이 절차의 전반적인 목표는 메추라기와 닭 배아에서 배아 조직을 격리하기 위한 최적화된 실험적 접근법을 제시하는 것입니다. 이 기술을 사용하여 유전자 발현 연구 및 기능적 검사에 사용할 수 있는 순수한 배아 조직을 얻습니다. 메추라기와 닭 배아의 조직은 미세 수술에 의해 격리되고 생물학적 특성을 보존하면서 체외 효소 소화의 대상이됩니다.
격리 후, 3차원 보존 조직은 고해상도 지형 유전자 발현 패턴 분석에 사용될 수 있다. 이 접근법은 기존의 방법에 의해 달리 접근할 수 없는 배아 지역에서 시투 유전자 발현을 자세히 설명하는 데 특히 유용합니다. 또한, 전사 분석 접근법은 조직별 높은 처리량 오믹 분석을 제공하면서 유전 적 마커를 필요로하지 않고 격리 된 조직에 적용 될 수 있습니다.
대안적으로, 두 종에서 분리된 조직은 48시간 동안 체외 조직 분석에서 연관될 수 있다. 이 접근법은 메추라기와 닭 세포가 뚜렷한 핵 특징과 분자 마커에 의해 차별될 수 있기 때문에 조직 상호 작용을 연구할 수 있습니다. 장기를 형성하는 문화 조직의 용량은 ovo 분석에서 더 테스트 할 수 있습니다.
이 방법은 따라서 높게 동적 간격 수정을 가진 발달 프로세스에 있는 복잡한 조직 상호 작용을 연구하기 위한 유용한 공구이고 또한 기관의 대형에 특정 배아 영토의 잠재력을 드러내는 것을 도울 수 있습니다. 예를 들어, 본명중에서 분리된 배아 조직으로부터 메추라기 닭 키메라 티무스의 형성을 기술한다. 첫째, 세 번째와 네 번째 인두 파우치의 내분, 미래의 흉부 기초는 3 일간의 발달로 메추라기 배아의 인두 부위로부터 분리된다.
그런 다음, 이 조직은 그것의 발달을 지원할 수 있는 mesenchyme, somatopleura 중소근과 연관됩니다. 마지막으로, 조직의 이종특이적 협회는 체외와 오보에서 키메라 흉부를 형성하기 위해 배양된다. 수평 라미나르 플로우 후드와 멸균 된 기기 및 재료를 사용하여 멸균 조건에서 모든 계란 조작 절차를 수행하십시오.
수정된 메추라기 알은 공중 챔버를 향하고 있는 것으로 배양되었습니다. 먼저 인큐베이터에서 메추라기 알을 제거합니다. 차가운 PBS로 채워진 큰 보로실리케이트 유리 그릇을 준비합니다.
곡선 가위를 사용하면 3일간의 배양으로 메추라기 달걀 껍질의 원형 구멍을 탭하고 자릅니다. 달걀의 반대편에 구멍을 무딘 만들고, 차가운 PBS와 그릇에 노른자를 전송합니다. 외장 혈관으로 외부로 비텔린 멤브레인을 절단하여 노른자에서 배아를 제거합니다.
얇은 집게의 도움으로, 차가운 PBS로 채워진 작은 그릇에 배아를 전송한 다음 스키머가있는 검은 색 베이스가있는 페트리 접시로 배아를 옮춥시다. 이전 Jove SPA 결찰에 설명된 바와 같이 세 번째 및 네 번째 인두 파우치를 포함하는 인두 부위를 제거합니다. 그런 다음 세 번째와 네 번째 인두 아치 부위를 차가운 췌장으로 채워진 유리로 옮기고 얼음 위에 1 시간 동안 인큐베이션하여 효소 소화를 합니다.
효소 소화의 잠복기는 발달 단계에 따라 다릅니다. 스테레오 현미경 아래에 유리 접시를 놓고 홀더에 두 개의 마이크로 메스를 사용하여 세 번째 및 네 번째 인두 아치 영역에서 엔도드름을 분리합니다. 먼저 등쪽 면을 위로 하는 인두 부위를 배치하여 외부 표면에 내분과 이외 절제술을 내부적으로 표시합니다.
신경관의 자궁 절제술, 내도, 메센키메, 심장 관 및 복부 부분을 관찰한다. 인두 내막의 등쪽 표면에 부착 된 신경 관과 중체를 제거합니다. 인두의 엔도름, 네 번째와 세 번째 인두 파우치, 심장 관을 관찰한다.
등쪽을 위로 올려두면 인두 아치 사이의 메센키메를 조심스럽게 분리하고 제거하고 인두 파우치를 노출시보있습니다. 인두 영역의 반대편에서 이 절차를 수행합니다. 엔도름의 가장 후방 부분에 부착 된 메센키메를 제거하고 네 번째 인두 파우치를 관찰하십시오.
후방 쪽을 위로, 왼쪽과 오른쪽 네 번째 인두 파우치를 모두 관찰. 엔도름의 가장 후방 부분과 두 번째 파우치에 부착 된 메센키메를 제거하여 계속합니다. 내부 파우치를 둘러싼 심장 튜브와 메센키움을 제거합니다.
복부 쪽을 위로, 인두 엔도드름을 관찰하고, 두 번째 인두 아치의 오른쪽을 관찰한다. 이 단계에서, 갑상선 기초의 엔도름을 볼 수 있어야합니다. 두 번째와 세 번째 인두 아치의 자궁 절제술을 분리하고 아치의 관저를 조심스럽게 제거합니다.
오른쪽에 있는 두 번째 인두 아치의 메세나키메 제거를 관찰한다. 네 번째와 세 번째 파우치와 갑상선 초보의 위치를 유의하십시오. 인두 파우치에 부착 된 중간 엽 세포에 유해를 제거합니다.
오른쪽의 세 번째와 네 번째 파우치와 왼쪽에서 네 번째 파우치를 관찰한다. 왼쪽의 중간 분리를 반복합니다. 이제 왼쪽의 세 번째 파우치를 관찰하십시오.
왼쪽에 있는 두 번째 아치의 중간 엽 분리를 관찰한다. 이 절차 동안 모든 표면과 솔루션은 차갑게 유지되어야 합니다. 조직을 해부하는 데 시간이 오래 걸리는 경우 새로운 차가운 췌장 용액과 접시로 변경합니다.
마지막으로, 두 번째와 세 번째 인두 파우치 사이에 트랜스 버단을 잘라 두 번째 파우치와 갑상선 초보를 제거합니다. 이 시점에서, 고립 된 엔도드름은 세 번째와 네 번째 인두 파우치와 인두의 후방 끝으로 구성된다. 두 개의 마이크로 메스의 도움으로 분리 된 메센키움을 제거합니다.
차가운 태아 소 세럼으로 채워진 유리 접시에 고립 된 엔도드름을 옮기고 체외 분석과정을 준비하는 동안 얼음 위에 보관하십시오. 계란은 수평 위치에 배치하고 상측은 숯을 사용하기 위해 표시되었다. 먼저 인큐베이터에서 계란을 제거합니다.
곡선 가위를 사용하면 껍질에 작은 구멍을 열고 바늘을 삽입하고 10 밀리리터 주사기로 알부민 2 밀리리터를 흡입합니다. 쉘의 표시된 부위에 원형 구멍을 열고 얇은 집게로 배아를 유지하면서 외부로 혈관 막을 여분의 배아 혈관으로 절단합니다. 스테레오 현미경의 밑에, 차가운 PBS를 포함하는 검은 기지와 페트리 접시에 태아를 놓습니다.
4개의 곤충 핀을 사용하여 배아를 접시 바닥에 고정시하십시오. 사각형 모양을 형성하는 외피 성 영역에 핀을 놓습니다. 소미트(19)와 24사이의 두 컷을 배아 축으로 변환하여 배아를 횡단한다.
한계 배아 가장자리를 절단하여이 섹션을 해제합니다. 측면 플레이트, 신경관 및 소염을 관찰합니다. 조직을 흡입하고 차가운 췌장으로 채워진 유리 접시에 티슈를 옮춥춥시다.
효소 소화를 위해 얼음에 30분 동안 배양하세요. 스테레오 현미경의 밑에, 홀더에 있는 2개의 마이크로 메스를 사용하여 주변 조직에서 중구를 분리합니다. 소마토플라우라 중소, 스플란치노플라, 신경관 및 이토더름을 관찰하십시오.
먼저 표면에서 자궁 절제술을 제거합니다. 자궁 에서 해리 된 소토 플라 우 막 을 관찰하십시오. 그런 다음, 소마토플라에서 심플치노플레라에 위치한 통풍구를 조심스럽게 분리합니다.
소마토플라의 오른쪽 측면 중소포름을 관찰한다. 신경관에 평행한 동작으로 절단하여 놓습니다. 이 절차 동안 모든 표면과 솔루션은 차갑게 유지되어야 합니다.
조직을 해부하는 데 시간이 오래 걸리는 경우 새로운 차가운 췌장 용액과 접시로 변경합니다. 소마토플라, 소마이트, 신경관 및 자궁 절제술의 왼쪽 측면 중소를 관찰하십시오. 이 쪽의 중구 방출을 반복합니다.
마이크로 메스로 느린 움직임을 만듭니다. 노출된 세포외 매트릭스 단백질은 조직과 계측기를 통해 앉아 유체 의 움직임을 방지합니다. 신경관에 평행한 동작으로 소마토플라우라를 조심스럽게 잘라냅니다.
고립 된 중소포름을 차가운 태아 소 혈청으로 채워진 유리 접시에 옮기고 체외 분석 을 준비하는 동안 얼음위에 보관하십시오. 페트리 접시에 미세메쉬 금속 화격자를 놓고 문화 매체로 채웁니다. 과도한 액체를 제거하여 화격자 상단으로 중간 표면을 평평하게 합니다.
얇은 집게의 도움으로 멤브레인 필터를 배양 매체에 담그고 창살 위에 조심스럽게 놓고 그녀와 접촉하는 표면을 갖습니다. 스테레오 현미경으로, 주걱과 얇은 집게의 도움으로 부드러운 슬라이딩에 의해 유리 접시에서 멤브레인 필터에 고립 된 endoderm을 전송합니다. 격리된 중습에 대해 이 절차를 반복합니다.
마이크로 메스의 도움으로 조직을 혼합하여 협회를 최대화하십시오. 관련 조직을 48시간 동안 5%CO2로 37도에서 가습된 인큐베이터에 조심스럽게 배치합니다. 잠복기 후, 배양 조직을 코리오란 형 멤브레인에 접목하고 이전에 설명한 대로 장기 형성을 완료하기 위해 10 일 동안 타원형으로 개발할 수 있습니다.
다음은 조류 배아 조직의 분리가 뚜렷한 실험 접근법에 사용될 수 있도록 하는 망상 적인 방법이다. 예를 들어, 인두 파우치의 형성에 관여하는 것으로 알려진 유전자의 발현은 또한 3일째에 닭의 배아로부터 두 번째, 세 번째 및 제4 인두 파우치를 포함하는 고립된 엔도름을 평가하여 시상 혼성화에서 전체적으로 산으로 평가하였다. 소닉 고슴도치의 표정은 중앙 인두의 엔도름에서 검출되고 파우치에서 제외되었으며, BMP7은 두 번째와 세 번째 인두 파우치의 엔도름에서 발현되어 중앙 인두 및 네 번째 인두 파우치에서 제외되었습니다.
고립 된 조직은 또한 48 시간 동안 시험관 내에서 구체적으로 연관된 시험관, 코리오란 형 막에 이식하고, 추가 10 일 동안 개발할 수 있습니다. 식생은 종래의 히스토로지와 면역히스토화학에 의해 분석될 수 있다. 닭 소토플라 중소균을 가진 세 번째와 네 번째 인두 파우치로부터메추리 내막의 협회의 일부 대표적인 결과는 다음과 같은 이식편이 QCPN 및 닭 림프구 세포에 대해 양성 메추라기 유래 흉선 흉선 흉선 을 보였다.
또한, 사이토케라틴 양성 흉부 상피는 일반적인 망상 건축을 표시하는 일반적인 형태학적 특징을 보였다. 이 비디오를 시청 한 후, 당신은 유전자 발현 연구에서 사용할 수있는 메추라기 와 닭 배아 조직을 분리하는 방법을 잘 이해해야하며 키메라 장기를 형성하면 장기 유전학의 복잡성을 해독하는 데 도움이 될 수 있습니다.
