이 프로토콜은 수지상 식목의 분기 역학을 정량화하고 라이브 타임 랩스 이미징 및 3D 이미지 기여 소프트웨어를 사용하여 뉴런을 개발하는 새로운 접근 방식을 제공합니다. 이 기술은 수지상 filopodia의 동적 동작을 측정하기 위한 빠르고 효율적인 방법을 제공하는 분기 단자 이미지를 추적하고 추적합니다. 이 방법을 이용한 연구는 개발 및 활동이 어떻게 말단 형태 발생을 조절하는지 이해하는 통찰력을 제공합니다.
우리의 방법은 시험관 내 및 생체 내 설정 모두에서 드물게 표지 된 뉴런에 적용 할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때 충분한 시간적 및 공간 해상도를 달성하기 위해 이미징 매개 변수를 신중하게 조정해야 합니다. 애벌레 drosophila에서 두뇌를 수확하기 위해, 해부 현미경에서 1 쌍의 표준 팁 해부 집게를 사용하여 다른 한 쌍을 조심스럽게 뇌를 해부하는 동안 애벌레 표본을 제자리에 고정하고 눈 디스크, 뇌 엽 및 복부 신경 코드를 보존하십시오.
그런 다음 부착 된 근육을 제거하여 이미징 중에 샘플의 움직임을 최소화하십시오. 모든 뇌가 수확되면 진공 그리스를 사용하여 사각형 챔버를 유리 슬라이드에 끌어당기고 챔버에 외부 식염수 용액 20 마이크로리터를 추가하십시오. 집게를 사용하여 뇌를 챔버로 옮기고 현미경으로 뇌의 위치를 조정합니다.
유리 커버 슬립으로 챔버를 덮고 커버 슬립을 부드럽게 눌러 이미징 시술 중에 샘플 표류를 줄입니다. 개별적으로 표지된 뉴런을 포함하는 뇌 박종을 식별하려면 해부 에서 30 분 이내에 40X 물 침지 목표와 상피 광원을 선택합니다. 920 나노미터와 비 Dscan 검출기로 조정된 두 개의 광자 레이저를 선택하고 이미징 매개 변수를 프레임당 512픽셀, Z 스택당 1분으로 10분 동안 수집하도록 설정합니다.
그런 다음 광학 및 디지털 줌을 조정하여 충분한 X, Y, Z 해상도를 달성하면서 1분 이내에 전체 수지상 식소의 커버리지를 보장합니다. 설정은 0.25 마이크로미터에 0.11 x 0.11x0.11의 일반적인 X, Y, Z 해상도로 이미지를 생성합니다. 드리프트 보정의 경우 적합한 드리프트 보정 소프트웨어 프로그램에 대한 관심 파일을 열고 미세 매개 변수 편집및 편집을 클릭합니다.
두 개의 광자 옵션이 있는 경우 현미경 유형을 와이드 필드로 설정하고 소프트웨어에 정의된 워크플로우를 따릅니다. 디포온볼루션의 경우 드리프트 수정 된 이미지를 디온 볼루션 소프트웨어에서 열고 워크플로를 따릅니다. 그런 다음 4D 데이터를 분석하고 이미지 내에서 정의된 스팟의 공간 좌표를 보고할 수 있는 후속 이미지 기여 소프트웨어에 의해 지원되는 파일 유형으로 deconvolved 이미지를 저장합니다.
이미지 음표의 경우 이미지 기여 소프트웨어에서 deconvolved 이미지를 열고 3D의 모든 시간 지점에서 분기 팁을 검사하고 표시합니다. 이미지 어음 소프트웨어는 표시된 분기 팁의 공간 및 측두측 좌표를 보고하고 저장합니다. 후속 계산을 위해 좌표 정보를 CSV 파일로 내보냅니다.
스팟 모듈에서 자동 생성 건너뛰기를 클릭하고 수동으로 편집하고 선택한 스팟 확인란에 자동 연결을 선택합니다. 타임라인 시리즈의 프레임을 검토하고 성임에 대한 분기를 선택합니다. Shift 키를 잡고 분기 터미널 끝을 클릭하여 스팟을 추가합니다.
그런 다음 통계 탭을 클릭하고 상세, 특정 값 및 위치를 선택합니다. 기록된 공간 및 측두구 좌표 정보가 표시됩니다. 저장을 클릭하여 데이터를 CSV 파일로 내보냅니다.
분기 팁 배치를 3D로 계산하려면 CSV 파일을 스프레드시트로 열고 트랙 ID 열을 선택합니다. 가장 작은 정렬을 최대로 클릭하고 선택 확장을 수락합니다. 정렬 후 Track ID는 각 고유 수지상 분기를 식별하고 동일한 분기의 반점이 동일한 트랙 ID를 공유합니다.시간 열은 서로 다른 시간 프레임의 정보를 저장합니다.
스프레드시트에서 거리 열을 추가하고 좌표를 사용하여 두 개의 시간적으로 인접한 반점의 거리를 계산합니다. 단일 복셀 수준에서 사소한 움직임을 측정하려면 0.3 마이크로미터보다 작은 모든 거리 값을 재설정하여 수정되지 않은 드리프트 또는 불완전한 이미지 음표가 필터링됩니다. 다음으로 변위 열을 만들고 거리 열에서 변위 열에 대한 값을 복사합니다.
각 분기 팁에 대한 확장 및 철회 이벤트를 수동으로 할당합니다. 확장인 경우 양수 변위 값을 변경하지 않습니다. 철회인 경우 해당 변위 값을 음수 값으로 변경합니다.
그런 다음 새 이벤트 열에서 개별 확장 및 철회 이벤트에 대한 변위 값을 합산합니다. 이 비디오에서는 대표자 개별적으로 표지된 복부 측면 뉴런으로부터 수집된 최대 강도 투영 이미지 시리즈를 관찰할 수 있다. 단일 프레임 이미지를 사용하면 철회 및 확장 이벤트를 평가할 수 있습니다.
분기 단말의 반자동 4D 추적은 입증된 바와 같이 개별적으로 표지된 복부 측량 뉴런의 동적 분기 단말의 음표를 허용합니다. 각 시점에서 분기 운동의 방향과 거리를 계산하면 서로 다른 발달 단계에서 개별적으로 표지된 복부 측면 뉴런에 대한 수지상 분기 역학을 비교할 수 있습니다. 가장 중요한 단계는 해부 및 장착 하는 동안 뇌 조직 및 선장 모르폴로의 무결성을 보존 하는.
원시 이미지 시리즈 품질은 성공적인 추적 및 정량화에도 중요합니다. 이 기술을 사용하여 우리는 drosophila 중앙 뉴런을 개발하는 데 있는 선점 성 필로포디아의 정량적 분석을 수행하고 침순 성숙과 시냅토 발생과 관련된 분자 기계를 탐구하는 능력을 얻었습니다.
