinely checks the purity of each stock with this method in addition to other molecular analyses.&#160;

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

This protocol is designed to assess the viability of Drosophila at every developmental stage, from embryo to adult. The method can be used to determine and compare the viability of different genotypes or growth conditions.

초적혈구 멜라노가스터의생존능력을 배아에서 성인으로 평가하는 직접적이고 간단한 방법

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

생물학

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

초파리 멜라노가스터의 혈액-뇌 장벽 무결성에 대한 분석

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the goal of this protocol is to develop a method to visualize the pathogen invasion in a specific immune compartment of flies, namely hemocytes. Using the method presented here, up to 3 &#215; 106 live hemocytes can be obtained from 200 Drosophila 3rd instar larvae in 30 min for ex vivo infection. Alternatively, hemocytes can be infected in vivo through injection of 3rd instar larvae followed by hemocyte extraction up to 24 h post-infection. These infected primary cells were fixed, stained, and imaged using confocal microscopy. Then, 3D representations were generated from the images to definitively show pathogen invasion. Additionally, high-quality RNA for qRT-PCR can be obtained for the detection of pathogen mRNA following infection, and sufficient protein can be extracted from these cells for Western blot analysis. Taken together, we present a method for definite reconciliation of pathogen invasion and confirmation of infection using bacterial and viral pathogen types and an efficient method for hemocyte extraction to obtain enough live hemocytes from Drosophila larvae for ex vivo and in vivo infection experiments.

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

This method demonstrates how to visualize pathogen invasion into insect cells with three-dimensional (3D) models. Hemocytes from Drosophila larvae were infected with viral or bacterial pathogens, either ex vivo or in vivo. Infected hemocytes were then fixed and stained for imaging with a confocal microscope and subsequent 3D cellular reconstruction.

미생물 감염 및 분석에 대 한 초파리 melanogaster 애벌레에서 Hemocytes의 추출

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

면역학 및 감염병학

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are the main branches of innate immunity, and many of the factors regulating these responses are evolutionarily conserved between invertebrates and mammals. Phagocytosis, the central component of cellular innate immunity, is carried out by specialized blood cells of the immune system. The fruit fly, Drosophila melanogaster, has emerged as a powerful genetic model to investigate the molecular mechanisms and physiological impacts of phagocytosis in whole animals. Here we demonstrate an injection-based in vivo phagocytosis assay to quantify the particle uptake and destruction by Drosophila blood cells, hemocytes. The procedure allows researchers to precisely control the particle concentration and dose, making it possible to obtain highly reproducible results in a short amount of time. The experiment is quantitative, easy to perform, and can be applied to screen for host factors that influence pathogen recognition, uptake, and clearance.

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo phagocytosis assay in adult Drosophila melanogaster to quantify phagocyte recognition and clearance of microbial infections.

과일 파리, 초파리 melanogaster에 비보 먹어서 분석 결과 사용 하 여의 세포 면역 반응 평가

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Flow cytometry has been widely used to obtain information about DNA content in a population of cells, to infer relative percentages in different cell cycle phases. This technique has been successfully extended to the mitotic tissues of the model organism Drosophila melanogaster for genetic studies of cell cycle regulation in vivo. When coupled with cell-type specific fluorescent protein expression and genetic manipulations, one can obtain detailed information about effects on cell number, cell size and cell cycle phasing in vivo. However this live-cell method has relied on the use of the cell permeable Hoechst 33342 DNA-intercalating dye, limiting users to flow cytometers equipped with a UV laser. We have modified this protocol to use a newer live-cell DNA dye, Vybrant DyeCycle Violet, compatible with the more common violet 405nm laser. The protocol presented here allows for efficient cell cycle analysis coupled with cell type, relative cell size and cell number information, in a variety of Drosophila tissues. This protocol extends the useful cell cycle analysis technique for live Drosophila tissues to a small benchtop analyzer, the Attune Acoustic Focusing Cytometer, which can be run and maintained on a single-lab scale.

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

A protocol for cell cycle analysis of live Drosophila tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer is described. This protocol simultaneously provides information about relative cell size, cell number, DNA content and cell type via lineage tracing or tissue specific expression of fluorescent proteins in vivo.

라이브 세포주기 분석<em&gt; 초파리</em조율 어쿠스틱 초점 cytometer에와 Vybrant DyeCycle 바이올렛 DNA 얼룩을 사용하여&gt; 조직

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to recognize a wide range of particles and destroy microbial pathogens. As organisms age, this process begins to decline, yet little is known about the underlying mechanisms or the genetic basis of immunosenescence. Here, an injection based in vivo phagocytosis assay is used to assess age related changes in different aspects of phagocytosis, such as binding, engulfment, and degradation of internalized particles, by quantifying phagocytic events in hemocytes in adult Drosophila. Drosophila melanogaster has become an ideal model to investigate age related changes in innate immune function for many reasons. For one, many genetic components and functions of the innate immune response, including phagocytosis, are evolutionarily conserved between Drosophila and mammals. Because of that, results obtained from using this protocol are likely to be widely relevant to understanding the age related changes in immune function in a variety of organisms. Additionally, we note that this method provides quantitative estimates of hemocyte phagocytic ability, which could be useful for a variety of research topics, and need not be limited to studies of aging.

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo assay of phagocytosis used to assess and quantify the ability of young and aged Drosophila melanogaster hemocytes to phagocytose bacteria.

인 비보 식세포 분석기를 사용하여 성인 Drosophila 멜라노가스터 혈구의 연령별 식세포 능력 평가

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to ...

Cuticle Disruption: A Method to Collect Hemolymph from Drosophila Larvae

Source: Reimels, T. A. and Pfleger, C. M. <a href="https://www.jove.com/video/54544/" target="_blank">Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae</a>. J. Vis. Exp. (2016).
The Drosophila hemolymph serves as both blood and interstitial fluid, circulating throughout the body during the larva and adult stages. This video describes a protocol to collect larval hemolymph in order to quantify the circulating cells.

큐티클 파괴: 초파리 유충에서 혈림프를 수집하는 방법

Source: Reimels, T. A. and Pfleger, C. M. Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (2016).
The Drosophila ...

의 시금 혈액 세포 집단

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방법은 림프 글 랜드와 혈구 세포에서를 검사합니다

의 애벌레 먹이 회로의 기능적 분석 초파리