이 프로토콜은 연구원이 회로 내의 기능을 기초로 연결 및 공간 조직의 신경 패턴에 대한 중요한 질문에 대답 할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 그대로 3 차원 조직 내에서 깊은 곳에 위치한 신경 형태학의 시각화를 가능하게한다는 것입니다. 이 방법은 간단하고 따라서 쉽게 재현 할 수 있습니다.
처음 실험자는이 기술을 수행하는 것이 편안해야합니다. 고품질 데이터를 얻기 위해서는 명확한 조직 샘플을 가져야 합니다. 적절한 조직 선명도 및 클리어링 기술의 시각적 데모는 쉽게 재현 가능한 결과를 가능하게 합니다.
우선 하이드로겔에 잠긴 뇌 조직을 영하 90킬로파스칼 진공 상태에서 섭씨 37도에서 3시간 동안 진공 인큐베이터에 놓습니다. 진공이 제대로 형성될 수 있도록 튜브 상단을 나사로 두십시오. 부드러운 흔들림으로 실온에서 10 분 동안 PBS로 조직을 씻으시다.
중합조직 시료를 전기전경실에 놓고 챔버 내조직의 방향을 추적한다. 공급된 전기전도 SDS 버퍼로 챔버와 저수지를 채웁니다. 70볼트, 1암페어, 섭씨 35도에서 시료를 실행하여 조직의 밀리리터당 약 2시간 동안 일정한 전류를 가집니다.
챔버에서 제거하고 동일한 방향으로 교체하여 뇌 조직의 충분한 청산을 위해 주기적으로 샘플을 확인하십시오. 샘플이 정리를 마친 후 실온에서 하룻밤 동안 PBS로 세척하여 PBS를 가능한 한 자주 신선한 PBS로 대체하십시오. PBS에서 마지막 세척에 따라, 실온에서 탈이온 수에서 5 분 동안 티슈를 3 번 세척하십시오.
조직은 불투명해지고 확장될 수 있습니다. 실온에서 적어도 4시간 동안 굴절지수 매칭 용액에서 조직을 배양한다. 인큐베이션 동안, 시료를 이미지화하기 위해 적합한 하우징 챔버를 구성한다.
먼저 유리 슬라이드를 장착의 베이스로 사용한 다음 고무 또는 플라스틱 스페이서를 내려놓고 슈퍼 접착제로 고정하여 구멍이 없는지 확인합니다. 굴절률 매칭 용액으로 미리 채워진 장착 챔버에 명확한 조직을 배치합니다. 유리 커버슬립을 위에 놓고 매니큐어로 밀봉하여 조직을 단단히 장착합니다.
유리 위에 직접 굴절 지수 매칭 마운팅 솔루션을 추가하여이 조직을 이미지. 5밀리미터 두께 이상의 조직을 위한 대형 조직 이미징 챔버를 구성하려면 벽이 높은 10센티미터 유리 접시를 사용하십시오. 50 밀리리터 원콘 튜브를 중앙에 놓고 튜브의 직경이 사용되는 객관적인 렌즈의 배럴을 받아들일 만큼 충분히 큰지 확인합니다.
물에 3 %의 아가로즈를 만들고 유리 접시와 원뿔 관 사이의 공간에 부어 1 시간 동안 식힙니다. 이것은 고체 아가로즈의 반지를 형성합니다. 슈퍼 접착제를 사용하여 챔버의 바닥에 조직을 단단히 부착하고 굴절 지수 일치 용액으로 챔버를 채우고 공기에서 보존되고 섭씨 4도에 저장되지 않는 한 중합화되기 시작할 수 있습니다.
공초점 현미경을 사용하여 이미지를 획득합니다. 모든 관련 이미징 장비를 켭니다. 샘플을 무대에 놓습니다.
신중하게 목표와 몰입 미디어에 접근하고 미디어의 지속적인 열을 형성한다. 피형성 경위를 사용하여 적절한 이미징 필드를 찾습니다. 해상도를 설정하고 속도 설정을 스캔합니다.
공초점 현미경을 사용하여 이미징하는 경우 핀홀을 완전히 닫아 가장 작은 광학 섹션을 확보하므로 최상의 Z 해상도를 얻습니다. 높은 신호 대 잡음 비율로 적절한 이미지를 얻을 때까지 레이저 전력 또는 센서 게인을 점차적으로 증가시다. 표준 EGFP 또는 tdTomato 2색 이미징을 사용하는 경우 라이트 컬렉션 설정을 설정합니다.
조직의 관찰된 시작 점 및 끝점을 기반으로 Z 스택 매개변수를 설정합니다. 원하는 Z 해상도에 따라 단계 크기를 설정합니다. 더 작은 단계 크기는 더 큰 Z 해상도를 산출할 것이지만, 샘플 표백으로 이어질 수 있습니다.
이미지 수집 설정에 만족하면 이미지를 획득합니다. 이미지가 높은 신호 대 노이즈 비율을 가지고 있으며 구조의 고유한 경계를 표시합니다. 이미지 수집 후, 대표적인 세포 형태는 임베디드 통계를 사용하여 분석 소프트웨어 내에서 스크립트를 분류했다.
수집된 데이터는 Neuron 2가 뉴런 1에 비해 가시 밀도가 높은 수지상 구조보다 더 크다는 것을 반영합니다. 이러한 결과를 입증하기 위해, 표준 숄 분석이 수행되었으며, 이는 뉴런 2가 소마로부터 50 내지 100 마이크로미터의 Scholl 교차로의 증가수에 의해 표시된 뉴런 1보다 더 수지상적으로 복잡하다는 것을 확인시켜 주어. 뉴런 1은 더 많은 filopodia 같은 모양과 척추의 더 큰 비율을 포함하고 미숙한 척추 하위 유형입니다.
버섯 척추라고 불리는 정의된 머리를 가진 척추는 더 발달되고 성숙한 시냅스를 함유하고 있습니다. 따라서, 뉴런 2는 성숙한 척추의 높은 밀도로 더 성숙하다. 클리어후, 조직 덩어리는 전통적인 면역 조직 화학을 사용하여 염색될 수 있다.
