이 방법의 전반적인 목표는 고도로 조직 특정 표적 발현 시스템을 생성하는 것입니다. 이 방법에서, 우리는 우리의 Drosophila FGF homolog에 대한 특정 바이너리 전사 드라이버의 생성을 시연, 분기없는. 분기없는 의 동적, 현공간적 발현은 기관 기도 상피의 지점 혈형성을 조절합니다.
이 방법은 분기없는 생산 세포의 현면 적 발현 및 이동에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, Drosophila또는 C.Elegans 및 제브라피시와 같은 다른 모델 유기체에서 다른 유전자및 조직에 쉽게 적용 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 대체 된 유전자의 시스 조절 요소가 기능적이고 세포에서 독점적으로 매우 신뢰할 수있는 조직 및 유전자 특이적 발현 시스템을 생성한다는 것입니다. 이진 전사 시스템은 표적 유전자 발현 및 조작을 위한 필수적인 도구입니다.
GAL4 또는 LexA와 같은 트랜스 활성제는 유전자의 시스 조절 요소의 통제하에 발현되어, LExA를 위한 GAL4 및/또는 LexO를 위한 UAS와 같은 특정 전사 결합 사이트의 하류에 배치되는 이펙터 트랜스 유전자를 구동합니다. 이 방법론은 분기없는 유전자의 첫 번째 코딩 엑소온을 전사 드라이버로 대체합니다. CRISPR Cas9 계 방법은 분기유전자의 내인성 조절하에 렉사 트랜스 활성제 서열을 배치하고, 결과적으로, 분기가 없는 특정 현면 패턴에서 독점적으로 트랜스 활성제 발현을 용이하게 한다.
선택된 관심 영역의 2단을 구체적으로 표적으로 하는 두 개의 가이드 RNA 표적 부위를 선택하여 시작한다. 선택의 CRISPR 디자인 도구를 엽니다. 플라이 CRISPR 최적 대상 파인더는 여기에서 사용됩니다.
선택 게놈'관심의 순서를 삽입, 가장 최근에 업로드 드로소필라 멜라노가스터 게놈 을 선택, 현재 R 은 드롭 다운 메뉴에서 여섯 강조. 다음으로 가이드 길이 선택'과 입력 20을 클릭합니다. 모든 CRISPR 대상을 선택하고 CRISPR 대상 찾기를 클릭합니다.
PAM에 대해서만 스트링및 NGG에 대한 최대값을 설정하여 모든 후보 가이드 RNA 표적을 평가합니다. 탠덤 가이드 RNA 발현 벡터를 생성하기 위해, 제1 PCR은 DNA 단편을 증폭하여 2개의 프로토 스페이서 서열을 pCFD4 RNA 발현 벡터 백본으로 소개한다. 프로토 스페이서 서열을 가진 전방 및 역 프라이머를 사용하고, 고충실도 폴리머라제 및 pCFD4 템플릿 DNA를 사용하여 PCR에서 pCFD4 벡터 서열과 겹친다.
복제를 위해 pCFD4를 준비하려면 Bbs1 효소로 플라스미드를 소화하십시오. pCFD4 플라스미드2~5마이크로그램과 Bbs1 효소 의 마이크로리터 1개와 50마이크로리터의 최종 부피를 포함하는 적절한 소화 완충제에 반응을 설정한다. 튜브를 두드리고 튜브의 벽에서 바닥까지 흩어진 모든 물방울을 짧은 스핀으로 수집하여 반응 내용을 혼합합니다.
PCR 제품을 실행한 후 2시간 동안 섭씨 37도에서 반응 믹스를 배양하고 1% 아가로즈 젤로 플라스미드를 소화합니다. 표준 젤 정화 열을 사용하여 6.4 킬로베이스 쌍 선형 플라스미드 및 600 베이스 페어 PCR 제품을 정화합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 DNA 어셈블리 반응을 설정합니다.
GAL4 또는 LexA 서열의 게놈 노크인의 경우, 두 개의 상동성 팔에 의해 측면에 있는 트랜스 활성제 시퀀스를 포함하는 이중 가닥 HDR 기증자를 디자인합니다. 설계된 궤적에 대한 가이드 RNA의 재표적을 피하기 위해, 가이드 RNA 인식 부위가 도입된 외인성 서열에 의해 중단되는 방식으로 대체 기증자를 설계한다. 또한 시스 조절 요소의 순도를 변경하지 않으려면 코딩 엑슨 영역 내에서 항상 가이드 RNA 인식 부위를 선택하십시오.
대체 카세트를 생성하려면 DNA 어셈블리 전략을 계획하여 4개의 세그먼트를 함께 결합합니다. 5개의 프라임 및 3개의 프라임 상동성 암, 중간 외인성 트랜스 활성제 DNA 서열 및 선형화된 클로닝 벡터 백본. PCR은 적절한 벡터로부터 GAL4 또는 렉사 발현 카세트를 증폭시키고 PCR은 주입을 위해 선택된 부모 플라이 라인에서 추출된 게놈 DNA로부터 모모로지 암을 증폭시킵니다.
각 PCR에서 고충실도 폴리머라제를 사용하여 표적 조각을 생성합니다. DNA 어셈블리 반응을 설정하려면 PCR 복제에 의해 생성된 선형 복제 벡터 및 표적 조각을 DNA 어셈블리 마스터믹스와 최종 반응 부피를 제조업체의 지침에 따라 20 마이크로리터에 혼합한다. 50°C에서 1시간 동안 반응 믹스를 배양합니다.
Nos-Cas9 배아가 이전에 가이드 RNA 발현 플라스미드와 대체 기증자를 모두 주입했을 때, 성인으로 발전하면 G0 을 교차하여 표적 알레에 적합한 라인에서 파리의 균형을 맞추기 위해 개별적으로 날아갑니다. 이산화탄소 패드에 각 G0 십자가에서 F1 자손을 마취합니다. 임의로 스테레오 현미경으로 10 에서 20 남성을 선택합니다.
개별적으로 대상 된 알레에 적합한 라인에서 밸런서 여성으로 선택 된 각 남성을 교차합니다. F2 애벌레가 부화하면 각 십자가에서 F1 아버지를 선택합니다. 파이펫 끝으로 10~15초 동안 각 비행을 스퀴싱하여 게놈 DNA를 추출하여 버퍼를 분배하지 않고 50 마이크로리터의 스퀴싱 버퍼를 함유합니다.
그런 다음 남은 버퍼를 튜브에 분배하고 잘 섞습니다. 섭씨 37도에서 20~30분 동안 배양하세요. 인큐베이션에 이어, 튜브를 섭씨 95도의 열블록에 1~2분 동안 배치하여 단백질을 비활성화한 후 10, 000배G에서 5분간 회전한 후, 추가 PCR 분석을 위해 섭씨 4도에 준비하십시오.
프라이머를 사용하여 3단계 PCR 기반 화면을 수행하고 삽입 또는 교체의 존재를 검사하기 위해 프라이머를 뒤로 합니다. PCR을 2개의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하고 두 개의 프라이머를 역으로 하여 세 개의 주요 영역에서 삽입 또는 교체를 확인합니다. 프라이머 M13F를 사용하여 PCR을 수행하고 3을 뒤집어 끝'HDR을 확인합니다.
확인된 종료'HDR로 플라이 라인을 유지하고 F2 세대의 균형 잡힌 주식을 설정하십시오. 밸러운더는 다른 염색체에 의도하지 않은 돌연변이를 제거하기 위해 다시 날아갑니다. 분기리스, 또는 bnl 발현은, 세 번째 인스타 애벌레 날개 디스크에서 빨간색으로 도시되며, 수용체 호흡이 없는 발현 세포를 녹색으로 나타내며, 성장하는 공기 낭 프리모듐에서 나타난다.
분기없는 발현 세포는 TR5 횡방향 결합 분기 및 TR2 등쪽 분기에 여기에 표시됩니다. 숨이 멎을 듯한 표현 기관 세포는 여기에 녹색으로 표시됩니다. 호흡없는 발현 세포는 녹색으로 표시되며, 단계 9에서 14 단계까지 발전하는 배아 기관체를 표시하고 분기없는 발현 세포는 빨간색으로 표시됩니다.
이 이미지는 저산소 조건 하에서 자궁 외 조직 위치에서 유도된 분기없는 발현을 대조하는 것을 보여줍니다. 이 방법은 분기없는 유전자 전사의 모든 원래 의 현면적 규정을 유지하기 위해 설계되었습니다. 따라서 유전자의 첫 번째 코딩 엑소만 렉사 트랜스 활성제 코딩 서열로 대체하는 것이 중요했다.
개발 후, 이 새로운 유전 도구 세트는 분기유전자의 새로운 조직 발현 패턴을 탐구하는 길을 열었습니다. 그것은 또한 유전자 잘못 발현을 활성화하고 분기없는 표현 세포에서 독점적으로 쓰러져 세포의 선형 이동 및 신호 상호 작용을 모니터링하는 데 도움이되었습니다.
