오늘, 우리는 펩티드 라이브러리를 선별하는 방법을 시연 할 것이다, 최근 발견 된 마스터 수용체에 대한, 이는 마스 관련 G 단백질 수용체 X2, 또한 MRGPRX2 수용체로 알려진. 비만 세포는 면역 계통의 필수적인 부분이고, 선천적이고 적응적인 면역 반응 둘 다에 있는 중요한 역할을 합니다. 비만 세포는 항원 결합 Fc 엡실론 R1 수용체, 또는 최근에 발견된 X2 수용체에 의해 활성화된다.
표면 바인딩 된 X2 수용체의 활성화는 여러 면역 학적, 및 인화성 질환에 연결되어 따라서, 리간드에이 수용체의 결합 메커니즘을 이해하는 것이 중요하다. 이렇게하기 위해, 우리는 작은 펩티드 분자의 라이브러리를 개발하고, 육각형에 과발현 X2 수용체에 대해 그들을 선별했다. 연구에서 펩티드 라이브러리는 알라닌 스캐닝의 간단하고 다양한 기술과 아미노산 잘림을 사용하여 구성되었습니다.
Heck293은 펩티드와 와이드 타입 육각형으로 활성화될 때 X2 수용체를 발현하는 것이 대조군으로 사용되었다고 말한다. 활성화 시 잘림 방출에서 X2 기반 활성화를 연구하기 위해 모니터링되었습니다. 실험적으로, 후라-2 AM 칼슘 민감염은 340 및 380 나노미터에서 흥분되고, 방출은 510 나노미터에서 기록됩니다.
칼슘 결합시 340나노미터의 형광 강도가 증가하고 380나노미터가 감소합니다. 염료는 340나노미터에서 형광 강도의 비율로 증착된다. 380 비율의 340은, 세포내 칼슘에 비례하며, 그값은 Grynkiewicz 방정식에 의해 계산될 수 있다.
2개의 형광 강도의 탭 비율, 희석, 광표백, 염료 누설 및 향기 밀도와 같은 실험적인 요인의 효력이 검출됩니다. 따라서 더 이상 지체없이 실험을 시작합시다. 마스트 셀 MRGPR X2 수용체의 리간드를 식별하기 위해, 발전기 N-Truncated, C-Truncated 및 N+C-Truncated 펩티드 라이브러리, 팸-12 오방의 N 단말, C-터미널 및 N+C 단말 아미노산을 절단하여.
고체 상 펩티드 합성을 사용하여 펩티드를 합성합니다. 최종 단단을 설정된 조수 그룹으로 수정하고 C 단말은 아마데 그룹으로 수정합니다. 생성 및 알라닌은 알라닌에 의해 팜-12의 각각의 아미노산을 교체하여, 펩티드 라이브러리를 펩티드 할 수 있습니다, 한 번에 하나.
최종 단단을 세티드 그룹으로 수정하고 C 단말은 아마데 그룹으로 수정합니다. 높은 포도당 DMEM을 보충 하 여 배양 매체를 준비, 와 10% 태아 소 혈 청, 2 밀리 모 렐라 L-글루타민, 페니실린의 ml 당 백 단위, 그리고 백 마이크로 그램, 연쇄 절제술의 ml 당. 티 고소 배양 특성의 세포 외에, 375 배양 플라스크 에서 섭씨 37도, 5%CO2, 그들은 75 받는 르 80%의 컨캔트 될 때까지.
일단 75%의 컨리치, 세포를 씻고 2~3ml의 Proof-C를 추가하여 세포를 분리합니다. 세포가 분리되면 Proof-C에서 세포를 수집합니다. 신선한 중간 크기로 6~9ml를 추가합니다.
세포를 1620g에서 3~5분 동안 원심분리합니다. 원심 분리 후, 펠릿을 수집하기 위해 상체를 폐기하십시오. 신선한 배양 배지에서 세포를 다시 중단합니다.
원하는 농도에 따라 세포를 희석시. 200, 000 세포의 농도를 가진 세포 현탁액의 200 마이크로리터에서, 잘 당 40, 000 세포를 추구하기 위해 각 우물에 암본을 부어. 섭씨 37도, CO2 인큐베이터 5%에서 24시간 동안 세포를 보호합니다.
실험을 위해 후라-2 AM 염료를 사용합니다. 50 마이크로그램 후라-2 AM에 50 마이크로리터 DMSO를 추가하여 후라-2 AM 염료의 1밀리미터 스탁 용액을 준비합니다. 1개의 마이크로몰러 염료 농도의 희석 매체를 준비하기 위하여 신선한 매체의 ml 당 1 개의 밀리머 Fura-2 AM 염료1개를 추가합니다.
인큐베이터에서 96웰 플레이트를 제거하고 배지를 폐기합니다. 매체를 신선한 희석 매체로 교체합니다. 각 웰에 희석 매체200 마이크로리터를 추가합니다.
세포는 섭씨 37도, CO2 인큐베이터 5%에서 30-40분 동안 배양합니다. 세포가 배양되는 동안 플레이트 판독기를 설정합니다. 온도를 섭씨 37도로 설정합니다.
설정에서 플렉스를 선택합니다. 읽기 모드를 형광 및 하단 읽기로 설정합니다. 파장에서 파장의 수를 2개로 설정합니다.
340 나노미터 및 380 나노미터로 흥분을 설정합니다. 배출을 510 나노미터로 설정합니다. 기본값에 대한 감도를 둡니다.
타이밍에서 간격을 3.9초로 설정합니다. 실행 시간을 94초로 설정하여 25개의 읽기 번호를 가져옵니다. 다음으로 분석 플레이트 유형을 선택합니다.
다음으로 읽을 우물을 선택합니다. 복합 전달에서 1개, 초기 볼륨으로 1개 마이크로리터로 전송을 설정합니다. 파이펫 높이를 백 마이크로리터로 설정하고, 볼륨을 50 마이크로리터로 설정하고, 타임포인트를 36초로 설정하여 화합물을 추가하고 판독을 경향합니다.
다음으로, 컴파운드 소스 플레이트 유형을 선택한다. 트리튜레이트를 사용하지 않도록 둡니다. 팁 및 파이펫 팁 레이아웃을 선택합니다.
화합물 및 팁 컬럼의 경우 화합물은 컬럼 에서 복합 플레이트 중 하나에서 전달됩니다. 팁 열을 하나로 설정하고 복합 열을 하나로 설정합니다. 자동 보정을 On.click OK로 둡니다. 40분 동안 인큐베이션을 한 후 배지를 제거합니다.
XDB 버퍼로 셀을 세척합니다. 형광 판독을 위해 XDB 버퍼의 수백 마이크로리터를 추가합니다. 형광 판독을 위해 접시를 가져 가라.
프리칫이 섭씨 37도에 도달하면 판독실을 눌러 분석판을 형광판 판독기에 넣습니다. 소스를 눌러 복합 플레이트를 넣습니다. X 솔루션을 돌리기 위해 존경받는 펩타이드 이오노마이신과 EGTA의 200 마이크로리터를 추가하여 화합물 플레이트를 준비합니다.
팁 프랫을 눌러 팁 상자를 넣습니다. 팁 자동 형광을 피하기 위해 검은 색 팁을 사용합니다. 일단 플레이트가 보관되고 소프트웨어 의 설정을 사용하고 읽기를 누릅니다.
그린키에비츠 방정식에 의해 형광비율에서 칼슘 농도를 결정한다. 선보이는 팸 좋은 펩티드의 형광 데이터입니다. 볼 수 있듯이, 펩티드를 첨가한 후 36초만에, 340나노미터에서 형광은 380나노미터의 기록감소에 의해 루금이 증가한다.
데이터는 340의 비율로 표현되며, 380 신호의 데이터입니다. 그들은 펩티드 추가 후 신호 증가의 표시. 이 수치는 펩티드 활성화를 위한 대표적인 데이터이다.
도 A는 펩타이드 활성화에 대한 형광 신호를 나타낸다. 표현 데이터는 ado에 의해 도시된 바와 같이, 연약 사이클에 대한 기준선을 만든 후 cram12 펩티드가 첨가되었다. 도 B는 340 나노미터에서 발아 후 형광 방출의 비율을 나타내며, 380 나노미터에서 발아 후 형광 방출의 비율을 나타낸다.
이 그림은 빈에 대한 대표 데이터입니다. 그림 A는 빈에 대한 형광 신호를 나타낸다. HTB는 아도에 의해 표시된 바와 같이 10 공급 주기에 대한 기준선을 희석 한 후 추가되었습니다.
도 B는 380 나노미터에서 발아 후 생동감 방출의 340 나노미터에서 발아 후 형광 방출의 배급을 나타낸다. 이 수치는 염료 교정 표준에 대한 대표 데이터입니다. 그림 A는 10번째 판독값에 이오노마이신이 추가되었다는 것을 보여 주며, 아도가 도시한 바와 같이 캐셈 바운드 상태에서 최대 형광을 얻을 수 있다.
EGPA 트리톤 X 백은 최소 신호를 얻는 아도에 의해 표시된 대로 20 판독 후에 추가되었습니다. 도 B는 380 나노미터에서 발아 후 형광 방출의 340 나노미터에서 발아 후 형광 방출의 비율을 나타낸다. 이러한 값은 집중의 세포 내 캐시를 얻기 위해 Grynkiewicz 방정식에 더 넣어.
이 그림은 서열 및 순도를 확인하기 위해 대표 펩타이드의 특성화를 보여줍니다. 도 A는 대표적인 펩티드 서열WNK WAL의 수직 질량이 857.90염료 얇아졌다는 것을 나타낸다. 질량 분광법에서 제드 비율을 통해 N에 의해 표시됩니다.
도 B는 HPLC에 의해 확인된 바와 같이 99%의 펩티드 순도를 나타낸다. 이 펩티드는 N+C-잘린 펩티드 라이브러리에 속한다. 결론적으로, 여기서 설명된 방법은 마지막 스케일 칼슘 기반 스크리닝을 위해 효율적이고 밝을 수 있는 쉽고 다재다능하다.
그러나 데이터의 품질을 결정하는 몇 가지 요인이 있으므로 메이크업은 주어진 셀 악기 시스템에 최적화되어야 합니다. 감사합니다.
