대형 다세포 구조를 연구하는 데 대한 관심이 높아짐에 따라 투명한 장기 내에서 대형 구조물의 3차원 시각화 및 정량화를 가능하게 하는 이 광학 클리어링 기술의 개발로 이어졌습니다. 이 프로토콜은 간단하고 저렴하며 쉽게 설정하고 조직을 3 차원으로 조사하는 포괄적 인 도구를 제공합니다. 질병의 다층 특성은 항상 기존의 2 차원 기술에 의해 시뮬레이션 될 수 없습니다.
조직의 3차원 분석은 질병을 더 잘 진단하고 모니터링하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 신장 조직에 국한되지 않으며 정상 및 질병 조직에 적용 될 수 있습니다. 이 간단한 프로토콜은 동물 취급경험이 있는 과학자를 위해 쉽게 따라갈 수 있습니다.
불량 한 항체 라벨링의 경우에 다른 항체를 시험하고, 이차 항체 만 통제를 하는 것이 중요합니다. 원고 방향에 따라 PBS와 3.0%의 파라포름알데히드를 1X PBS로 포함하는 헤파린을 준비하고 솔루션을 별도의 50mL 플라스틱 주사기로 전송하는 것으로 시작합니다. 파라포름알데히드는 독성이 있으며 연기 후드에 준비해야 합니다.
원고 의 지시에 따라 신장을 수집하고 교묘하게 하십시오. 그런 다음 캡슐을 제거하고 신장을 1mm 두께의 관상 슬라이스로 자른다. 15mL 원문 튜브에 준비된 파라포름알데히드 용액으로 신장 슬라이스를 담급하십시오.
고정 후, 수평 로커에 1 시간 동안 1X 세척 버퍼로 신장 슬라이스를 두 번 세척 한 다음 항원 검색을 진행합니다. 500mL 비커에 1X 항원 미마스킹 용액300mL를 가열합니다. 그런 다음 가열된 완충액에 투과할 수 있는 포함 된 카세트에 신장 슬라이스를 동봉하고 섭씨 92에서 98도에서 1 시간 동안 저어줍니다.
이 항원 회수 단계에 대해 섭씨 92도에서 98도 사이의 온도를 안정적으로 유지하는 것이 중요합니다. 그런 다음 슬라이스를 0.1% Triton X-100으로 1X 세척 버퍼의 10mL로 옮기고 하룻밤 동안 흔들어 주세요. 다음 날, 1 시간 동안 신선한 1X 세척 버퍼의 10 mL로 슬라이스를 두 번 씻으시다.
일반 항체 희석제의 500 마이크로리터에서 1차 항체를 희석시. 섭씨 37도에서 4일 동안 희석된 1차 항체의 신장 슬라이스를 부드럽게 흔들어 주세요. 인큐베이션 후, 신장 슬라이스를 실온에서 하룻밤 동안 10mL의 10mL로 씻어 8시간 후에 완충제를 한 번 변경한다.
이차 항체를 정상 항체 희석제 500 마이크로리터로 희석하고 섭씨 37도에서 4일 동안 신장 슬라이스로 배양한다. 이 단계에서는 신장 조각을 빛으로부터 보호해야 합니다. 이차 항체로 인큐베이션 후, 실온에서 하룻밤 동안 10mL의 10mL로 신장 슬라이스를 씻는다.
신장 슬라이스를 탈수하려면, 100% 에탄올의 5mL로 옮기고 실온에서 2시간 동안 흔들어 1시간 후에 에탄올을 상쾌하게 한다. 신장 슬라이스를 에틸 시나메이트 2mL에 담그고 하룻밤 동안 부드럽게 흔들어 주세요. 조직을 이미지화할 준비가 되면 에틸 시나메이트 600~1,000마이크로리터를 유리 바닥 접시에 넣고 신장 슬라이스를 접시에 옮길 수 있습니다.
신장 슬라이스에 둥근 커버 슬립을 놓고 파라핀 필름으로 접시를 밀봉하십시오. 현미경 이미징 플랫폼에 접시를 놓고 원고 의 지시에 따라 조직을 이미지합니다. 이 프로토콜은 성공적으로 신장 조직에 3D 분석을 수행하고 세포 기능 및 상호 작용을 평가하는 데 사용되었습니다.
이 방법은 형광 기자담금을 유발할 수 있지만 다른 강력한 형광 단백질은 신호 담금질에 저항할 수 있다. 복부 대동맥 풍부혈은 항체 확산을 향상시킬 수 있습니다. 어떤 경우에는 항체 침투가 좋지 못하여 피상적 신호가 발생합니다.
이것은 항체의 더 높은 농도 또는 보충으로 정정될 수 있습니다. 관심있는 항원이 신장 혈관에서 표현되는 경우에 내트라바산 전달은 고려되어야 합니다. 그러나, 관상피 세포의 정압 막에서 단백질을 표적으로 하는 항체는 구체 여과 장벽을 교차하지 않으며 특이하지 않은 신호를 일으키는 원인이 되지 않습니다.
조직은 특정 세포 집단을 검출하거나 전체 관균 세그먼트를 시각화하기 위하여 항체로 표지될 수 있습니다. 더욱이, 3D에서 단백질의 공동지역화는 다중 항체를 결합하여 달성될 수 있다. 항체 라벨링은 좋은 신장 풍부, 항원 회수 단계의 사용 및 높은 항체 농도로 개선될 수 있다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
몇몇 강한 기자 단백질은 이 프로토콜에 따라 형광 신호의 담금질에 저항할 수 있습니다. 이를 테스트하려면 항원 검색 및 항체 라벨링 단계를 건너뜁니다. 이 기술은 구조의 입체적 특성을 존중하고 연구를위한 많은 새로운 영역을 엽니 다.
기존의 2차원 분석과 관련된 필요한 가정과 간섭을 제거합니다.
