The authors thank David Larson for developing the original protocol for imaging the live Drosophila pupal eye. We thank our colleagues Richard Carthew, Shoichiro Tsukita and Matthew Freeman, who developed the transgenic flies that we combined to generate our live-imaging fly lines. Brittany Baldwin-Hunter gave helpful comments on the manuscript. This work was supported by start-up funds awarded to Ruth Johnson by Wesleyan University.

그림 3은 실험 절차의 요약을 보여줍니다. 1. 조직 준비 <ol><li> C를 중복에 다음 십자가를 설정 관심의 유전자의 변형 된 표현의 결과를 결정하고 25 °로 유지하려면 UAS - 유전자 (수컷) X는 GMR-GAL4; UAS-α-고양이 : GFP, UBI-DE-의 CAD : GFP; + / SM5-TM6b (처녀 여성) 참고 : 제어 조직 크로스 UAS-의 lacZ를 얻으려면이 GMR-GAL4에 수컷; UAS-α-고양이 : GFP, UBI-DE-의 CAD : GFP 여성. β - 갈 락토시다 아제는 망막 세포의 행동에 결함을 생성하지 않습니다. </li><li> 의 RNAi 유전자의 효능을 향상시키기 위해 크로스 UAS-의 RNAi는 GMR-GAL4, UAS-DCR-2 수컷; UAS-α-고양이 : GFP, UBI-DE-의 CAD : GFP; + / SM5-TM6b 처녀 여성. 주 : 이소성 DCR-2 발현이 관찰되었다 망막 세포 거동이 이따금 결함 (데이타 미기재). 각성이 방법을 사용하면 좋습니다. </li><li> 에스1.5 ml의 마이크로 원심 튜브 당선자 흰색 해당 유전자형의 사전 번데기 및 장소. 번데기가 DCR-2를 표현하는 경우, 남성 또는 여성 중 번데기를 선택 UAS-DCR-2, X 염색체에 삽입,의 발현은 남성에 강하다. 번데기는 번데기 경우의 색소 침착 전에 0 시간 APF에서 성별화해야한다 - 남성의 생식기는 번데기 (후방에서 약 3 분의 1)의 측면에 큰 투명 글로브로 볼 수 있습니다. </li><li> 25 ° C에서 깨끗한 플라스틱 팁 상자에 번데기를 포함하는 마이크로 원심 튜브를 품어. 번데기 장소의 팁 상자에 증류수에 담가 조직의 10cm 2 조각, 탈수를 방지합니다. 참고 : 팁 상자에 습도가 너무 높아지면 번데기 경우 다음 단계에서 해부하는 기운이 어려운 경우가 있습니다. </li><li> 적절한 시간 동안 품어. 약 17 시간 APF, 20 시간의 APF 또는 24 시간 AP에서 이미징을위한 번데기를 준비, 눈을 패터닝과 관련된 세포의 행동을 캡처하려면F.은 특정 세포의 행동이 최선 관찰하는 경우에 대한 자세한 논의는 대표 결과를 참조하십시오. </li><li> 검은 실 가드 해부 접시에 신선한 양면 테이프의 조각을 놓습니다. 양면 테이프 (그림 1A)에 부착 된 번데기의 머리 위로 번데기, 등쪽의 위치를 .Try는 양면 테이프로 번데기의 흉부와 복부를 준수하지. 핀셋으로 조심스럽게 들어 올려 번데기 머리를 노출 아가미를 제거합니다. 한쪽 눈 주위를 노출 번데기 케이스의 측면을 따라 눈물. </li><li> 조심스럽게 접착 테이프에서 번데기를 제거합니다. 번데기가 부착 남아 있으면 접착력을 약화 번데기 케이스와 테이프 사이의 접합에 증류수의 작은 볼륨을 적용합니다. </li></ol> 2. 장착 <ol><li> 압지에서 작은 15mm 2 프레임을 구축하고 middlethat에 구멍을 펀치 직경 5.5 mm (그림 1B)입니다. 증류수와 장소에 담가현미경 슬라이드의 중심. 바셀린의 균일 한 반지를 집어 넣은, 30 CC 주사기를 사용하면 압지 프레임을 둘러싸는. 석유 젤리 링이 번데기의 폭보다 링의 직경이 커버 슬립의 폭보다 변두리에 작은 그 변두리에 더 높은 있는지 확인합니다. </li><li> 석유 젤리 비드 (그림 1D)에서 지원하는 측면에서, .Carefully 번데기를 준비 압지 (그림 1C)에 펀치 구멍에 직접 슬라이드에 석유 젤리의 작은 구슬을 추가합니다. </li><li> 석유 젤리 링의 상단에 커버 슬립을 놓고는 접촉 눈 neuroepithelium (그림 1D) 위의 상피 있도록. 부드럽게 바셀린 대해 커버 슬립을 밀봉하고 번데기 눈 영역 및 커버 슬립 사이에 작은 편평한 접촉 표면을 생성하는 제제를 압축. </li></ol> 3. 형광 이미징 <ol><li> 이미지를 사용하여 번데기 준비형광 현미경. 모든 7 분 캡처 adherens 접합의 지역에서 눈 neuroepithelium의 꼭대기의 도메인을 통해 시리얼 섹션. 참고 :) 적절한 직렬 섹션은 보통 4-5 0.2 μm의 Z-단계로 구성 Z-스택 당이다. b)는 가벼운 충돌과 주름을 포함하여 상피 세포의 토폴로지에서 부정, 조직의 큰 영역에 초점 이미지를 수집하는 것이 도전 할 수 있습니다. 촬상 동안, 하나의 초점으로 관심 영역의 부분을 찾을 수 있으며, 이웃 영역 포커스 아웃한다. 번데기 눈 및 커버 슬립 사이에 증류수 작은 액 적을 포함하면 번데기 눈 형태 형성의 초기 단계의 약간 고르지 토폴로지 특성 일부 급성 티슈하지만 주름을 제거 할 수 없다. 이러한 경우에는 합초 슬라이스는 전체 필드에 대해 획득 될 때까지 스택 Z를 확장하여 조직을 오버 샘플링. C) 매 7 분 상당한 redu없이 3 시간 4 라이브 이미징을 사용하도록 설정해야합니다 시리얼 부분을 캡처이미지 품질을 손상시킬 수 GFP 형광의 강도 ction의. 짧은 시간 구간은 영상의 총 시간을 감소시킬 수도있다. </li><li> 3 ~ 4 시간 동안 영상을 계속합니다. 번데기 성장과 체액의 펌핑 망막의 위치를​​ 이동하기 때문에 많은 형광 현미경에 사용할 수있는 자동 초점 및 시간 기능을 사용하지 마십시오 경계 다시 초점을 맞추고 매 14 ~ 21 분 필요합니다. 느리게하거나 눈의 형태 형성을 멈출 수 4시간 넘어 그 영상을 참고. </li><li> 배경을 줄이고 직렬 단면 영상의 콘트라스트를 향상시키기 위해 적절한 컨벌루션 소프트웨어를 사용한다. 각각의 Z-스택 파일의 경우, (재료의 표 참조) LAS AF 소프트웨어에서 다음을 수행 도구 패널로 이동, 3D 역대을 선택하고 적용을 클릭합니다. </li><li> 각 deconvoluted 스택 파일의 최대 투사 (MP) 이미지 생성 도구 패널로 이동, 3D 프로젝션을 선택하고 적용을 클릭합니다. 참고 : 최대 투사 알고리즘이 유니폼을 생성하는 데 실패 할 수오버 샘플링 된 조직에 대한 LY 포커스에있는 이미지입니다. - 초점 영역을 선명하게하는 기술 단계 5.2에 설명되어있다. </li></ol> 4. 번데기 구조 및 표현형 확인을 포스트 - 이미징 <ol><li> 집게가 커버 슬립을 제거하고 음식을 깨끗한 유리 병에 번데기를 전송하여 : 아티팩트가 도입 또는 이미징 동안 피해 번데기가 조심스럽게 이미징 장비에서 번데기를 제거되었는지를 해결하기 위해. 실온에서 보관 또는 25 ° C 성인 플라이가 나올 때까지. </li><li> 조심스럽게 성인 눈의 표현형을 조사하고 원래 플라이 십자가에서 신흥 성인 파리의 눈에 비교합니다. </li></ol> 5. 이미지 처리 <ol><li> 자동 이미지 정렬 : 참고 : 라이브 초파리 조직은 이동 및 촬영 과정을 통해 성장할 것입니다. 따라서, 이미지 센터는 초파리 조직에서 동일한 지점에 대응하지 않을 수도 연속 시점에서 모였다. 또한에서전체 망막 디스크는 21 ~ 23 시간의 APF 사이에 약 30 ° 회전합니다. 개별 셀 동작을 선택하고 생명체의 성장으로 인한 산만 함을 줄이고,이 수동으로 수행 할 수있는 각 MP image.While, 여기에 사용되는 이미지 편집 소프트웨어를 정렬하려면 프로세스를 신속하게 처리 할 수 있습니다 내장 된 알고리즘을하고있다 (재료의 표 참조). <ol><li> 스택에 메인 메뉴를 열고 스크립트로드를 선택 파일의 파일 탭에서. </li><li> 로드 레이어 패널에 MP 이미지 파일을 가져 오기하고 [확인]을 선택합니다. 자동으로 소스 이미지 옵션을 맞 춥니 다하려는 시도가 선택되지 않았는지 확인합니다. 주 :이 옵션을 선택하면, 소프트웨어는 이미지 데이터를 왜곡 정렬 알고리즘을 이용할 수도있다. </li><li> 모든 MP 파일은 레이어 창에로드 한 후, 모든 이미지는 최초의 시점은 레이어 스택의 상단에되도록 시간 순서에 있는지 확인하십시오. 층은 올바른 순서, 드래그에없는 그들이 정렬 될 때까지 놓는 경우올바르게. </li><li> 메인 메뉴의 편집 탭에서 자동 정렬 레이어를 선택합니다. 들어 오도록을 선택하고 확인을 클릭합니다. </li><li> 자동 정렬 알고리즘은 해당 초점에 프레임 방향을 실패 할 경우, 이동 도구를 사용하여 약간의 조정을합니다. </li></ol></li><li> 복합 선명 : 참고 : 초기 MP 이미지의 포커스 아웃 영역은 &#39;자르기&#39;LAS AF 소프트웨어에 해당 deconvoluted 스택에 의해 날카롭게 할 수 있습니다. 스택 파일 자르기 한 수동 최대 투영 알고리즘을 실시 Z 스택의 간격을 제한 할 수있다. <ol><li> (프로세스 탭 아래) 도구 패널에서 자르기 기능을 찾습니다. 수동 그들이 초기 포커스 아웃 영역 내에서만 부착 벨트 스팬되도록 초기 및 최종 슬라이스를 제한. 이 지역에 최적화 된 새로운 스택 파일을 생성 적용을 클릭합니다. </li><li> TIFF 파일로 로컬에 최적화 된 스택 및 수출을위한 새로운 최대 투사를 생성합니다. </li><li> 일에전자 이미지 편집 소프트웨어 (재료의 표 참조), 스택에 (메인 메뉴의 파일 탭에 위치) 오픈 스크립트로드를 선택 파일. </li><li> 로드 레이어 패널에 특정 시점의 초기 MP 이미지 파일을 로컬에 최적화 된 MP 파일을 가져하고 [확인]을 선택합니다. 자동으로 소스 이미지 옵션을 맞 춥니 다하려는 시도가 선택되지 않았는지 확인합니다. </li><li> 창 레이어의 두 레이어를 선택하고 균일 망막 분야에 초점을 맞 춥니 산출, 자동으로 두 이미지의 해당 영역을 마스크 (메인 메뉴의 편집 탭에 위치) 자동 혼합 레이어를 선택합니다. TIFF 파일로이 합성 이미지를 저장합니다. </li><li> 반복하여 모든 차선 MP 이미지에 대한 5.2.5을 통해 5.2.1 단계를 반복합니다. </li></ol></li><li> 또한 조정 : 회전, 자르기 및 조정 동영상 레이어의 레벨 : <ol><li> 모든 레이어를 선택한 상태 망막의 지느러미 - 복부 축이 정렬되도록 이미지를 회전 변환 도구 (편집&gt; 자유 변형)을 사용하여동영상 프레임의 Y 축에 관한 것이다. </li><li> 필요한 경우, 원하는 크기와 형상으로 시야를 감소시키기 자르기 도구를 사용한다. </li><li> 세포막과 전지 본체 사이에 콘트라스트를 향상시킬 수 있도록 (각 프레임의) 레벨 조정을 사용한다. </li><li> 문체의 목적을 위해 각 프레임에 대한 관심의 포인트를 강조하기 위해 거짓 컬러를 도입, 특정 세포의 행동을 강조하는. </li></ol></li><li> 애니메이션 : 동영상으로 이미지를 변환 : <ol><li> 메인 메뉴의 윈도우 탭에서 애니메이션 창을 엽니 다. 애니메이션 창의 오른쪽 상단 모서리에있는 메뉴에서 레이어에서 프레임 만들기를 선택합니다. </li><li> 층 스택의 바닥부터 시작하여 순차적으로 애니메이션 창에 추가되어 있습니다. 먼저 모든 프레임을 선택하고 애니메이션 창 메뉴에서 역방향 프레임을 선택, 프레임의 순서를 반대로합니다. </li><li> 엄지 아래 프레임 드롭 다운 메뉴를 사용하여 각 프레임에 대한 프레임 지연 시간을 선택손톱. 참고 : (1) 본 논문에서는 4 영화의 프레임 지연은 0.8 초이다. </li><li> 주 메뉴를 열고 수출의 파일 탭에서 비디오 렌더링을 선택합니다. 파일 옵션에서 QuickTime 내보내기를 선택하고 원하는 비디오 형식을 선택합니다. 옵션 정의에 프레임 속도를 설정 렌더링에서, 15의 프레임 속도를 입력하고 렌더링을 클릭합니다. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+cell-cell+adherens+junctions+reveals+that+Drosophila+mesoderm+invagination+begins+with+two+phases+of+apical+constriction+of+cells.">Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells.</a> J. Cell. Sci. 114, 493-501 (2001).</li><li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+features+of+adherens+junctions+during+Drosophila+embryonic+epithelial+morphogenesis+revealed+by+a+Dalpha-catenin-GFP+fusion+protein.">Dynamic features of adherens junctions during Drosophila embryonic epithelial morphogenesis revealed by a Dalpha-catenin-GFP fusion protein.</a> Dev. Genes Evol. 209, 218-225 (1999).</li><li>Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reiterative+use+of+the+EGF+receptor+triggers+differentiation+of+all+cell+types+in+the+Drosophila+eye.">Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye.</a> Cell. 87, 651-660 (1996).</li><li>Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+specification+in+the+developing+Drosophila.+retina.">Cell fate specification in the developing Drosophila. retina.</a> Dev Suppl. , 19 (1993).</li><li>Wolff, T., Ready, D. F., Bate, M., Arias, A. 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Biol. 380, 1-11 (2013).</li><li>Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+wingless+in+an+early+pupal+cell+death+event+that+contributes+to+patterning+the+Drosophila+eye.">A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye.</a> Mech. Dev. 121, 1523-1530 (2004).</li><li>Larson, D. E., Johnson, R. I., Swat, M., Cordero, J. B., Glazier, J. A., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+simulation+of+cellular+patterning+within+the+Drosophila+pupal+eye.">Computer simulation of cellular patterning within the Drosophila pupal eye.</a> PLoS Comput. Biol. 6, e1000841 (2010).</li><li>Cagan, R. L., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+order+in+the+Drosophila+pupal+retina.">The emergence of order in the Drosophila pupal retina.</a> Dev. Biol. 136, 346-362 (1989).</li><li>Cagan, R. L., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+is+required+for+successive+cell+decisions+in+the+developing+Drosophila+retina.">Notch is required for successive cell decisions in the developing Drosophila retina.</a> Genes Dev. 1099, 1112 (1989).</li><li>Miller, D. T., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+induction+of+patterning+and+programmed+cell+death+in+the+developing+Drosophila+retina.">Local induction of patterning and programmed cell death in the developing Drosophila retina.</a> Development. 125, 2327-2335 (1998).</li><li>Sawamoto, K., Okano, H., Kobayakawa, Y., Hayashi, S., Mikoshiba, K., Tanimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+argos+in+regulating+cell+fate+decisions+during+Drosophila+eye+and+wing+vein+development.">The function of argos in regulating cell fate decisions during Drosophila eye and wing vein development.</a> Dev. Biol. 164, 267-276 (1994).</li><li>Yu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pathway+of+signals+regulating+effector+and+initiator+caspases+in+the+developing+Drosophila+eye.">A pathway of signals regulating effector and initiator caspases in the developing Drosophila eye.</a> Development. 129, 3269-3278 (2002).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+tugging+force+regulates+the+size+of+cell-cell+junctions.">Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 9944-9949 (2010).</li><li>Miyake, Y., Inoue, N., Nishimura, K., Kinoshita, N., Hosoya, H., Yonemura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actomyosin+tension+is+required+for+correct+recruitment+of+adherens+junction+components+and+zonula+occludens+formation.">Actomyosin tension is required for correct recruitment of adherens junction components and zonula occludens formation.</a> Exp. Cell Res. 312, 1637-1650 (2006).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

야생형 개발 위의 설명은 RNAi의 패터닝에서 이벤트 또는 과발현 유전자형의 비교를위한 기초를 형성한다. 세포의 행동이 관심의 단백질에 의해 조절되는 정확하게 결정할 때 라이브 조직 개발의 비교는 매우 중요하다. 또한, 설명을 생략하고, 생균 촬상 한 그 패턴 눈 이벤트에 관심 유전자의 역할을 정 성적 및 / 또는 정량적으로 설명을 할 수있다. 30 ~ 32 시간의 APF으로 대부분의 색소 세포가 안?...

화합물 초파리의 눈은 액세서리 색소 세포 4,5의 벌집 격자로 구분하여 그 ~ 750 ommatidia, 개안의 틀에 박힌 배열을 특징으로한다. 로컬 셀 움직임 세포 성장, 세포 형상의 변화, 세포 사멸 이러한 색소 세포는 이벤트 코디 조합에 의해 패터닝된다. 이 상피 세포의 실시간 시각화 하나는 생리 학적으로 적절하고 교란 입체 맥락에서 이러한 이벤트를 뒷받침하는 분자 메커니즘을 연구 할 수 있습니다. 이전의 프로토콜 -6,7- 대조적으로, 여기에 설명 된 기술들은 화상 형성 공정에서 커플 해제 할 수없는 불필요한 조직의 움직임을 안정화시키기위한 효율적인 방법을 포함한다. 영상의 과정을 통해, 성장 회전하는 조직과 변화 -이 방법은 개발 초파리 번데기 눈 상피 세포 행동의 연구를 강화한다. 또한 모션 안정화 기술에서는 드여기에 스 크라이 빙 외부 이동되기 다른 상황에서 세포를 연구하는 데 유용 할 것입니다. 눈 특정 드라이버 GMR-GAL4 1-3의 통제하에 GFP : GFP뿐만 아니라 UAS-α-catenin의를 : 초파리 망막 분야에서 셀 경계를 시각화하기 위해 유전자 변형 플라이 라인은 UBI-DE-cadherin의 발현가 생성되었다. 두 GFP 태그가 막 마커의 사용은 낮은 강도의 빛 셀 경계의 시각화 수 있습니다. 이는 고 에너지의 파장에 반복 노출 활성화, 증가 된 프레임 레이트 및 동영상 구간에 조직 손상을 최소화하고 광표백. UAS-DCR-2는 제 2 플라이 라인 (8)에 통합되었다의 RNAi 유전자의 효능을 강화합니다. 이전의 프로토콜의 세 번째 업데이트에서는 실험실에서 가장 용이하게 조립된다 촬상 간단한 장비를 설명한다. 이 장치는 특수 촬상 R을 갖도록 요구를 미연에 방지IG는 대학의 &#39;기계 공장&#39;또는 이와 유사한 서비스에 의해 생성. 이 영상 장비는 이미지를 다른 번데기 조직 9, 10에 사용되는 것과 유사하다. 직접 17-42 시간 puparium 형성 HR (APF) ~ 후 안구로부터 패터닝에 기여 형태 발생 이벤트를 평가하기 위해 사용될 수있는 단순한 라이브 셀 이미징 프로토콜이 여기에 제시했다. 즉,이 프로토콜은 번데기 개발 중에 유전자 발현을 변경하는 결과를 결정하기 위해 하나를 가능하게한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="672">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:124px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="3" height="21" style="height:21px;">GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b</td>
			<td>Available on request from authors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="3" height="21" style="height:21px;">UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b&#160;</td>
			<td>Available on request from authors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Scotch double stick tape</td>
			<td style="width:124px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Black Sylgard dissection dish</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 h to polymerize</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Sylgard</td>
			<td style="width:124px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">SYLG184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Sylgard (Black)</td>
			<td style="width:124px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">SYLG170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Glass petri dish</td>
			<td style="width:124px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">7220-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">25 x 75 x 1 mm glass microscope slide</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-550-413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">22 x 40 mm glass coverslip</td>
			<td style="width:124px;">VWR</td>
			<td>48393-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Whatman 3mm Chromatography Paper</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">05-713-336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Vaseline</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">19-086-291</td>
			<td>Or purchase at local pharmacy.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">30ml syringe</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S7510-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Adobe Photoshop CS5</td>
			<td style="width:124px;">Adobe</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Leica TCS SP5 DM microscope</td>
			<td style="width:124px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software</td>
			<td style="width:124px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-imaging of the drosophila pupal eye

초파리 번데기 개발의 고유 프로세스는 이동 및 라이브 세포 이미징 동안 추적 개별 셀 동작을 어렵게 방법으로 눈의 상피 세포를 왜곡 할 수 있습니다. 이러한 프로세스는 다음과 같습니다 망막 회전, 세포의 성장과 생명체의 움직임을. 번데기가이 도전 하나의 초점면에서 몇 ommatidia, 개안 이상의 포커스에있는 이미지를 수집 할 수 있도록, 이미징을위한 준비로서 또한, 미묘한 범프 등 상피의 토폴로지, 불규칙 자주 소개 주름입니다. 워크 플로는 초파리 번데기 눈 개발하는 동안 세포 과정의 쉬운 분석을 가능하게 구제 여기 이러한 문제를 설명했다. 적절하게 준비된 번데기 용이 대부분 실험실에서 조립 될 수 촬상 장비에 배치되어 유비퀴틴 DE 카데 :. GFP와 GMR-GAL4 구동 형 UAS-α 카테닌 : GFP를 눈 상피 1 셀 경계를 시각화하는데 사용 -3입니다. 디컨 볼 루션은 후다중 초점면에서 촬영 된 형광 화상에 적용된 최대 투사 화상은 각 시점에 대해 생성 및 편집 소프트웨어를 사용하여 강화된다. 정렬 알고리즘은 추적 할 개별 셀의 동작은 더 쉽게, 빠르게 불필요한 움직임을 안정화하는 데 사용됩니다.

번데기 눈의 라이브 영상은 neuroepithelium의 패턴에 기여하는 세포의 행동을 관찰하는 성공적인 전략이다. 특정 단백질의 역할은 쉽게 눈 개발하는 동안 단백질 수준을 수정하여 유전자 발현을 평가할 수있다. 이 GMR-GAL4을 할 수있는 형태 형성 고랑 뒤에 유전자 발현을 구동하는 데 사용된다. 이것은 처음 두 령 유충 동안 눈 필드를 확립 이전 이벤트를 교란하지 않는 이점을 제공한다. 또한 ?...

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Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 번데기 눈

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

9.3K 조회수.  Wesleyan University. This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

비디오: Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

장기의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 아이 디스크

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

연구

발생학

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells named wing imaginal discs formed during embryonic development. In the larval stages the imaginal discs grow, increasing its number of cells and forming monolayered epithelial&#160;structures. Inside the pupal case, the imaginal discs bud out and fold into bilayers along a line that becomes the future margin of the wing. During this process, the longitudinal primodia veins originate vein cells on the prospective dorsal and ventral surfaces of the wing. During the pupal stage the stripes of vein cells of each surface communicate in order to generate tight tubes; at the same time, the cross-veins begin their formation.
With the help of appropriate molecular markers, it is possible to identify the major elements composing the wing during its development. For this reason, the ability to accurately detect transcripts or proteins in this structure is critical for studying their abundance and localization related to the development process of the wing.
The procedure described here focuses on manipulating pupal wings, providing detailed instructions on how to dissect the wing during the pupal stage. The dissection of pupal tissue is more difficult to perform than their counterparts in third instar larvae. This is why this approach was developed, to obtain rapid and efficient high quality samples. Details of how to immunostain and mount these wing samples, to allow the visualization of proteins or cell components, are provided in the protocol. With little expertise it is possible to collect 8-10 high quality pupal wings in a short amount of time.

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

The ability to accurately detect transcripts or proteins in Drosophila tissues is critical for studying their abundance and localization related to the development process. Here is the description of a straightforward procedure to dissect pupal wings. These wings can be used as samples in several techniques (immunohistochemistry, PCR assay, etc.).

번데기 날개 초파리 Immunodetections 또는 PCR 분석 실험에 적합의 해 부를 신속 하 고 효율적인 방법

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

마우스의 인간 골수 미세 환경의 생체 공학 및 실시간 영상화에 의한 시각화

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Mouse Secondary Palate Fusion의 라이브 이미징

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

해 부와 초파리 번데기 난소의 얼룩

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a reliable protocol for the dissection of the delicate Drosophila pupal retina. Our surgical approach utilizes readily-available microdissection tools to open pupae and precisely extract eye-brain complexes. These can be fixed, subjected to immunohistochemistry, and retinas then mounted onto microscope slides and imaged if the goal is to detect cellular or subcellular structures. Alternatively, unfixed retinas can be isolated from brain tissue, lysed in appropriate buffers and utilized for protein gel electrophoresis or mRNA extraction (to assess protein or gene expression, respectively). Significant practice and patience may be required to master the microdissection protocol described, but once mastered, the protocol enables relatively quick isolation of mainly undamaged retinas.

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

This paper presents a surgical method for dissecting Drosophila pupal retinas along with protocols for the processing of tissue for immunohistochemistry, western analysis, and RNA-extraction.&#160;

Immunohistochemistry, 서쪽 분석 및 RNA 격리에 대 한 초파리 번데기 망막의 해 부

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

초파리 배아에서 근육 수축의 라이브 이미징 및 분석

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

녹고, 경작, 그리고 초파리 셀 라인 Cryopreserving

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

푸팔 단계 동안 개발 초파리 에피텔리아에서 조직 방향 과 성장 역학의 이미징 및 분석

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

살아있는, 그대로 조직에서 세포 분열의 분석을 위한 초파리 애벌레와 Pupal 고환의 준비

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...