이 연구는 네덜란드 기술 재단 STW (12385), 네덜란드 조직에 대 한 과학적 연구 (NWO)의 부분 이다 고는 부분적으로 경제 통상 부 (OTP 부여 12385 ms)에 의해 자금이 지원 됩니다.  우리는 pCH20, BIBAC-GW 벡터의 등뼈를 제공 하기 위한 캐롤 M. 해밀턴 (코넬 대학, 미국) 감사 합니다.

<ol>
	<li>Jorgensen, R. A., Cluster, P. D., English, J., Que, Q., Napoli, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chalcone+synthase+cosuppression+phenotypes+in+petunia+flowers:+comparison+of+sense+vs.+antisense+constructs+and+single-copy+vs.+complex+T-DNA+sequences.">Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences.</a> Plant Mol Biol. 31 (5), 957-973 (1996).</li><li>Stam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+silencing+of+chalcone+synthase+in+Petunia+by+inverted+transgene+repeats.">Post-transcriptional silencing of chalcone synthase in Petunia by inverted transgene repeats.</a> Plant J. 12, 63-82 (1997).</li><li>Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N., Kooter, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position-dependent+methylation+and+transcriptional+silencing+of+transgenes+in+inverted+T-DNA+repeats:+implications+for+posttranscriptional+silencing+of+homologous+host+genes+in+plants.">Position-dependent methylation and transcriptional silencing of transgenes in inverted T-DNA repeats: implications for posttranscriptional silencing of homologous host genes in plants.</a> Mol Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).</li><li>Jin, Y., Guo, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgene-induced+gene+silencing+in+plants.">Transgene-induced gene silencing in plants.</a> Methods Mol Biol. 1287, 105-117 (2015).</li><li>Oltmanns, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Backbone-Free,+Low+Transgene+Copy+Plants+by+Launching+T-DNA+from+the+Agrobacterium+Chromosome+1[W][OA].">Generation of Backbone-Free, Low Transgene Copy Plants by Launching T-DNA from the Agrobacterium Chromosome 1[W][OA].</a> Plant Physiol. , (2010).</li><li>Ye, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+production+of+single+copy+backbone-free+transgenic+plants+in+multiple+crop+species+using+binary+vectors+with+a+pRi+replication+origin+in+Agrobacterium+tumefaciens.">Enhanced production of single copy backbone-free transgenic plants in multiple crop species using binary vectors with a pRi replication origin in Agrobacterium tumefaciens.</a> Transgenic Res. , (2011).</li><li>Hamilton, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+binary-BAC+system+for+plant+transformation+with+high-molecular-weight+DNA.">A binary-BAC system for plant transformation with high-molecular-weight DNA.</a> Gene. 200 (1-2), 107-116 (1997).</li><li>Frary, A., Hamilton, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+and+stability+of+high+molecular+weight+DNA+transformation:+an+analysis+in+tomato.">Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato.</a> Transgenic Res. 10 (2), 121-132 (2001).</li><li>Vega, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+maize+(Zea+mays)+with+Cre-lox+site+specific+recombination+cassettes+in+BIBAC+vectors.">Agrobacterium-mediated transformation of maize (Zea mays) with Cre-lox site specific recombination cassettes in BIBAC vectors.</a> Plant Mol Biol. 66 (6), 587-598 (2008).</li><li>Anggoro, D. T., Tark-Dame, M., Walmsley, A., Oka, R., de Sain, M., Stam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BIBAC-GW-based+vectors+for+generating+reporter+lines+for+site-specific+genome+editing+in+planta.">BIBAC-GW-based vectors for generating reporter lines for site-specific genome editing in planta.</a> Plasmid. 89, 27-36 (2017).</li><li>Hamilton, C. M., Frary, A., Lewis, C., Tanksley, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+transfer+of+intact+high+molecular+weight+DNA+into+plant+chromosomes.">Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant chromosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9975-9979 (1996).</li><li>Belele, C. L., Sidorenko, L., Stam, M., Bader, R., Arteaga-Vazquez, M. A., Chandler, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+tandem+repeats+are+sufficient+for+paramutation-induced+trans-generational+silencing.">Specific tandem repeats are sufficient for paramutation-induced trans-generational silencing.</a> PLoS Genet. 9 (10), e1003773 (2013).</li><li>Shizuya, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+stable+maintenance+of+300-kilobase-pair+fragments+of+human+DNA+in+Escherichia+coli+using+an+F-factor-based+vector.">Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (18), 8794-8797 (1992).</li><li>Shi, X., Zeng, H., Xue, Y., Luo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pair+of+new+BAC+and+BIBAC+vectors+that+facilitate+BAC/BIBAC+library+construction+and+intact+large+genomic+DNA+insert+exchange.">A pair of new BAC and BIBAC vectors that facilitate BAC/BIBAC library construction and intact large genomic DNA insert exchange.</a> Plant Methods. 7, 33 (2011).</li><li>Woodman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+PCR+of+Intact+Bacteria+(Colony+PCR).">Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR).</a> Curr Protoc Microbiol. , A.3D.1-A.3D.7 (2016).</li><li>Ausubel, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mol+Biol.">Mol Biol.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 1, (2003).</li><li>Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+method+for+the+preparation+of+plant+genomic+DNA+for+PCR+analysis.">A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis.</a> Nucleic Acids Res. 19 (6), 1349 (1991).</li><li>Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cetyltrimethyl+ammonium+bromide+(CTAB)+DNA+miniprep+for+plant+DNA+isolation.">Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) DNA miniprep for plant DNA isolation.</a> Cold Spring Harb Protoc. (3), (2009).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+Gel+Electrophoresis+for+the+Separation+of+DNA+Fragments.">Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923 (2012).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. , (2012).</li><li>Sosa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatography+with+Sephadex+Gels.">Chromatography with Sephadex Gels.</a> Anal Chem. 52 (6), 910-912 (1980).</li><li>Depicker, A., Stachel, S., Dhaese, P., Zambryski, P., Goodman, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nopaline+synthase:+transcript+mapping+and+DNA+sequence.">Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence.</a> J Mol Appl Genet. 1 (6), 561-573 (1982).</li><li>Feng, J., Vick, B. A., Lee, M. K., Zhang, H. B., Jan, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+BAC+and+BIBAC+libraries+from+sunflower+and+identification+of+linkage+group-specific+clones+by+overgo+hybridization.">Construction of BAC and BIBAC libraries from sunflower and identification of linkage group-specific clones by overgo hybridization.</a> Theor Appl Genet. 113 (1), 23-32 (2006).</li><li>Lee, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+plant-transformation-competent+BIBAC+library+and+genome+sequence+analysis+of+polyploid+Upland+cotton+(Gossypium+hirsutum+L).">Construction of a plant-transformation-competent BIBAC library and genome sequence analysis of polyploid Upland cotton (Gossypium hirsutum L).</a> BMC Genomics. 14, 208 (2013).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+insert+Thellungiella+halophila+BIBAC+library+for+genomics+and+identification+of+stress+tolerance+genes.">A large insert Thellungiella halophila BIBAC library for genomics and identification of stress tolerance genes.</a> Plant Mol Biol. 72 (1-2), 91-99 (2010).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+BAC-+and+BIBAC-based+physical+map+of+the+soybean+genome.">A BAC- and BIBAC-based physical map of the soybean genome.</a> Genome Res. 14 (2), 319-326 (2004).</li><li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+physical+mapping+from+large-insert+clones+by+fingerprint+analysis+with+capillary+electrophoresis:+a+robust+physical+map+of+Penicillium+chrysogenum.">Genome physical mapping from large-insert clones by fingerprint analysis with capillary electrophoresis: a robust physical map of Penicillium chrysogenum.</a> Nucleic Acids Res. 33 (5), e50 (2005).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+physical+mapping+of+polyploids:+a+BIBAC+physical+map+of+cultivated+tetraploid+cotton,+Gossypium+hirsutum+L.">Genome physical mapping of polyploids: a BIBAC physical map of cultivated tetraploid cotton, Gossypium hirsutum L.</a> PLoS One. 7 (3), e33644 (2012).</li><li>Frary, A., Hamilton, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+and+stability+of+high+molecular+weight+DNA+transformation:+An+analysis+in+tomato.">Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: An analysis in tomato.</a> Transgenic Res. , (2001).</li><li>Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N. M., Kooter, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position-Dependent+Methylation+and+Transcriptional+Silencing+of+Transgenes+in+Inverted+T-DNA+Repeats:+Implications+for+Posttranscriptional+Silencing+of+Homologous+Host+Genes+in+Plants.">Position-Dependent Methylation and Transcriptional Silencing of Transgenes in Inverted T-DNA Repeats: Implications for Posttranscriptional Silencing of Homologous Host Genes in Plants.</a> Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).</li><li>G&#322;owacka, K., Kromdijk, J., Leonelli, L., Niyogi, K. K., Clemente, T. E., Long, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+new+and+established+methods+to+determine+T-DNA+copy+number+and+homozygosity+in+transgenic+plants.">An evaluation of new and established methods to determine T-DNA copy number and homozygosity in transgenic plants.</a> Plant Cell Environ. 39 (4), 908-917 (2016).</li><li>Stefano, B., Patrizia, B., Matteo, C., Massimo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverse+PCR+and+Quantitative+PCR+as+Alternative+Methods+to+Southern+Blotting+Analysis+to+Assess+Transgene+Copy+Number+and+Characterize+the+Integration+Site+in+Transgenic+Woody+Plants.">Inverse PCR and Quantitative PCR as Alternative Methods to Southern Blotting Analysis to Assess Transgene Copy Number and Characterize the Integration Site in Transgenic Woody Plants.</a> Biochem Genet. 54 (3), 291-305 (2016).</li></ol>

저자 아무 경쟁 금융 관심사 또는 다른 충돌을 선언합니다.

생성에 중요 한 제 닉은 transgene의 단일, 그대로 통합으로 사용 되는 이진 벡터의 선택입니다. BIBAC 가족 벡터 많은 식물 종23,,2425,26,,2728관심사의 순서를 전달 하기 위해 사용 되었습니다. BIBAC 벡터, BIBAC-GW를 포함 하 여 높은 효율으로 단일 복사 통합 항복: 줄 삽입의 평균 수는 1.5 ~ 2, 3 또는 더 높은 가장 일반적으로 사용 되는 이진 벡터5,9, 에 대 한 비교 29. BIBAC GW 벡터 함께 다른 BIBAC 벡터에 비해 주요 개선으로 관심의 시퀀스 삽입 될 수 있다 쉽게 게이트웨이 재결합 사이트12를 사용 하 여. BIBAC 벡터 기존의 복제 전략에서 사용 될 때의 일반적인 문제를 극복 하는 수정 된 벡터: i) 고유 제한 사이트 및 ii) 낮은 DNA의 매우 제한 된 수를 얻을. 게이트웨이 재결합 사이트 BIBAC GW 벡터 유전자 변형 식물을 생성 하기 위한 다른 이진 벡터 매력적인 대안을 만들.
여기 BIBAC GW의 시퀀스를 포함 하는 파생 상품 공장 변환, 및 DNA 오 점 수와 유전자 변형 시퀀스의 intactness에 대 한 분석을 생성 프로토콜의 일련 설명 합니다. 프로토콜의 몇몇이 종이에서 보고 게이트웨이 복제, electroporation 박테리아, 및 공장 변환의 많은 실험실에서 일반적인 관행 있으며 또한 약간의 수정을 실시 수 있습니다. 그것은 BIBAC GW 대장균 A. tumefaciens에 단일 복사 벡터 인지 해야 합니다. 따라서, DNA를 분리 하는 경우 수익률은 낮은; 격리 프로시저를 확장 하는 것이 좋습니다.
제 닉 들고 여러 T DNA 통합, 도입된 transgenes 유전자1,2,,430, 입을 자주 대상이 고 따라서 대부분의 응용 프로그램에 대 한 피해 야 한다. 단일, 그대로 통합으로 유전자 변형 식물을 식별, DNA 오 점 분석을 사용 하는 것이 좋습니다. DNA 외의 방법을 동안 blotting에 사용할 수 있습니다 T DNA 복사 번호와 유전자 변형 라인에 T DNAs의 무결성 확인 (분리 분석, 꼬리 PCR, 정량 PCR (정량), 및 디지털 물방울 PCR) 노동 집약, DNA blotting는 종종 있지만, 선택의 방법입니다. 분리 분석은 여러 사이 분화 할 수 및 단일 loci에서 T DNA 통합 단일. 꼬리-PCR 자주 아래 견적 복사본 번호, 이상의 T DNA 통합은 현재31및 정량 신뢰할 수 있는 결과31,32에 대 한 정교한 최적화를 필요로 하는 경우에 특히. 디지털 물방울 PCR 필요한 장비는 사용할 수31경우 복사 번호 검색에 대 한 보다 정확한 방법입니다. DNA blotting의 추가 혜택은 쉽게 모든 PCR 기반 기술에서 놓친 잘린된 T DNAs의 손쉬운 검색.
DNA 오 점 분석, 오 점에 교배 시킨 조각 신호 크기에 잘 식별 될 필요가. 여러 가지 요인 DNA blotting의 결과 영향을 미치는 알려져 있습니다. 제한 효소 ( 그림 4에 표시 된 전략)의 적절 한 선택 이외에 크기 마커, 좋은 품질의 충분 한 DNA가 필요. 게놈 애기 DNA의 2 µ g 잘 식별 조각 생성 하지 것입니다. 다룰 때 더 큰 게놈, 더 많은 DNA가 필요 합니다. 애기 DNA의 충분 한 양을 얻기 위해 꽃 조직 또는 1 주 오래 된 묘 목은 사용할 수 있습니다. 한 페 트리 접시에 성장 하는 묘 목의 배치는 2-8 µ g의 DNA 생성 합니다. 격리 하는 동안 DNA 저하를 방지 하기 위해 해야 주의 빠른 식물 재료를 처리. 또한, 게놈 DNA nucleases로 트리 스-EDTA의 저하를 줄이기 위해에 resuspended 고 4 ° C에서 저장 보다는-20 ° C로 인해 DNA nicking 방지 하기 위해 동결-해 동 주기를 반복. 확실 모든 DNA 샘플 완전히 소화를 하는 경우 그것은 내 생, 독특한 게놈 지역 인식 조사와 DNA 오 rehybridize 하 좋습니다. 유전자 변형 또는 생 시퀀스를 식별 하기 위한 프로브 시퀀스를 선택할 때만 독특한 시퀀스 선택 결정적 이다. 교배 파편의 크기를 정확 하 게 결정할 수 있을을 DNA의 위치 젤 슬롯 및 DNA 마커 밴드 표시 되어야 합니다 (그림 5B) 투명성에 Ethidium 평범한 사람 얼룩이 젤 (그림 5A)를 시각화 하는 경우는 UV에 transilluminator입니다. 마커 시퀀스 프로브 DNA, 교배 하지 않습니다 또는 교 잡 부분, 경우에 파편을 교배 시키기의 크기를 추적할 수 있는 유일한 방법입니다.
주의 좋은 교 잡 신호 및 조각 크기의 견적을 달성 하기 위해, 일단 더 럽 히는 결과의 해석은 간단 합니다. 한 제한 효소를 사용 하 여 및 다른 교배 시키기 프로브 중 하나를 감지 T-DNA의 왼쪽 또는 오른쪽 부분, 감지 된 조각 수 T DNA 삽입의 수를 반영 합니다. 예를 들어, 그림 7B, C 표시는 동일한 DNA 오 바 (그림 7B)와 향상 된 노란 형광 성 단백질 (eYFP) (그림 ℃), 그림 7A에 표시 하는 전략을 사용 하 여 다른 프로브 때 교배. 4를 제외 하 고 모든 차선 두도 말에 파편의 동등한 수 표시: 6 호선 및 다른 모든 라인에 대 한 단일 조각을 두 조각. 검색 된 파편의이 수 T DNA 삽입 수가입니다.
조각 수 감지 프로브 바인딩 중 하나를 왼쪽 또는 T-DNA의 오른쪽 부분 ( 그림 7BC, 4 호선)에 관해서는 다르다 때 불완전 한 삽입은 존재, 또는 T-DNAs 탠덤 배열에 삽입. 탠덤 삽입 (그림 4A, 오른쪽 패널), T-DNA 파편 중 하나에 대 한 비-무작위 조각 길이 표시 하 고 제한 전략에 따라 예상 교배 조각 크기 비교 하 여 확인할 수 있습니다. 추가 하 고 더 럽 히는 전략 T DNA 삽입의 탠덤 배열 확인 필요할 수 있습니다. 4 (그림 7B, C)에 표시 된 샘플에서 두 삽입 거꾸로 반복 방향에 정렬 됩니다.
견적 할 때 T-DNA, 또는 그것의 일부의 intactness, 교배 시킨 조각의 길이 수 수에 따라 계산 제한 전략. 예상된 크기에서 어떤 편차는 불완전 한 삽입의 존재를 나타냅니다. 예를 들어, 그림 7D에 차선 4, 교배 시킨 조각이 마이그레이션합니다 8 kbp, (예상된 5.5 kbp) 대신 나타내는 제한 사이트 중의 부족으로 인해 증가 조각 크기에.
BIBAC GW 벡터는 다양 한 종의 식물에에서 그대로 통합 단일 복사본을 생성 하기 위한 훌륭한 도구입니다. 여기 보고 프로토콜 관심의 transgene의 단일, 그대로 통합으로 식물을 식별 하기 위해 신뢰할 수 있는 절차를 제공 합니다.

유전자 변형 식물을 생성할 때 일반적으로 목적은 안정적으로 표현 하는 통합된 transgene(s) 것입니다. 이 transgene의 그대로 단일 복사본 통합 하 여 얻을 수 있습니다. 여러 통합은 transgene의 증가 표현 뿐만 아니라 유전자 입을 발생할 수 있습니다. Transgenes의 입을 경우 삽입된 시퀀스 협동 또는 거꾸로 반복1,2,,34에서 배열 된다 확률이 높다. 이진 벡터 Agrobacterium에 셔틀으로 이용 된다-식물 게놈으로 관심의 시퀀스를 제공 하는 변환 실험을 중재. 식물 게놈으로 통합의 수 Agrobacterium tumefaciens5,6. 이진 벡터의 복사본 수에 따라 달라 집니다. 많은 일반적으로 사용 되 이진 벡터는 높은 복사 벡터 및 따라서 높은 평균 transgene 복사본 수를 산출: 애기53.3 4.9 복사본.
BIBAC7또는 T-DNA A. tumefaciens 염색체5에서 시작 하 여 낮은 복사 번호 A. tumefaciens에 있는 이진 벡터를 사용 하 여 T-DNA 통합의 수를 낮출 수 있습니다. 이러한 경우 transgene 통합의 평균 수는 25,8,,910아래입니다. 따른 단일-복사 A. tumefaciens 에 대장균에서 BIBAC 파생 상품 수 유지 및 구문 150 kb11로 제공.
GW 호환 BIBAC 벡터10,12 게이트웨이 복제를 사용 하 여 벡터에 관심사의 유전자의 도입에 쉽게 수 있습니다. 게이트웨이 기술 사용 하 여 복제 프로시저를 단순화 하지만 또한 큰 낮은 복사 번호 벡터13,14, 낮은 DNA 수율 등 독특한 제한의 제한 된 선택과 관련 된 일반적인 문제를 극복 7,11복제에 사용할 수 있는 사이트. PBIBAC-GW 파생 상품 Glufosinate 염화 (pBIBAC-바-GW) 어느 저항 또는 DsRed 형광 씨 외 투 (pBIBAC-RFP-GW) 식물 (그림 1)10,12선택에 사용할 수 있습니다. 두 벡터에 대 한 대 저항 유전자는 박테리아에서 선택 마커로 사용 됩니다.
PBIBAC-GW 벡터 결합: (1) 쉬운 디자인 및 유전자 조작 대장균및 (2) 그대로 단일 복사 통합에서 planta에 높은 효율에. 들고 단일 유전자 변형 식물의 약 절반으로 애기 에 평균 1.7 통합에 pBIBAC GW 벡터 수확량은 통합 T DNA10.
안정적인 표현의 transgenes 대부분 제 닉 생성에 대 한 요구 사항입니다. 안정적인 transgene 식 그대로, 단일 복사 통합 하 여 얻을 수 있습니다. 그러나 유전자 변형 식물 그대로, 단일 복사 통합 운반 작업은,, 훨씬 더 중요 한 경우 예를 들어 목표 mutagenesis, 재결합, 또는 복구, 등 이러한 의존 chromatin 기반 프로세스의 효율성을 연구 하는 것입니다 genomic 위치 및 삽입 사이트에서 chromatin 구조에 처리 합니다. 우리의 관심 지역의 게놈 문맥에 의존 oligonucleotide 감독 mutagenesis (ODM)의 공부 mutagenesis 취재 원 유전자의 손상, 단일 복사 통합 기자 라인의 집합 생성된 (그림 2)10이었다. 이 일련의 줄을 사용 하 여, 보였다 ODM 효율 되 고 오히려 유사한 transgene 식 수준에도 불구 하 고 다른 genomic 위치의 통합 유전자 변형 loci 사이 변화 한다.

<table><tbody><tr><td>Kanamycin sulphate monohydrate</td><td>Duchefa</td><td>K0126</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin sulphate</td><td>Duchefa</td><td>G0124</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Duchefa</td><td>R0146</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>T-3383</td><td></td></tr><tr><td>DB3.1 competent cells</td><td>Thermo Scientific - Invitrogen</td><td>11782-018</td><td>One Shot &lt;em&gt;ccdB&lt;/em&gt; Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) by Invitrogen or any other ccdB resistant &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; strain can be used instead&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DH10B competent cells</td><td>Thermo Scientific - Invitrogen</td><td>18290-015</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR clonase enzyme mix&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific - Invitrogen</td><td>11791-019</td><td></td></tr><tr><td>tri-Sodium citrate dihydrate</td><td>Merck</td><td>106432</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodium dihydrate</td><td>Duchefa</td><td>E0511</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>Bacto tryptone</td><td>BD</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Honeywell Fluka</td><td>13423</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Merck</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose monohydrate</td><td>Merck</td><td>108346</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation Cuvettes, 0.1 cm gap</td><td>Biorad</td><td>1652089</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator Gene Pulser</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate</td><td>Calbiochem</td><td>442613</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Maltose monohydrate 90%</td><td>Acros Organics</td><td>32991</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>Silwet L-77</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0138454</td><td></td></tr><tr><td>Murashige Skoog medium</td><td>Duchefa</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Glufosinate-ammonium (Basta)</td><td>Bayer</td><td>79391781</td><td></td></tr><tr><td>Restriction enzymes</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>Bio-Rad</td><td>1610433</td><td></td></tr><tr><td>Electrophoresis system</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Merck</td><td>106498</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Merck</td><td>100316</td><td></td></tr><tr><td>Blotting nylon membrane Hybond N+</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15358</td><td>or GE Healthcare Life Sciences (RPN203B)</td></tr><tr><td>Whatman 3MM Chr blotting paper</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>3030-931</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0181</td><td></td></tr><tr><td>Acetylated BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2518</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Merck</td><td>805740</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50 Coarse</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17004401</td><td>or Sephadex G-50 Medium (17004301)</td></tr><tr><td>Dextran sulfate sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate&amp;nbsp;</td><td>US Biological</td><td>S5010</td><td></td></tr><tr><td>Salmon Sperm DNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7656</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dihydrogen phosphate monohydrate</td><td>Merck</td><td>106346</td><td></td></tr><tr><td>Storage Phosphor screen and casette</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9564-74</td><td></td></tr><tr><td>Phosphor imager</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>Typhoon FLA 7000</td><td></td></tr><tr><td>UV Crosslinker</td><td>Stratagene</td><td>Stratalinker 1800</td><td></td></tr><tr><td>cling film (Saran wrap)</td><td>Omnilabo</td><td>1090681</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Thermo Scientific - Invitrogen</td><td>16500</td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Merck</td><td>100165</td><td></td></tr><tr><td>DNA marker &amp;lsquo;Blauw&amp;rsquo;; DNA ladder.</td><td>MRC Holland</td><td>MCT8070</td><td></td></tr><tr><td>DNA marker &amp;lsquo;Rood&amp;rsquo;; DNA ladder</td><td>MRC Holland</td><td>MCT8080</td><td></td></tr><tr><td>Hexanucleotide Mix</td><td>Roche</td><td>11277081001</td><td></td></tr><tr><td>Large-Construct Kit</td><td>Qiagen</td><td>12462</td><td></td></tr><tr><td>Heat-sealable polyethylene tubing, clear</td><td>various providers</td><td></td><td>the width of the tubing should be wider than that of blotting membrane</td></tr><tr><td>Heat sealer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membrane filter disk</td><td>Merck</td><td>VSWP02500</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Merck</td><td>105833</td><td></td></tr><tr><td>Hybridization mesh</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>RPN2519</td><td></td></tr></tbody></table>

generating transgenic plants with single-copy insertions using bibac-gw binary vector

유전자 변형 식물을 생성할 때 일반적으로 목표는 transgene의 안정적인 식 것입니다. 이 transgene의 단일, 그대로 통합 다중 복사 통합 유전자 입을 대상이 종종 필요 합니다. 다른 pBIBAC 파생 상품 같은 세균성 인공적인 염색체 (pBIBAC-GW)에 따라 게이트웨이 호환 이진 벡터 고효율 단일 카피 transgenes의 삽입을 수 있습니다. 원래 pBIBAC에 개선으로 게이트웨이 카세트는 되었습니다 복제 pBIBAC GW에 관심의 시퀀스 지금 통합 될 수 있다 쉽게 벡터 전송 DNA (T-DNA)에 게이트웨이 복제 하 여 그렇게. 일반적으로, pBIBAC GW와 변환 결과 0.2-0.5 효율 %, 그것에 의하여는 제 닉의 T-DNA의 본래 단일 복사 통합 수행. PBIBAC-GW 벡터 Glufosinate 염화에 저항 또는 선택 식물, 씨 외 투에서 DsRed 형광와 저항 대에 박테리아에서 선택 항목으로 사용할 수 있습니다. 여기, 프로토콜의 시리즈 pBIBAC GW를 사용 하 여 유전자 변형 식물 생성의 과정을 통해 독자를 안내 하는 표시 됩니다: 진상을 공장 로 변환 하는 선택의 pBIBAC GW 벡터에 관심의 시퀀스에서 시작 Agrobacterium, 제 닉, 그리고 테스트 DNA 럽을 사용 하 여 삽입의 intactness 및 복사 번호에 대 한 식물의 선택. 주의는 DNA 더 럽 히 전략을 인식 하는 단일 및 다중 loci에서 단일 및 다중 복사 통합 주어 집니다.

BIBAC-GW 시스템을 사용 하 여, 식물에서 ODM을 공부 기자 구문이 생성된10했다. 구문을은 게이트웨이 항목 벡터 pENTR gm12 설계 되었고에 pBIBAC-바-GW (그림 1) 게이트웨이 LR 재결합 반응을 사용 하 여 삽입.
애기는 pDM19, BIBAC-바-GW 플라스 변환 정지 codon 위치 120 eYFP 독서 프레임에 운반 한 mTurquoise eYFP 기자와 함께 변형 되었다 (mTurquoise2-eYFP * 40) (그림 2)10. 총에서 126 애기 식물은 변형된 (냄비, 냄비 14 당 9 식물) 이었다. 이 식물의 씨앗 풀링, 흙, 쟁반에 뿌린 되었고 Glufosinate 염화 솔루션 치료 전에 2 주 동안 성장 수 있습니다. 모 종만 (BIBAC-바-GW에 존재) 바 유전자 표현 살아남을 Glufosinate 염화 치료 (그림 3). 총, 11 제 닉 pDM19로 변형 분석 씨앗의 0.02%의 변환 효율에 확인 되었다.
11 제 닉 절연, DNA blotting T DNA 통합의 수를 결정 하 사용 되었다. 그 목적에 대 한 게놈 DNA 절단 했다 BglII 또는 Sca나 ( 그림 4A에 고안로 전략). 이 제한 효소의 둘 다 잘라 한 번만 T DNA 순서 (그림 7A). 바와 eYFP 지역 코딩을 인식 하는 프로브와 교 잡 허용 각각 DNA 파편의 수의.
개별 DNA의 수 기자 라인 (표 1)에서 T DNA 삽입의 수를 추정에 대 한 허용도 말에 파편. 바와 eYFP 프로브 단일 교배 시킨 조각 표시 단일 T DNA 통합의 존재. 11 제 닉 분석에서 단일 통합 실시 6. 통합의 평균 수는 1.2를 했다.
단일 T DNA 통합을 들고 6 라인에 대 한 삽입된 기자 구문의 무결성 DNA blotting ( 그림 4B에 고안로 전략)를 사용 하 여 테스트 했습니다. 게놈 DNA 나 포함 하는 바와 mTurquoise eYFP 융합 유전자 (그림 7A) 5.5 kb 조각 출시 BglII와 Pci삭감 되었다. EYFP에 대 한 조사는 예상된 조각 검출 하 사용 되었다. 모든 식물 테스트 실시는 그대로 조각. 조각 검사는 왼쪽 및 오른쪽 T DNA 테두리를 제외 하 고 따라서 관심의 transgenes 포함 된 부분만 하지만 DNA-전체 T의 무결성을 검사 하지 않습니다.
형광 성 취재 원 유전자의 표정은 독립적인 단일 사본 유전자 변형 라인 T-DNA의 genomic 위치 다른에서 결정 되었다. CaMV 35S 발기인 기반 mTurquoise eYFP 기자 상대 성적 레벨 4 DM19 기자 라인 그대로, 단일 복사 통합의 genomic 위치 결정된10은 운반에 실시간 정량 Pcr에 의해 측정 되었다. 기자 진 식 레벨 라인 사이에서 변화 했다 사소한: mTurquoise eYFP RNA 수준에 최대 차이점은 2-fold (그림 8A).
다음, ODM이 기자 라인에서 실시 됐다. 4 개의 독립적인 기자 라인 3 오히려 유사한 ODM 효율성 (그림 8B) 보여주었다. 그러나, 한 라인, DM19 [4] 1, 다른 라인에 비해 매우 낮은 ODM 효율을 굴복. 이러한 결과 ODM 로컬 게놈 컨텍스트에 의해 영향을 나타냅니다. 어떤 방식으로 DM19에서 T DNA 통합의 로컬 게놈 컨텍스트 [4] 1와는 다른 라인에서 확인할 수 있다. 활성 및 비활성 chromatin 표시 비-유전자 변형 식물에 genomic T DNA 통합 사이트에서 사용할 수 있는 데이터의 분석 팬 들은 대답10의 정보를 제공 하지 않았다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57295/57295fig1.jpg"> 그림 1: pBIBAC GW 벡터의 기능 지도. pBIBAC-GW 파생 상품 Glufosinate (바)에 어느 저항 또는 공장에서 선택 마커로 씨 코트 (DsRed)에 DsRed 형광와 함께 사용할 수 있습니다. 두 벡터 대 저항 유전자는 박테리아에서 선택 마커. At & tr 1와 at & tr 2 게이트웨이 ccdB 카세트 사이 재결합을 나타내는 녹색 화살표가 표시 됩니다 사이트. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57295/57295fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57295/57295fig2.jpg"> 그림 2: Mutagenesis 기자 구문. MTurquoise-eYFP 기자 유전자 CaMV 35S promotor에 의해 구동 됩니다. 지역 코딩 mTurquoise는 eYFP 지역 뉴클레오티드 위치 120 C A 돌연변이 들고, 조 변환 정지 codon TAA, 융해 단백질의 번역의 조기 종료에 따른 코딩을 융합 이다. 3 ' Nopaline Synthase (3' nos) polyadenylation 신호 구조22의 녹음을 종료 하는 데 사용 됩니다. 핵 지 방화 신호 (NLS) 핵에 번역 된 단백질을 대상 하는 데 사용 됩니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57295/57295fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57295/57295fig3.jpg"> 그림 3: 쟁반 가득 애기 묘 Glufosinate 염화 처리 전후. 묘 하지 pBIBAC-바-GW T에 존재 하는 바 유전자 표현-Glufosinate 염화 솔루션 분무 되 후 DNA 다. 사진을 두 번 분무 되 후 10 일 후, Glufosinate 염화, 파 종, 후 14 일와 (B) 분사 하기 전에 동일한 트레이 묘 (A)를 보여줍니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57295/57295fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57295/57295fig4.jpg"> 그림 4: 일반적인 DNA 제한 전략 식별 번호와 intactness의 T-DNAs 삽입. (A) 한 제한 사이트 (R) T DNA 중간 왼쪽 (레드 L) 및 T-DNA (녹색 R)의 오른쪽 부분 독립적인 프로브 수 있습니다. 오른쪽에 만화 표시 단일-또는 멀티-복사 T DNA 통합, 따라서 다른 밴딩 패턴 DNA blotting으로 얻을 수 있습니다. 밴드 표시는 * 다른 밴드의 길이 측면에 서 genomic DNA에 있는 가까운 제한 사이트에 따라 달라 집니다 동안 정의 된 길이가지고. 단일 삽입: L과 R 두 줄 한 독립 단편 프로브. 예상된 평균 조각 크기는 게놈에 제한 사이트의 주파수에 따라 계산할 수 있습니다. 최소 크기는 월말 통합 조사 되 고는, 그리고 만약 T DNA 그대로 따라 왼쪽 테두리 (파운드) 또는 오른쪽 테두리 (RB), 제한 사이트에서 거리 이다. 탠덤 반복: L과 R에 대 한 프로브 줄 모두 두 조각; 각 프로브 파편 중 하나 측면에 서는 genomic DNA 포함, 두 번째 단편 예상 크기가 고 두 프로브에 의해 식별 됩니다. 거꾸로 반복: 통합된 카세트의 방향을 따라 한 L 및 2 개의 R 파편, 또는 두 개의 L과 한 R 식별할 수 있습니다. 개별 단일 삽입: 결과 독립적인 조각, 수 고 조각 수 통합의 수에 해당 합니다. (B) 제한 T-DNA의 말단에서 사이트 허용 제한 사이트 간의 조각의 무결성을 결정. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57295/57295fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57295/57295fig5.jpg"> 그림 5: 제한 패턴 및 일치 투명도 agarose 젤. (A) 게놈 DNA EcoR와 함께 소화 하는 agarose 젤에 표시 됩니다. DNA의 적절 한 소화는 개별 위성 밴드의 존재에 의해 그림입니다. (B) 표시 슬롯 및 투명도에 마커 밴드의 위치 가능 하 게 나중에 쉽게 파편을 교배 시키기의 크기를 계산 합니다. 여기, MRC 네덜란드 마커 (파란색과 빨간색)를 사용 하는 M. 표시 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57295/57295fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57295/57295fig6.jpg"> 그림 6: 모 세관 blotting에 대 한 설치. 모 세관 blotting 설치, 필터 종이 20 x SSC 버퍼에 걸려 종이의 끝을 가진 플라스틱 접시에 배치 됩니다. 용지가 20 침수 x SSC, 그리고 위에 배치 하는 agarose 젤 나일론 막, 필터 종이, 그리고 조직의 스택 다음. 가벼운 무게는 상단에 배치 됩니다. 주의 젤, 종이 막 사이 공기 방울을 제거 합니다. 집착 영화는 설치에서 건조 하지 않도록 하는 데 사용 됩니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57295/57295fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57295/57295fig7.jpg"> 그림 7: DNA blotting 전략 및 실험 결과의 예. (A) DNA blotting 전략 수와 T DNA 통합의 intactness 결정 하. T-DNA 내에서 선택 된 제한 효소 절단 위치 세로 막대에 표시 됩니다. EYFP 및 바 프로브 소화 genomic dna 교 잡에 대 한 사용은 라인을 사용 하 여 T-DNA 아래 터미널 점이 표시 됩니다. (DB-) 예 DNA 지우고. 게놈 DNA는 Sca나 하 고 오 점 (B 와 C)는 바 와 eYFP 프로브 탐지 했다을 절단 했다. 게놈 DNA 나 BglII와 Pci잘라 고 바 프로브 탐지. 그대로 조각 크기 (D)에서 5.5 kbp 있습니다. 참고 d에서 샘플 집합 B와 C에 표시 된에서 다릅니다 * 나타냅니다 예상된 조각 크기; M, 마커입니다. B, C 및 D에 같은 크기 마커 사용 됩니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57295/57295fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57295/57295fig8.jpg"> 그림 8: mTurquoise eYFP 식 수준 및 독립적인 mTurquoise eYFP 기자 라인에 ODM 효율성. DM19 기자 라인에서 실시간 정량 측정 (A) 상대 mTurquoise eYFP 대 본 수준. 정규화에 대 한 걸의 대 본 수준 사용 되었다. (B) ODM 효율성 측정 DM19 기자 라인. A와 B, 바에 대 한 적어도 5 개의 생물 복제의 평균을 나타냅니다. 오차 막대 표시 SEM. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57295/57295fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="3">T-DNA 소재 시의 유형</td>
			<td rowspan="3">Nr T DNA 통합의</td>
			<td rowspan="3">기자 선</td>
			<td colspan="4">감지 하는 조각 수</td>
			<td>무결성</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">
Sca 난</td>
			<td colspan="2">
Bgl 2 세</td>
			<td>
Bgl II/PciI</td>
		</tr>
<tr>
<td>바</td>
			<td>eYFP</td>
			<td>바</td>
			<td>eYFP</td>
			<td>eYFP</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="8">단일 장소 통합</td>
			<td>1</td>
			<td>19 [2]-2</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>19 [2]-5</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>19 [2]-9</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>19 [2]-11</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>19 [4]-1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>19 [4]-2</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>거꾸로 2 반복</td>
			<td>19 [2]-10</td>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>2, 불완전 한 통합</td>
			<td>19 [2]-3</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>ND</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">여러 개의 로커 스 통합</td>
			<td>2</td>
			<td>19 [2]-6</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td></td>
			<td>ND</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>19 [2]-7</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>ND</td>
		</tr>
<tr>
<td>3/4</td>
			<td>19 [2]-1</td>
			<td>4</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>ND</td>
		</tr>
<tr>
<td>ND-결정 되지</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: PDM19와 변환 후 절연 제 닉에 대 한 데이터를 blotting DNA의 요약.

Watch this Scientific Journal Video about Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector at JoVE.com

Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector

PBIBAC-GW 이진 벡터를 사용 하 여 생성 유전자 변형 식물을 그대로 단일 복사본 삽입, 쉬운 과정을 만든다. 여기, 프로토콜의 시리즈는 유전자 변형 애기 식물을 생성 하 고 intactness에 대 한 식물을 테스트 과정을 통해 독자를 안내 하 고 삽입의 수를 복사 하 여.

BIBAC-GW 이진 벡터를 사용 하 여 단일 복사본 삽입을 가진 유전자 변형 식물 생성

When generating transgenic plants, generally the objective is to have stable expression of a transgene. This requires a single, intact integration of the ...

generating-transgenic-plants-with-single-copy-insertions-using-bibac

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

12.5K 조회수.  University of Amsterdam. PBIBAC-GW 이진 벡터를 사용 하 여 생성 유전자 변형 식물을 그대로 단일 복사본 삽입, 쉬운 과정을 만든다. 여기, 프로토콜의 시리즈는 유전자 변형 애기 식물을 생성 하 고 intactness에 대 한 식물을 테스트 과정을 통해 독자를 안내 하 고 삽입의 수를 복사 하 여.

비디오: Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

깁슨 조립 및 유전자 총을 사용하여 담배 일시적인 유전자 발현

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

연구

환경과학

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The baculovirus-mediated insect cell expression system is one of the systems used to express recombinant eukaryotic secretory proteins with some post-translational modifications. The secretory proteins need to be routed through the secretory pathways for protein glycosylation, disulfide bonds formation, and other post-translational modifications. To improve the existing insect cell expression of secretory plant proteins, a baculovirus expression vector is modified by the addition of either a GP67 or a hemolin signal peptide sequence between the promoter and multiple-cloning sites. This newly designed modified vector system successfully produced a high yield of soluble recombinant secreted plant receptor proteins of Arabidopsis thaliana. Two of the expressed plant proteins, the extracellular domains of Arabidopsis TDR and PRK3 plasma membrane receptors, were crystallized for X-ray crystallographic studies. The modified vector system is an improved tool that can potentially be used for the expression of recombinant secretory proteins in the animal kingdom as well.

Here, we present the protocols for utilizing the insect cell and baculovirus protein expression system to produce large quantities of plant secreted proteins for protein crystallization. A baculovirus expression vector has been modified with either GP67 or insect hemolin signal peptide for plant protein secretion expression in insect cells.

식물 단백질 곤충 세포에서 분 비 생산 잠재 식 벡터를 수정

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

생화학

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the flexible and efficient GreenGate cloning system with the proven and benchmarked LhGR system (here termed GR-LhG4) for the inducible expression, we have generated a set of transgenic Arabidopsis lines that can drive the expression of an effector cassette in a range of specific cell types in the three main plant meristems. To this end, we chose the previously developed GR-LhG4 system based on a chimeric transcription factor and a cognate pOp-type promoter ensuring tight control over a wide range of expression levels. In addition, to visualize the expression domain where the synthetic transcription factor is active, an ER-localized mTurquoise2 fluorescent reporter under control of the pOp4 or pOp6 promoter is encoded in driver lines. Here, we describe the steps necessary to generate a driver or effector line and demonstrate how cell type specific expression can be induced and followed in the shoot apical meristem, the root apical meristem and the cambium of Arabidopsis. By using several or all driver lines, the context specific effect of expressing one or multiple factors (effectors) under control of the synthetic pOp promoter can be assessed rapidly, for example in F1 plants of a cross between one effector and multiple driver lines. This approach is exemplified by the ectopic expression of VND7, a NAC transcription factor capable of inducing ectopic secondary cell wall deposition in a cell autonomous manner.

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Here, we describe the generation and application of a set of transgenic Arabidopsis thaliana lines enabling inducible, tissue-specific expression in the three main meristems, the shoot apical meristem, the root apical meristem, and the cambium.

유도할 수 있는, 애기 thaliana 통해 LhGR 중재 트랜스에 셀 형식 관련 식-활성화

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

유전학

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of cells or tissues in model organisms. These systems contain two components as separate transgenic lines. A driver line expresses a transcriptional activator under the control of tissue-specific promoters/enhancers, and a reporter/effector line harbors a target gene placed downstream to the binding site of the transcription activator. Animals harboring both components induce tissue-specific transactivation of a target gene expression. Precise spatiotemporal expression of the gene in targeted tissues is critical for unbiased interpretation of cell/gene activity. Therefore, developing a method for generating exclusive cell/tissue-specific driver lines is essential. Here we present a method to generate highly tissue-specific targeted expression system by employing a &#34;Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/CRISPR-associated&#34; (CRISPR/Cas)-based genome editing technique. In this method, the endonuclease Cas9 is targeted by two chimeric guide RNAs (gRNA) to specific sites in the first coding exon of a gene in the Drosophila genome to create double-strand breaks (DSB). Subsequently, using an exogenous donor plasmid containing the transactivator sequence, the cell-autonomous repair machinery enables homology-directed repair (HDR) of the DSB, resulting in precise deletion and replacement of the exon with the transactivator sequence. The knocked-in transactivator is expressed exclusively in cells where the cis-regulatory elements of the replaced gene are functional. The detailed step-by-step protocol presented here for generating a binary transcriptional driver expressed in Drosophila fgf/branchless-producing epithelial/neuronal cells can be adopted for any gene- or tissue-specific expression.

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Here, we present a method for generating tissue-specific binary transcription systems in Drosophila by replacing the first coding exon of genes with transcription drivers. The CRISPR/Cas9-based method places a transactivator sequence under the endogenous regulation of a replaced gene, and consequently facilitates transctivator expression exclusively in gene-specific spatiotemporal patterns.

게놈을 편집 하 여 초파리 에서 조직 관련 이진 전사 시스템을 생성 하기 위한 효율적인 전략

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

발생학

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

EMBL에서 MultiBac 단백질 복잡한 생산 플랫폼

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

생물학

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most commonly used agent for agroinfiltration is Agrobacterium tumefaciens, a pathogen of many dicot plant species. This implies that agroinfiltration can be applied to many plant species. Here, we present our protocols and expected results when applying these methods to the potato (Solanum tuberosum), its related wild tuber-bearing Solanum species (Solanum section Petota) and the model plant Nicotiana benthamiana. In addition to functional analysis of single genes, such as resistance (R) or avirulence (Avr) genes, the agroinfiltration assay is very suitable for recapitulating the R-AVR interactions associated with specific host pathogen interactions by simply delivering R and Avr transgenes into the same cell. However, some plant genotypes can raise nonspecific defense responses to Agrobacterium, as we observed for example for several potato genotypes. Compared to agroinfiltration, detection of AVR activity with PVX agroinfection is more sensitive, more high-throughput in functional screens and less sensitive to nonspecific defense responses to Agrobacterium. However, nonspecific defense to PVX can occur and there is a risk to miss responses due to virus-induced extreme resistance. Despite such limitations, in our experience, agroinfiltration and PVX agroinfection are both suitable and complementary assays that can be used simultaneously to confirm each other&#39;s results.

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are routine functional assays for transient ectopic expression of genes in plants. These methods are efficient assays in effectoromics strategies (rapid resistance and avirulence gene discovery) and crucial to modern research in molecular plant pathology. They meet the demand for robust high-throughput functional analysis in plants.

감자와 니코티아나 벤타미안의 농아침투 및 PVX 농병감염

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

<meta charset="utf8"></head><body>쌀 육종에서 저항성 전분을 위한 CRISPR 기반의 효율적인 게놈 편집

Breeding by Design for Functional Rice with Genome Editing Technologies

The conventional approaches to crop breeding, which rely predominantly on time-consuming and labor-intensive methods such as traditional hybridization and mutation breeding, face challenges in efficiently introducing targeted traits and generating diverse plant populations. Conversely, the emergence of genome editing technologies has ushered in a paradigm shift, enabling the precise and expedited manipulation of plant genomes to intentionally introduce desired characteristics. One of the most widespread editing tools is the CRISPR/Cas system, which has been used by researchers to study important biology-related problems. However, the precise and effective workflow of genome editing has not been well-defined in crop breeding. In this study, we demonstrated the entire process of breeding rice varieties enriched with high levels of resistant starch (RS), a functional trait that plays a crucial role in preventing diseases such as diabetes and obesity. The workflow encompassed several key steps, such as the selection of functional SBEIIb gene, designing the single-guide RNA (sgRNA), selecting an appropriate genome editing vector, determining the vector delivery method, conducting plant tissue culture, genotyping mutation and phenotypic analysis. Additionally, the time frame necessary for each stage of the process has been clearly demonstrated. This protocol not only streamlines the breeding process but also enhances the accuracy and efficiency of trait introduction, thereby accelerating the development of functional rice varieties.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 최적의 표현형 및 농업 형질을 얻기 위해 CRISPR/Cas를 사용한 벼 육종 간소화

The protocol describes breeding resistant starch rice varieties by design using genome editing technologies in a precise, efficient, and technically simple way.

게놈 편집 기술을 이용한 기능성 벼를 위한 설계에 의한 육종

The conventional approaches to crop breeding, which rely predominantly on time-consuming and labor-intensive methods such as traditional hybridization and ...

생체공학

Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be successful for many plant species. However, flax (Linum usitatissimum) transformation by floral-dip has not been reported. The goal of this protocol is to establish that Agrobacterium and the floral-dip method can be used to generate transgenic flax. We show that this technique is simple, inexpensive, efficient, and more importantly, gives a higher transformation rate than the current available methods of flax transformation.
In summary, inflorescences of flax were dipped in a solution of Agrobacterium carrying a binary vector plasmid (T-DNA fragment plus the Linum Insertion Sequence, LIS-1) for 1 - 2 min. The plants were laid flat on their side for 24 hr. Then, plants were maintained under normal growth conditions until the next treatment. The process of dipping was repeated 2 - 3 times, with approximately 10 - 14 day intervals between dipping. The T1 seeds were collected and germinated on soil. After approximately two weeks, treated progenies were tested by direct PCR; 2 - 3 leaves were used per plant plus the appropriate T-DNA primers. Positive transformants were selected and grown to maturity. The transformation rate was unexpectedly high, with 50 - 60% of the seeds from treated plants being positive transformants. This is a higher transformation rate than those reported for Arabidopsis thaliana and other plant species, using floral-dip transformation. It is also the highest, which has been reported so far, for flax transformation using other methods for transformation.

Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Here, we present a protocol to transform flax using Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip. This protocol is simple to perform and inexpensive, yet yields a higher transformation rate than the current available methods for flax transformation.

아마의 꽃 - 딥 변환 (<em&gt; LINUM usitatissimum</em&gt;) 높은 변환 속도와 형질 전환 자손을 생성합니다

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be ...

BIBAC-GW 이진 벡터를 사용 하 여 단일 복사본 삽입을 가진 유전자 변형 식물 생성

요약

더 많은 비디오 탐색

깁슨 조립 및 유전자 총을 사용하여 담배 일시적인 유전자 발현

식물 단백질 곤충 세포에서 분 비 생산 잠재 식 벡터를 수정

유도할 수 있는, 애기 thaliana 통해 LhGR 중재 트랜스에 셀 형식 관련 식-활성화

게놈을 편집 하 여 초파리 에서 조직 관련 이진 전사 시스템을 생성 하기 위한 효율적인 전략

EMBL에서 MultiBac 단백질 복잡한 생산 플랫폼

감자와 니코티아나 벤타미안의 농아침투 및 PVX 농병감염

게놈 편집 기술을 이용한 기능성 벼를 위한 설계에 의한 육종

게놈 편집 기술을 이용한 기능성 벼를 위한 설계에 의한 육종

게놈 편집 기술을 이용한 기능성 벼를 위한 설계에 의한 육종

아마의 꽃 - 딥 변환 (