Name: isolation of peritoneum-derived mast cells and their functional characterization with ca2+-imaging and degranulation assays
Uploaded: 2018-07-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays at JoVE.com

저자 돛대 세포 준비와 재배 기술 지원에 대 한 줄리아 Geminn를 인정 하 고 싶습니다. 이 작품은 Transregional 공동 연구 센터 (TR-SFB) 152에 의해 지원 되었다.

모든 동물 절차 관리 및 실험실 동물 (카를스루에 지역 위원회에 의해 승인)의 사용에 대 한 독일 입법 지침에 따라 수행 했다.
1. PMC 고립과 재배 복 게에 의해
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>1</td>
			<td>얼음</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>10 mL 주사기</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>27 G 바늘</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>20 G 바늘</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>스티로폼 블록 및 핀</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>컬렉션 튜브 (50ml 플라스틱 원심 관)</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>70% 에탄올</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>RPMI 매체 (냉장 하 고 얼음에 보관 중)</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>PMC 매체: RPMI 매체 + 20 %FCS (송아지 태아 혈 청) + 1% 페니실린 스 솔루션 (펜-연쇄 상)</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>Dulbecco의 인산 염-(캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +) 없이 DPBS 버퍼링</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>문화 플라스 크 (25 cm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>성장 인자 재고 솔루션 (IL-3: 1 μ g/μ; SCF: 2.5 μ g/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>13</td>
			<td>혈 청 학적인 펫 (10 mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>14</td>
			<td>펫 팁 불 임 (20-200 µ L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>15</td>
			<td>Hemocytometer</td>
		</tr>
<tr>
<td>16</td>
			<td>벤치 원심 분리기</td>
		</tr>
<tr>
<td>17</td>
			<td>가 위와 집게</td>
		</tr>
<tr>
<td>18</td>
			<td>마우스에 대 한 CO2 챔버</td>
		</tr>
<tr>
<td>19</td>
			<td>살 균 오픈 후드</td>
		</tr>
<tr>
<td>20</td>
			<td>닫힌된 살 균 후드</td>
		</tr>
<tr>
<td>21</td>
			<td>셀 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2)</td>
		</tr>
<tr>
<td>22</td>
			<td>펫 (20-200 µ L) 전송</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 1 단계에 대 한 자료입니다.
<ol><li>
PMC 격리 복 게
	<ol>
<li>셀 격리 전에 표 1에 나열 된 재료를 준비 합니다.</li>
		<li>8 14 주 된 남성 마우스를 사용 하 여 PMC 격리에 대 한. CO2 흡입에 의해 마우스를 안락사 고 반사의 손실에 의해 죽음을 확인 합니다. 70% 에탄올으로 마우스를 살포 하 고 핀 (지 느 러 미 쪽 아래)를 사용 하 여 거품 블록에 그것을 해결. 무딘 가장자리가 위를 사용 하 여 마우스의 복 부 피부를 제거 합니다. 복 막 구멍을 손상 하지 마십시오. 참고: 우리가 일반적으로이 프로토콜을 사용 마우스 C57BL/6N 스트레인 유전 배경으로 합니다.</li>
		<li>7 mL 차가운 RPMI 매체의 및 27 G 니 들을 갖춘 10 mL 주사기를 사용 하 여 복 막 구멍에 있는 공기의 5 ml를 주사. 복 막에 신중 하 게 바늘을 밀어 하 고 어떤 장기를 꿰뚫기 하지 마십시오. Epididymal 지방 지역에 자리를 사용 하 여 기관 구멍 뚫 기의 위험을 줄이기 위해.</li>
		<li>주입 후 RPMI 매체에 복 막 세포 분리를 1 분 동안 마우스를 흔들어. 할 동요 마우스 너무 강력 하 게, 내부 장기 손상 및 혈액과 복 막 구멍을 오염 방지 하기 위해.</li>
		<li>새로운 20 G 정 장착 하 여 10 mL 주사기를 다시 사용 합니다. 거품 블록을 기울이기 고 부드럽게 중간 포부를 보다 쉽게 다른 측면에서 벤치에 활용 하 여 1 개의 측에 내부 장기를 이동 합니다. 20 G 바늘을 삽입, 베벨 및 액체는 복 부를 부드럽게 그리고 천천히 발음 (~0.5 mL/s)를 내부 기관에 의해 막힘을 방지. (일반적으로 5-6 mL) 가능한 많은 액체를 수집 합니다.</li>
		<li>주사기에서 바늘을 제거 하 고 얼음에 컬렉션 튜브에 수집 된 세포 현 탁 액을 전송. 보이는 혈액 오염 경우 샘플 튜브를 삭제 합니다.</li>
		<li>5 분 ~ 300 x g 에서 셀 서 스 펜 션 튜브 원심 살 균 후드 아래는 상쾌한 발음. 각 마우스에 대 한 감기 (4-10 ° C)의 4 ml 샘플 펠 릿 결합 PMC 매체와 전송 25 cm2 문화 플라스 크에 세포 현 탁 액. 추가 최종 농도 10 ng/mL에 성장 요인 IL-3 및 SCF 30 ng/mL, 각각. 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2)에 있는 셀을 포함 하는 플라스 크를 배치 하 고 절차까지 ~ 48 h에 대 한 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PMC 문화
	<ol>
<li>주 2 (격리 후 ~ 48 h): 중간 변경<ol>
<li>제거 하려면 표면에 뜨는 및 비 점착 세포 (적혈구 및 죽은 세포), 플라스 크의 가장자리에 파스퇴르 피 펫 팁을 배치 하 고 플라스 크를 거의 수평으로 들고 여 플라스 크에서 매체를 발음. 마우스 당 미리 따뜻하게 PMC 매체의 4 mL를 추가 합니다. 추가 성장 요인 IL-3 (10 ng/mL) 및 SCF (30 ng/mL). 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2)에 있는 셀을 포함 하는 플라스 크를 놓습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>주 9: 셀 분<ol>
<li>50 mL 플라스틱 원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액 셀 문화 플라스 크에서 전송. 세 번 10 mL 사전 예 열 (37 ° C) Dulbecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS)와 플라스 크를 씻고, 동일한 50 mL에서 분리 된 세포와 세포 현 탁 액을 수집 플라스틱 원심 관. hemocytometer에 의해 셀 농도 계산 하 고 셀의 총 수를 계산.</li>
			<li>~ 300 x g 5 분 동안에 세포 현 탁 액을 원심 고는 상쾌한 발음. 셀 농도 1 x 106 셀/mL를 미리 데워 PMC 매체 (37 ° C)에 펠 릿을 복구 합니다. 새로운 25 cm2 문화 플라스 크에 세포 현 탁 액을 전송 합니다. 바닥에 고착 하는 섬유 아 세포와 오래 된 플라스 크를 삭제 합니다.</li>
			<li>추가 성장 요인 IL-3 (10 ng/mL) 및 SCF (30 ng/mL), 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2)에 있는 셀을 포함 하는 플라스 크를 놓습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>12-15 일: 측정 셀<ol>
<li>FcɛRI 수용 체의 자극으로 어떤 실험을 계획 하는 경우 표준 문화 매체에 ige의 안티-DNP의 300 ng/mL와 하룻밤 셀을 pretreat. 2 단계와 3 단계를 진행 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. fluorometric 세포내 무료 칼슘 농도 측정 PMCs에
<ol><li>측정을 하기 전에 표 2에 나열 된 재료를 준비 합니다. 또한,의 구성 하는 이미징 설치 준비: 거꾸로 형광 현미경; 목표: 40 X / 1.3 기름; Fura 2 필터 설정; CCD 카메라; 여기 광원; 영상 수집 프로그램; 중력 공급 솔루션 응용 프로그램 시스템.</li>
</ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>1</td>
			<td>PMC (12-15 일) 1 x 106 셀/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>Concanavalin A</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>Fura-2 오전</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>Pluronic F-127 20% 솔루션</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>커버 슬립 안경 라운드; ø 25 m m; 제 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>DNP HSA (dinitrophenol-인간 혈 청 알 부 민) 재고 솔루션</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>안티-DNP-항 체 (IgE) 재고 솔루션</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>플랫 바닥 플레이트 (12 정)</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>복합 48/80 재고 솔루션</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>잘 이미징 챔버 커버</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>Hemocytometer</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>펫 (20-200 µ L) 전송</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 2 단계에 대 한 자료입니다.
<ol start="2"><li>
Fura-2 이미지 준비
	<ol>
<li>세포 수는 hemocytometer를 사용 하 여 수행 하 고 셀 농도 1 x 106 셀/mL를 조정. (3-5 회)는 세포 현 탁 액 1 mL 피 펫 팁을 부드럽게 pipetting으로 PMCs 식민지를 분할.</li>
		<li>준비는 캘리포니아2 +-소금 솔루션 버퍼링 HEPES 포함 (캘리포니아2 +-HBSS) 135 mM NaCl, 6 m m KCl, 2mm CaCl2, 1.2 m m MgCl2, 10 mM HEPES, 및 12 mM 포도 당으로 구성. 3 M NaOH와 7.4에 pH를 조정 합니다.</li>
		<li>준비 concanavalin A 각 25 m m에 pipetting concanavalin A 솔루션 (0.1 mg/mL에서 H2O) 1 방울에 의해 코팅된 슬라이드 라운드 살 균 후드 커버 유리. 적어도 1 분 동안 커버 슬립에 방울을 두고 그 피 펫 및 하자 커버 미끄러져 건조 45 분 신중 하 게 고무 챔버 이미징에 concanavalin A 처리 커버 전표를 눌러에 대 한 솔루션의 대부분을 제거 ( 재료의 표참조)까지 그들은 현미경 이미징 챔버를 연결 합니다. 참고: 폴 리-L-리 신 코팅 슬라이드 대신 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>형광 Ca2 + 염료 Fura-2 녹 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에서 오전 (1 mM). 빛에서 보호 하는이 솔루션을 저장 합니다.</li>
		<li>Fura 2 희석 캘리포니아2 +에서 오전 재고 솔루션-HBSS "로딩 버퍼"를 준비 하기 위해 5 µ M의 최종 농도에. DMSO에 20% pluronic F-127의 5 µ L/mL와 함께 보충.</li>
		<li>PMC 세포 현 탁 액의 500 µ L로 "로딩 버퍼" 믹스 500 µ L. 이미징 챔버로 혼합물을 플라스틱 하 고 어둠 속에서 실 온에서 20-30 분에 대 한 셀을 품 어.</li>
		<li>응용 프로그램 시스템 자극 프로토콜에 따라 서로 다른 솔루션을 공급 하는 중력을 설정 합니다. 주사기 1 캘리포니아2 +-HBSS 솔루션의 40 mL와 함께 보충, 2 캘리포니아2 +-HBSS 포함 된 솔루션 100 ng/mL DNP의 40 mL 주사기, 주사기 캘리포니아2 +-HBSS 솔루션에 포함 된 50 µ g/mL 복합 48/80의 40 mL로 3, 4의 40 mL 주사기 명목상 캘리포니아2 +-무료-HBSS 솔루션, 5에 명목상으로 캘리포니아의2 +40 mL 주사기 및-무료-HBSS 솔루션 2 µ M 포함 된 Thapsigargin.</li>
		<li>그것에 침수 기름의 작은 방울을 배치 하 여 40 X 높은 조리개 기름 침수 목표를 준비 합니다.</li>
		<li>거꾸로 한 현미경의 스테이지에서 응용 프로그램 시스템을 탑재 합니다. 응용 프로그램 시스템에 로드 된 세포 이미징 챔버를 넣고 녹음 하는 동안 움직임을 방지 하기 위해 보안. 전송 된 라이트 켜고 셀 초점.</li>
		<li>캘리포니아2 +-HBSS 버퍼 중력 먹인 응용 프로그램 시스템을 사용 하 여 세 번 셀 린스 합니다.</li>
		<li>캘리포니아2 +세포를 품 어-HBSS Fura-2에 대 일 분 대 한 오전 드 에스테 르 화.</li>
		<li>린스는 세포는 이미징 시작 하기 전에 한 번 더, 잠재적으로 제거를 유출 형광 성 염료.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
세포 이미징
	<ol>
<li>생리 적 획득 모드에서 이미지 수집 프로그램을 시작 합니다. 설치 창을 열고 포커스와 최적의 수집 시간 조절 (340와 여기에 대 한 동일 해야하는 nm 및 380 nm 및 일반적으로 50-150 ms 사이의 범위). 참고: Fura-2의 노출을 최소화 모든 빛을 염료의 photobleaching을 피하기 위해 로드 셀.</li>
		<li>참고 그림을 이미지 하 고 관심 (ROI)의 영역으로 셀을 표시 합니다. 셀에 존재 하 고 배경으로 정의 지역에서 마지막 투자 수익을 표시 합니다.</li>
		<li>설치를 완료 하 고 5 s 수집 속도 측정을 시작 합니다. 참고: 셀 것 이다 될 또는 조명 340의 여기 빛 nm 및 380 nm, 그리고 방출된 형광 (> 510 nm) CCD 카메라를 사용 하 여 수집 됩니다. 이미지 비율 (F340 nm/F380 nm) 뿐만 아니라 형광 신호 F340 nm와 F380 nm의 3 개의 창에 표시 됩니다. 개별 ROIs 형광 강도의 시간 과정의 차트 의미 값 또한 지속적으로 표시 됩니다.</li>
		<li>실험의 디자인에 따라 적절 한 주기 수에 솔루션을 추가:<ol>
<li>[캘리포니아2 +]나, 항 원 유도 측정 상승 하려면 그림 2, 2B에서 볼 수 있듯이 20, 주기와 주기 150 후 기록 중지 후 주사기 2 솔루션을 적용 합니다.</li>
			<li>[캘리포니아2 +] 48/80 복합 유도 고도 측정, i,C, 그림 2그림으로 20, 주기와 주기 150 후 기록 중지 후 주사기 3 솔루션을 적용 합니다.</li>
			<li>D 그림 2볼 수 있듯이 [캘리포니아2 +]내가 SOCE에 의해 evoked의 고도 측정, 주기 10 후 주사기 4 솔루션을 적용, 사이클 70 후 주사기 5 솔루션을 적용, 주기 120, 후 주사기 4 솔루션을 적용 사이클 150, 후 주사기 1 솔루션을 적용 하 고 사이클 220 후 녹음을 중지.</li>
		</ol>
</li>
		<li>마친 후 측정, 변환 결과 배경 보정 없이 여기 파장 뿐만 아니라 비율 값와 모든 투자 수익에 대 한 배경 보정 없이 측정된 농도 포함 하는 비율 테이블 그리고 모든 측정 시간 점입니다. 수집 프로그램에서 연속적으로 버튼을 눌러: "시작 커터", "모두 표시", "모든 변환", "생리학 측정", "좋아,"확인". 테이블 및 오프 라인 분석을 위해 이미지 스택 파일을 저장.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 베타-hexosaminidase 릴리스 측정 PMCs에
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>1</td>
			<td>PMC (12-15 일) 1 x 106 셀/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>안티-DNP-항 체 (IgE) 재고 솔루션</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>DNP HSA 재고 솔루션</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>복합 48/80 재고 솔루션</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>Ionomycin</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>96 잘 접시, v 자형 하단</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>96 잘 접시, 플랫 바닥</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>플라스틱 원심 관 (15 mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>혈 청 학적인 펫</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>셀 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2)</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>벤치 원심 분리기</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>광학 밀도 측정을 위한 결정 플레이트 리더</td>
		</tr>
<tr>
<td>13</td>
			<td>멀티 채널 피 펫 (20-200 μ)</td>
		</tr>
<tr>
<td>14</td>
			<td>Hemocytometer</td>
		</tr>
</tbody></table>표 3: 3 단계에 대 한 자료입니다.
<ol><li>측정, 이전 표 3에 나열 된 재료를 준비 합니다. 참고: β-hexosaminidase 그들의 자극 후 MCs에서 출시 된 p-nitrophenol 및 N-아 세 틸-D-글루코사민으로 p-nitrophenyl-아 세 틸-D-글루코사민 (pNAG) hydrolyzes. 샘플에서 β-hexosaminidase 양은 형성 될 것 이다 p-nitrophenol의 크기에 비례 이다. "중지 솔루션"의 높은 pH 환경에서 p-nitrophenol 완전히 deprotonated p-nitrophenolat으로 존재 하 고 405에서의 빛 흡수도 의해 검출 될 수 있다 nm.</li>
	<li>130 mM NaCl, KCl 5mm, 1.4 m m CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 5.6 m m 포도 당, 및 BSA 0.1%를 포함 하는 Tyrode의 솔루션을 준비 합니다. 3 M NaOH와 7.4에 pH를 조정 합니다.</li>
	<li>1% 트라이 톤 X-100 양의 Tyrode의 솔루션에 추가 하 여 세포의 용 해 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>200mm 글리신의 구성 중지 솔루션을 준비 하 고 NaOH와 10.7에 pH를 조정.</li>
	<li>4 m m의 최종 농도를 0.4 M 구 연산 산 성 pNAG를 용 해 하 여 pNAG 솔루션 (4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside) 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>분석 결과에 필요한 세포의 양을 계산 (중복에서 분석 결과 수행). 잘 당 200000 PMCs를 사용 합니다. 2 웰 스를 사용 하 여 부정적인 컨트롤 (Tyrode의 솔루션 없이 DNP 같은 어떤 secretagogues 또는 복합 48/80)와 긍정적인 컨트롤로 2 우물 (10 µ M와 Tyrode의 솔루션 Ionomycin) 모든 유전자에 대 한.</li>
	<li>15 mL 플라스틱 원심 분리기 튜브에 세포를 전송, Tyrode의 솔루션, 15 mL를 볼륨을 조정 하 고 4 분 파스퇴르 피 펫과 상쾌한을 제거 하 고 resuspend Tyrode의 솔루션 2 x 106 셀에 셀에 대 한 200 x g 에서 원심 /mL입니다.</li>
	<li>96-잘 V-아래 잘 접시에 잘 당 세포 현 탁 액의 100 µ L를 전송. ( 그림 3Apipetting 계획)에 따라 각 잘을 자극 또는 제어 솔루션의 25 µ L를 추가 합니다. 37 ° C, 5% CO2시 45 분에 대 한 셀을 품 어.</li>
	<li>5 분 동안 얼음에 96 잘 접시를 두어서 반응을 중지 합니다. 그런 다음 판 120 x g에서 4 분 4 ° C에서 원심. 평면-바닥 96 잘 접시에 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 상쾌한의 120 µ L를 전송 하 고 얼음에 두십시오. 신중 하 게 셀 펠 릿을 만지지 마십시오 하지만 완전히는 상쾌한 발음.</li>
	<li>셀 펠 릿에 세포의 용 해 버퍼의 125 µ L를 추가 합니다. 실 온에서 5 분 동안 셀 펠 릿을 품 어와 반복 pipetting (약 5 시간)으로 부 화 후 그들을 resuspend.</li>
	<li>새로운 평면 아래 96 잘 접시의 필요한 우물에 pNAG 솔루션 (4mm)의 25 µ L 플라스틱 준비 된 pNAG 솔루션으로 각 세포 lysate의 25 µ L를 각 상쾌한에서 25 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>37 ° c.에서 1 h 반응 일괄 처리 품 어 부 화, 후 각 잘 반응을 중지 중지 솔루션의 150 µ L 플라스틱.</li>
	<li>405에 듀얼-파장 설정을 사용 하 여 microplate 리더와 함께 접시를 분석 자동 배경 빼기에 대 한 참조 630 nm nm. 수집 프로그램에서 똑 딱 상자 "참조" 및 "흡 광도" 프로그램 요소 메뉴에서 선택 "630 nm" 드롭 다운 목록에서. 샘플의 광학 밀도 너무 높은 경우에, 측정 전에 프로브 적절 한 희석을 준비 합니다.</li>
	<li>다음 방정식에 따르면 β-hexosaminidase 방출의 비율을 계산: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57222/57222eq1.jpg"> [상쾌한] 배경 이다 출시 [%]는 특정 베타-hexosaminidase 릴리스의 %, 상쾌한의 흡수를 수정 하 고 [lysate] 배경 수정 해당 세포 lysate의 흡수.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+mast+cells:+negative,+as+well+as+positive,+regulators+of+immunity.">Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity.</a> Nat Rev Immunol. 8 (6), 478-486 (2008).</li><li>Feyerabend, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-mediated+cell+ablation+contests+mast+cell+contribution+in+models+of+antibody-+and+T+cell-mediated+autoimmunity.">Cre-mediated cell ablation contests mast cell contribution in models of antibody- and T cell-mediated autoimmunity.</a> Immunity. 35 (5), 832-844 (2011).</li><li>Razin, E., Cordon-Cardo, C., Good, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+a+pure+population+of+mouse+mast+cells+in+vitro+with+conditioned+medium+derived+from+concanavalin+A-stimulated+splenocytes.">Growth of a pure population of mouse mast cells in vitro with conditioned medium derived from concanavalin A-stimulated splenocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (4), 2559-2561 (1981).</li><li>Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kit+ligand,+stem+cell+factor.">The kit ligand, stem cell factor.</a> Adv Immunol. 55, 1-96 (1994).</li><li>Galli, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+as+"tunable"+effector+and+immunoregulatory+cells:+recent+advances.">Mast cells as "tunable" effector and immunoregulatory cells: recent advances.</a> Annu Rev Immunol. 23, 749-786 (2005).</li><li>Ma, H. T., Beaven, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+Ca(2+)+signaling+in+mast+cells:+Potential+targets+for+treatment+of+mast+cell-related+diseases.">Regulators of Ca(2+) signaling in mast cells: Potential targets for treatment of mast cell-related diseases.</a> Adv Exp Med Biol. 716, 62-90 (2011).</li><li>Vig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+mast+cell+effector+functions+in+mice+lacking+the+CRACM1+pore+subunit+of+store-operated+calcium+release-activated+calcium+channels.">Defective mast cell effector functions in mice lacking the CRACM1 pore subunit of store-operated calcium release-activated calcium channels.</a> Nat Immunol. 9 (1), 89-96 (2008).</li><li>Freichel, M., Almering, J., Tsvilovskyy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+TRP+proteins+in+mast+cells.">The role of TRP proteins in mast cells.</a> Front Immunol. 3, 150 (2014).</li><li>Scholten, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell-specific+Cre/loxP-mediated+recombination+in+vivo.">Mast cell-specific Cre/loxP-mediated recombination in vivo.</a> Transgenic Res. 17 (2), 307-315 (2008).</li><li>Malbec, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peritoneal+cell-derived+mast+cells:+An+in+vitro+model+of+mature+serosal-type+mouse+mast+cells.">Peritoneal cell-derived mast cells: An in vitro model of mature serosal-type mouse mast cells.</a> J Immunol. 178 (10), 6465-6475 (2007).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. 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I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+release+of+beta-hexosaminidase+and+beta-glucuronidase+from+purified+rat+serosal+mast+cells.">Immunologic release of beta-hexosaminidase and beta-glucuronidase from purified rat serosal mast cells.</a> J Immunol. 123 (4), 1445-1450 (1979).</li><li>Schafer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell+anaphylatoxin+receptor+expression+can+enhance+IgE-dependent+skin+inflammation+in+mice.">Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice.</a> J Allergy Clin Immunol. 131 (2), 541-549 (2013).</li><li>Maurer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+promote+homeostasis+by+limiting+endothelin-1-induced+toxicity.">Mast cells promote homeostasis by limiting endothelin-1-induced toxicity.</a> Nature. 432 (7016), 512-516 (2004).</li><li>Maurer, M., Church, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+skin+responses+induced+by+icatibant+injection+are+mast+cell+mediated+and+attenuated+by+H(1)-antihistamines.">Inflammatory skin responses induced by icatibant injection are mast cell mediated and attenuated by H(1)-antihistamines.</a> Exp Dermatol. 21 (1), 154-155 (2012).</li><li>McNeil, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mast-cell-specific+receptor+crucial+for+pseudo-allergic+drug+reactions.">Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions.</a> Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).</li><li>Gaudenzio, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+activation+signals+induce+distinct+mast+cell+degranulation+strategies.">Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies.</a> J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).</li><li>Solis-Lopez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+TRPV+channel+activation+by+stimulation+of+FCepsilonRI+and+MRGPR+receptors+in+mouse+peritoneal+mast+cells.">Analysis of TRPV channel activation by stimulation of FCepsilonRI and MRGPR receptors in mouse peritoneal mast cells.</a> PLoS One. 12 (2), 0171366 (2017).</li><li>Enerback, L., Svensson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+rat+peritoneal+mast+cells+by+centrifugation+on+density+gradients+of+Percoll.">Isolation of rat peritoneal mast cells by centrifugation on density gradients of Percoll.</a> J Immunol Methods. 39 (1-2), 135-145 (1980).</li><li>Bird, G. S., DeHaven, W. I., Smyth, J. T., Putney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+store-operated+calcium+entry.">Methods for studying store-operated calcium entry.</a> Methods. 46 (3), 204-212 (2008).</li><li>Aronson, N. N., Kuranda, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+degradation+of+Asn-linked+glycoproteins.">Lysosomal degradation of Asn-linked glycoproteins.</a> FASEB J. 3 (14), 2615-2622 (1989).</li><li>Moon, T. C., Befus, A. D., Kulka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell+mediators:+their+differential+release+and+the+secretory+pathways+involved.">Mast cell mediators: their differential release and the secretory pathways involved.</a> Front Immunol. 5, 569 (2014).</li></ol>

저자는 공개 없다.

MC 모델 MC degranulation, chemotaxis, 접착, 또한 세포내 신호 변환 통로 MC 활성화에 명료로 공부를 성공적으로 사용할 수 있습니다. 일부 연구 자들은 불멸 하 게 선 (LAD2 HMC1) 등 인간의 MCs 사용 인간의 MCs 모델, 코드에서 파생 된 조상 세포 (CD133 +)와 주변 혈액 조상 세포 (CD34 +) 혈액. 다른 선호 하는 설치류와 같은 불후의 명작 MC 모델 (쥐 basophilic 백혈병 RBL-2 H 3 MC 선) 또는 기본 교양 (마우스 뼈 골 수 유래...

MCs 타고 난과 획득 면역 반응 동안에 저명한 역할을 한다. 특히, MCs 병원 균, 기생충, 박테리아 등의 살해에 참여 하 고 또한 잠재적으로 유독한 내 인 성 펩 티 드 또는 구성 요소 (검토 Galli 외. 20081참조)에 대 한 venoms의 저하. 타고 난 및 적응형 면역에 MCs의 생리 적 역할 열띤된 논쟁의 주제 이다. 따라서, 다른 MC 불충분 한 마우스 모델을 사용 하 여 수행 하는 연구에서 수많은 데이터 불일치 알레르기2넘어 MCs의 면역 기능의 체계적인 재평가 필요 합니다. 성숙한 MCs 조직 및 피부, 폐, 창 자, 등 장기에 지역화 주로 고 있다 일반적으로 혈액에 작은 숫자에만. MCs MC 창시자, 등 조 혈 선구자에서 파생 하 고 그들의 차별화 및 거의 모든 vascularized 조직1는 microenvironments에서 성숙. 선택적으로 T-세포 파생 요소 인터 루 킨 (IL)-3에 그들의 조 혈 창시자3에서 생존, 확산, 그리고 마우스 MCs의 만능 인구의 승진 시킨다. 줄기 세포 요소 (SCF) 구조 세포 조직에 의해 생산 되 고 MC 개발, 생존, 마이그레이션, 및 기능4에서 중요 한 역할. 개별 MCs의 속성은 그들의 능력을 합성 하 고 다양 한 프로 테아 제 또는 proteoglycans 저장에 따라 달라질 수 있습니다. 마우스에 소위 결합 조직 형 MCs는 그들의 해부학 지역화, 형태학, 헤 파 린 및 프로 테아 제5의 내용에 따라 점 막 MCs에서 구별 된다.
MCs의 증가 무료 cytosolic 캘리포니아2 + ([캘리포니아2 +]난)은 필수 degranulation 및 eicosanoids의 생산을 위한 뿐만 아니라 cytokines의 합성과 항 원에 대 한 응답에서 녹음 방송 요인의 활성화 및 다양 한 secretagogues6. 이러한 자극의 주요 다운스트림 목표 hydrolyzes diacylglycerol (DAG) 및 이노 시 톨 1,4,5-trisphosphate phosphatidylinositol 4, 5 bisphosphate phospholipase C, 이다. DAG는 단백질 키 니 아 제 C를 활성화 하 고 IP3 바인딩과 그물에서 캘리포니아2 + 이온을 출시 하였습니다. 이러한 저장소의 고갈 캘리포니아2 + 원형질 막 캘리포니아2 + 채널, 저장 운영된 칼슘 항목 (SOCE)로 이어지는 통해 유입을 활성화 합니다. 이 과정은 캘리포니아2 +의 상호 작용을 통해 되 살려-센서, stromal 상호 작용 분자-1 (Stim1), Orai17 뿐만 아니라 일시적인 수용 체 잠재력 정식 (TRPC) 채널의 활성화를 통해 떠다니고 그물에 (자세한 리뷰 참조 Freichel 그 외 여러분 단백질 20148) 원형질 막에.
공부 하는 여러 약물이 채널의 생리 적인 역할 (채널 차단제의 응용 프로그램) 또는 유전 접근 일반적으로 사용 됩니다. 후자의 경우, 단백질 발현의 억제 mRNA (최저)를 대상으로 하 여 이루어집니다 또는 genomic DNA 코딩 기 공 채널 (녹아웃)의 소 단위를 형성 하는 exon의 전역 또는 조직 관련9 삭제 편집. 이 채널에 대 한 충분 한 특이성으로 차단기의 가용성은 제한 됩니다. 또한, 최저 접근 필요, 예를 사용 하 여 그 유효성의 주의 제어., 서쪽 오 점 분석, 그리고 많은 경우에 대상된 채널 단백질을 위한 특정 항 체의 불가능에 의해 방해 된다. 따라서, 녹아웃 마우스 모델의 사용은 여전히 이러한 분석에 대 한 황금 표준으로 간주 됩니다. 엠씨 기능 조사에 대 한 선호 체 외에 모델은 격리 된 비보 전 완전히 성숙한 인구로 서 수 있는 PMCs의 재배 (에서 예를 들어 생체 외에서 MCs 차별 반대., 골 수 세포)10 . 골 수 파생 된 MCs (BMMCs), 또한 일반적으로 엠씨 기능에서 생체 외에서FcεRI와 베타-hexosaminidase 자극을 공부 하는 데 사용 되는 비교 릴리스는 8-fold 고 약에 증가 PMCs, 각각. 이 문서에서는, 우리 격리 하는 방법 및 재배 murine PMCs의 2 주 높은 수가 순수 결합 조직 배양의 MCs, 추가 분석에 대 한 충분 한 입력을 얻을 수 있는 설명 합니다.
개발 및 인코딩된 유전자 칼슘 표시기의 응용 프로그램에서 최근 진행에도 불구 하 고 그들의 사용은 여전히 제한 대상 세포에 유전자의 납품에 어려움에 의해 특히, 기본 교양된 MCs 같은 고도로 전문화 된 세포에서. 또한, 형광 지표 측정을 위해 [캘리포니아2 +]나 의이 그룹은 아직 높은 동적 범위와 비율 염료가 없다. 이러한 이유로, 비율 [캘리포니아2 +]나 측정에 대 한 선호 하는 방법 아직도 형광 염료 "Fura-2"11의 사용 이다.
현재, 가장 일반적으로 사용 되는 접근 MC 활성화의 평가 degranulation β-hexosaminidase 활동의 측정 이다. Β-hexosaminidase, 알레르기 중재자, MCs12에서 일정 비율에 히 스타 민을 공동 출시는 MC과 립 구성 요소 중 하나입니다. Β-hexosaminidase 쉽게 그리고 정확 하 게 측정할 수 microplate 색도계 분석 실험에서 쉽게 감지 colorigenic 제품의 측정 수량을 생산 하는 특정 기질과의 반응을 통해. 이 문서에서는, PMCs degranulation 다양 한 자극에 대 한 응답에서의 분석에 대 한이 기술의 응용 프로그램이 보고 됩니다.
높은 선호도 plasmalemmal IgE 수용 체 (FcɛRI)의 집계 MCs에 주변 세포 외 공간에 분 비과 립 콘텐츠 출시로 이어지는 다양 한 세포내 신호 전달 경로 활성화 합니다. 특정 항 원 뿐만 아니라 다른 많은 자극 immunomodulatory 중재자, 보완 anaphylatoxins 등의 다양 한 배열을 풀어 MCs를 활성화할 수 있습니다 (예., C3a와 C5a)13, vasoconstrictor 펩 티 드 endothelin 1 (ET1)14 , 잘 수많은 양이온 물질 및 pseudoallergic 반응을 자극 하는 약물 (예., icatibant) MRGPRX216에 바인딩하여15 . MRGPR 유도 MCs degranulation에 관련 된 세포내 신호 통로 저조한 FcɛRI 중재 세포내 신호; 비교 특징 이러한 경로 단지 수용 체 식별16후17 지난 몇 년 동안 집중적으로 공부를 시작 했다. 크게, 원형질 막 이온 채널 칼슘 항목 뒤에 MRGPRX2 자극에에서 관련 된 이해 남아 있다. 따라서, 현재 문서는 또한 세포내 칼슘 신호에 초점을 맞추고 및 MCs의 degranulation MRGPR 촉진제와 자극.

<table><tbody><tr><td>RPMI Medium</td><td>Thermo Scientific</td><td>21875034</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Thermo Scientific</td><td>R92157</td><td></td></tr><tr><td>IL-3</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>403-ML</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>Thermo Scientific</td><td>PMC2115</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2272</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>DNP-HSA&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6661</td><td></td></tr><tr><td>Anti-DNP-Antibody&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-8406</td><td></td></tr><tr><td>Penstrep</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Compound 48/80&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2313</td><td></td></tr><tr><td>4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-&amp;beta;-D-glucopyranoside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N9376</td><td></td></tr><tr><td>CoverWell Imaging Chamber</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GBL635051</td><td></td></tr><tr><td>96-Well plate, v-shaped bottom&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>3896</td><td></td></tr><tr><td>96-Well plates, flat bottom</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>Microtiter plate reader with &quot;i-control&quot; software&amp;nbsp;</td><td>Tecan</td><td>Nano Quant, infinite M200 Pro</td><td></td></tr><tr><td>Flat bottom plate&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9657</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Plastic Centrifuge Tubes</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Culture Flasks (25 cm)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>69160</td><td></td></tr><tr><td>Cover slips glasses round; &amp;oslash; 25 mm; No. 1</td><td>Menzel</td><td>CB00250RA1</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>VWR</td><td>631-0696</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Microscope</td><td>Zeiss</td><td>Observer Z1</td><td></td></tr><tr><td>Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil</td><td>Zeiss</td><td>440260-9900</td><td></td></tr><tr><td>HC Filter Set Fura 2&amp;nbsp;</td><td>AHF</td><td>H76-521</td><td></td></tr><tr><td>CCD Camera</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam MRm&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Monochromatic Light Source</td><td>Sutter Instruments</td><td>Lambda DG-4</td><td></td></tr><tr><td>Imaging Acquisition Program</td><td>Zeiss</td><td>AxioVision 4.8.2&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gravity fed solution application system</td><td>Custom Made</td><td>4-channel</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Plastic Centrifuge Tubes</td><td>Sarstedt</td><td>62,554,502</td><td></td></tr><tr><td>Bench Centrifuge</td><td>Heraeus</td><td>Megafuge 1.0R</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of peritoneum-derived mast cells and their functional characterization with ca2+-imaging and degranulation assays

돛대 세포 (MCs), 면역 체계의 일환으로 여러 병원 균에 대 한 호스트를 방어 하 고 알레르기 면역 반응의 개시에 중요 한 역할을 재생 합니다. IgE 바인딩된 높은 선호도 IgE 수용 체 (FcεRI), 뿐만 아니라 다른 여러 가지 수용 체의 자극 표면의 cross-linking를 통해 MCs의 활성화 시작 무료 세포내 캘리포니아2 + 레벨의 상승 ([캘리포니아2 +]난) 그는 염증 및 알레르기 중재자의 출시를 촉진합니다. 분자 성분이 신호 경로에 관련 된 식별은 엠씨 기능의 규칙을 이해 하는 데 중요 합니다. 이 문서에서는, 우리는 murine 결합 조직 유형 복 막 게 하 여 MCs의 고립과 복 MCs (PMCs)의 재배에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법론에 의해 다양 한 녹아웃 마우스 모델에서 MCs의 문화 MC 신호 경로에 관련 된 단백질의 식별에 유용한 접근 방식을 나타냅니다. 또한, 우리 또한 단일 셀 Fura-2는 신뢰할 수 있는 Ca2 + MCs. 형광 기반 모니터링 [캘리포니아2 +]내가 신호의 정량화에 대 한 중요 한 기술으로 이미징에 대 한 프로토콜을 설명 하 고 일반적으로 사용 하는 접근 캘리포니아2 + 신호 이벤트, MC 활성화에 대 한 최대 중요성 이다 칼슘 저장소 운영 항목을 포함 하 여 공부 합니다. MC degranulation의 분석에 대 한 β-hexosaminidase 자료 분석 결과 설명합니다. 모든 3 개의 다른 분 비 하위 집합에 대해 MCs. β-hexosaminidase에서 설명한 degranulation 마커 colorigenic 기판에와 그것의 반응에 의해 쉽게 정해질 수 β-hexosaminidase 문화 매체에 발표의 양을 간주 됩니다 한 결정 플레이트 색도계 분석 이 높은 재현 기술은 비용 효율적인 고 특수 장비를 요구 한다. 전반적으로, 제공 된 프로토콜 높은 수확량을 보여줍니다 일반적인 MC 표면 마커를 표현 하는 MCs의 MCs의 일반적인 형태학 및 phenotypic 기능을 표시 하 고 캘리포니아2 +-secretagogues에 대 한 높은 재현성 응답 시연 이미징 및 degranulation 분석 실험입니다.

PMCs 복 게 여 3 야생 타입 마우스 (C57BL/6N) 으로부터 격리 되었고 추가 보충 RPMI 매체에 교양 20 %FCS 1% 펜-Strep 메 마른에서 성장 인자 (IL-3 10 ng/mL) 및 30 ng/mL에서 SCF의 습도 조건에서 37 ° C, 5% CO2. 매체는 셀 격리 후 2, 9 일에 변경 되었습니다. 셀 형태 전송 사용 하 여 분석 DIC 이미징 빛 ( 그림 1A, B참조). 셀 대비 및 세분성 좋은 세포 생...

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Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

여기, 우리는 격리 하 고 murine 복 막 돛대 세포 배양 프로토콜을 제시. 우리는 또한 그들의 기능 특성에 대 한 두 개의 프로토콜 설명: 출시 된 β-hexosaminidase의 색도계 정량화를 기반으로 하는 무료 세포내 캘리포니아2 + 농도와 degranulation 분석 결과 형광 영상.

복 막 파생 돛대 세포 및 그들의 기능 특성화 캘리포니아2 +의 격리-이미징 및 Degranulation 분석 실험

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

12.2K 조회수.  Ruprecht-Karls Heidelberg University. 여기, 우리는 격리 하 고 murine 복 막 돛대 세포 배양 프로토콜을 제시. 우리는 또한 그들의 기능 특성에 대 한 두 개의 프로토콜 설명: 출시 된 β-hexosaminidase의 색도계 정량화를 기반으로 하는 무료 세포내 캘리포니아2 + 농도와 degranulation 분석 결과 형광 영상.

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Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

심장 기능 면역 세포의 분리

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

연구

면역학 및 감염병학

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly synthesized allergic, inflammatory and immunoregulatory mediators. MCs&#8217; mediators affect multiple tissues and organs culminating in allergic and immune responses. The synthesis, storage and release of the MC mediators are highly regulated. The pre-formed mediators are packed in cytoplasmic secretory granules&#160;(SG) that fuse with the plasma membrane and release their content by regulated exocytosis. We present a protocol, based on the co-expression of a gene of interest with a reporter gene that is targeted to the SGs and is released in a regulated fashion alongside the endogenous SG mediators. The protocol enables high resolution four dimensional confocal analyses of the MC SGs and monitoring their timeline from biogenesis to triggered exocytosis. Thus, using this protocol for screening genes of interest for their phenotypic and functional impact allows deciphering the molecular mechanisms that govern the biogenesis and exocytosis of the MC SGs and identifying the regulators involved. Thereby, further insights into the cellular mechanisms that account for MCs function in health and disease should be provided.

The goal of the present&#160;protocol was to develop a method that will allow functional genomic analyses of mast cell secretion. The protocol is based on quantitative assessment of the release of a fluorescent reporter gene cotrasfected with the gene of interest and real time&#160;analyses of the secretory granule&#39;s morphology.

비만 세포 분비 과립을 조사; 생합성에서 세포 외 유출에

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such as skin, airways and gastrointestinal tract. Best known for their detrimental role in IgE-dependent allergic reactions, MCs have also emerged as important players in host defense against venom and invading bacteria and parasites. MC phenotype and function can be influenced by microenvironmental factors that may differ according to anatomic location and/or based on the type or stage of development of immune responses. For this reason, we and others have favored in vivo approaches over in vitro methods to gain insight into MC functions. Here, we describe methods for the generation of mouse bone marrow-derived cultured MCs (BMCMCs), their adoptive transfer into genetically MC-deficient mice, and the analysis of the numbers and distribution of adoptively transferred MCs at different anatomical sites. This method, named the &#8216;mast cell knock-in&#8217; approach, has been extensively used over the past 30 years to assess the functions of MCs and MC-derived products in vivo. We discuss the advantages and limitations of this method, in light of alternative approaches that have been developed in recent years.

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

We describe a method for the generation of in vitro derived mast cells, their engraftment into mast cell-deficient mice, and the analysis of the phenotype, numbers and distribution of engrafted mast cells at different anatomical sites. This protocol can be used to assess the functions of mast cells in vivo.

'마스트 셀 노크-인' 마우스를사용 하 여 생체 내 비만 세포의 기능 분석

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation

Chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome (CP/CPPS) has a lifetime prevalence of 14% and is the most common urological diagnosis for men under the age of 50, yet it is the least understood and studied chronic pelvic pain disorder. A significant subset of patients with chronic pelvic pain report having experienced early life stress or abuse, which can markedly affect the functioning and regulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis. Mast cell activation, which has been shown to be increased in both urine and expressed prostatic secretions of CP/CPPS patients, is partially regulated by downstream activation of the HPA axis. Neonatal maternal separation (NMS) has been used for over two decades to study the outcomes of early life stress in rodent models, including changes in the HPA axis and visceral sensitivity. Here we provide a detailed protocol for using NMS as a preclinical model of CP/CPPS in male C57BL/6 mice. We describe the methodology for performing NMS, assessing perigenital mechanical allodynia, and histological evidence of mast cell activation. We also provide evidence that early psychological stress can have long-lasting effects on the male urogenital system in mice.

We are measuring perigenital mechanical sensitivity and mast cell activation in the prostate of male C57BL/6 mice that underwent an early life stress paradigm &#8211; neonatal maternal separation, in order to induce a preclinical model of chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome.

신생아 모자 분리의 마우스 모델에서 Perigenital 감도 및 전립선 비만 세포 활성화의 평가

Chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome (CP/CPPS) has a lifetime prevalence of 14% and is the most common urological diagnosis for men under the ...

의학

An Ex vivo Mast Cell Degranulation Assay using Crude Peritoneal Exudate Cells and Natural Antigen Stimulation

Mast cell stabilizers are an essential part of allergy medication. Passive systemic anaphylaxis (PSA) is an animal assay widely used for investigating the effect of a pharmacological agent of interest on mast cells in vivo. As the anaphylactic symptoms are primarily attributed to exocytosis of the granules from mast cells, it is conceived that the agent to cause amelioration of the symptoms has a mast cell stabilizing activity. Despite the fact, it is prudent to confirm the activity by directly demonstrating the decline in the functional activity of mast cells following its treatment. In vitro degranulation assays using an immortalized mast cell line or cultured primary mast cells are routinely employed to that end. The results from the in vitro and in vivo assays may not always be akin to each other; however, as treatment conditions (e.g., treatment dose, time, surrounding environments) for the in vitro assays are often distinct from those for the in vivo assay such as PSA. In pursuit of an in vitro (or ex vivo) assay to reflect more closely the effect of a pharmacological agent on mast cells in vivo, we devised the ex vivo mast cell degranulation assay in which crude peritoneal exudate cells (PECs) isolated from the mice, treated with the agent and administered anti-dinitrophenol (DNP) IgE, were incubated directly with DNP on a carrier protein. It turned out that the assay was not only useful in validating the mast cell stabilizing activity of a pharmacological agent indicated by the in vivo assay but also practical and highly reproducible.

<meta charset="utf8"></head><body>조잡한 복막 삼출액 세포와 자연 항원 자극을 사용한 Ex vivo 비만 세포 탈과립 분석

We have established an ex vivo mast cell degranulation assay carried out by incubating crude peritoneal exudate cells isolated from the mice, treated with a pharmacological agent of interest and administered anti-dinitrophenol (DNP) IgE beforehand, with DNP on a carrier protein.

조잡한 복막 삼출액 세포와 자연 항원 자극을 사용한 Ex vivo 비만 세포 탈과립 분석

Mast cell stabilizers are an essential part of allergy medication. Passive systemic anaphylaxis (PSA) is an animal assay widely used for investigating the ...

Screening Peptides that Activate MRGPRX2 using Engineered HEK Cells

Identifying ligands specific to therapeutically significant cell receptors is crucial for many applications, including the design and development of new therapeutics. Mas related G-protein receptor-X2 (MRGPRX2) is an important receptor that regulates mast cell activation and, thus, directs the general immune response. Numerous ligands for MRGPRX2 have been identified and include endogenous peptides like PAMPs, defensins, LL-37 and other protein fragments (i.e., degraded albumin). Further identification of MRGPRX2 specific ligands requires the screening of a large number of peptides (i.e., peptide library); however, mast cells are difficult and expensive to maintain in vitro and, therefore, not economical to use for screening large numbers of molecules. The present paper demonstrates a method to design, develop, and screen a library of small peptide molecules using MRGPRX2 expressing HEK cells. This cell line is relatively easy and inexpensive to maintain and can be used for in vitro high-throughput analysis. A calcium sensitive Fura-2 fluorescent dye to mark intracellular calcium flux upon activation was used to monitor the activation. The ratio of fluorescence intensity of Fura-2 at 510 nm against excitation wavelengths of 340 and 380 nm was used to calculate calcium concentration. The peptide library used to verify this system was based on the endogenous proadrenomedullin N-terminal 12 (PAMP-12) secretagogue, which is known to bind MRGPRX2 with high specificity and affinity. Subsequent peptides were generated through amino acid truncation and alanine scanning techniques applied to PAMP-12. The method described here is simple and inexpensive yet robust for screening a large library of compounds to identify binding domains and other important parameters that play an important role in receptor activation.

Techniques for generating a library of short peptides that can activate mast cells via the MRGPRX2 receptor are described. Associated techniques are easy, inexpensive, and can be extended to other cell receptors.

엔지니어링 된 HEK 세포를 사용하여 MRGPRX2를 활성화하는 펩티드 스크리닝

Identifying ligands specific to therapeutically significant cell receptors is crucial for many applications, including the design and development of new ...

<meta charset="utf8"></head><body>T 세포에서 Ca2+ 마이크로도메인을 검출하기 위한 고분해능 이미징 기법

Imaging Initial Ca2+ Microdomains in Primary T Cells

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and might already determine the fate of a T cell. Upon T cell receptor activation, NAADP is formed rapidly, binding to NAADP binding proteins (HN1L/JPT2, LSM12) and their respective receptors (RyR1, TPC2) sitting on intracellular Ca2+ stores, like the ER and lysosomes, and leading to subsequent release and elevation of [Ca2+]i. To capture these fast and dynamically occurring Ca2+ signals, we developed a high-resolution imaging technique using a combination of two Ca2+ indicators, Fluo-4 AM and FuraRed AM. For postprocessing, an open-source, semi-automated Ca2+ microdomain detection approach was developed based on the programming language Python. Using this workflow, we are able to reliably detect Ca2+ microdomains on a subcellular level in primary murine and human T cells in high temporal and spatial resolution fluorescence videos. This method can also be applied to other cell types, like NK cells and murine neuronal cell lines.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: Unraveling the Initial Activation of the Adaptive Immune Response for Therapeutic Intervention

Here, we provide a comprehensive protocol to resolve initial local Ca2+ signals, known as Ca2+ microdomains, in primary murine and human T cells using fluorescence microscopy. This protocol serves as a valuable resource for researchers examining Ca2+ signaling pathways within immune cells and to further unravel their function.

일차 T 세포에서 초기 Ca2+ 마이크로도메인 이미징

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and ...

복 막 파생 돛대 세포 및 그들의 기능 특성화 캘리포니아^{2 +}의 격리-이미징 및 Degranulation 분석 실험

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

심장 기능 면역 세포의 분리

비만 세포 분비 과립을 조사; 생합성에서 세포 외 유출에

'마스트 셀 노크-인' 마우스를사용 하 여 생체 내 비만 세포의 기능 분석

신생아 모자 분리의 마우스 모델에서 Perigenital 감도 및 전립선 비만 세포 활성화의 평가

조잡한 복막 삼출액 세포와 자연 항원 자극을 사용한 Ex vivo 비만 세포 탈과립 분석

조잡한 복막 삼출액 세포와 자연 항원 자극을 사용한 Ex vivo 비만 세포 탈과립 분석

엔지니어링 된 HEK 세포를 사용하여 MRGPRX2를 활성화하는 펩티드 스크리닝

일차 T 세포에서 초기 Ca²⁺ 마이크로도메인 이미징

일차 T 세포에서 초기 Ca²⁺ 마이크로도메인 이미징

일차 T 세포에서 초기 Ca²⁺ 마이크로도메인 이미징