이 작품에 대 한 자금 제공에 의해 대학의 샌디에고, 국립 과학 재단 대학원 연구 친교 프로그램, NIH R01-HG007836, 부여 하 고 한국 정부 과학, 정보 통신 및 미래 계획에 의해 했다.
여러 인물의 이전 버전 "Hoople, G. D. 외 에 처음 출판 되었다 젤-seq: 전체 게놈 그리고 transcriptome 시퀀싱 동시 낮은 입력 DNA와 RNA 라이브러리 준비 반 투과성 히드로 장벽을 사용 하 여. 실험실에 칩 17, 2619-2630, doi:10.1039 / c7lc00430c (2017). " 칩에 실험실이이 발행물에서 그림의 재사용을 허가 했다.

<ol>
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KZ는 공동 설립자 및 Singlera 유전체학 inc의 과학 고문

젤-seq 장치 제조 뿐만 아니라 프로토콜 자체와 관련 된 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 제조, 중 젤의 다양 한 지역에 대 한 소정의 레이어 두께 함께 시작 하는 것이 좋습니다. 우리는 다른 제조 옵션을 테스트 하는 중요 한 시간을 보냈다 고 여기에 설명 된 프로토콜 카세트에 테이블의 재료 및 시 약에대 한 가장 좋은 장치를 생성 합니다. 연구자는 다른 카세트 시스템을 사용 하는...

차세대 시퀀싱 (NGS) 유전학 연구는 실시 방법에 깊은 영향을 했다. 연구원은 한 번 전체 종의 게놈 시퀀싱에 초점을 맞춘, 단일 종양 또는 심지어 한 실험에 있는 단일 셀의 게놈을 시퀀싱 수 지금이. 1 NGS는 또한 했다 비용 효율적인 셀 데이터는 transcriptome로 알려진 컬렉션 내 RNA 사본 시퀀싱 하. 능력을 증폭 하 고 작은 시작 샘플에서 DNA 또는 RNA 시퀀싱만 지난 5 년간에서 달성 되었습니다. 2 , 3 , 4 는 불행 하 게도, 표준 프로토콜 호환 되지 않습니다 하 고 연구원은 주어진된 샘플에 대 한 DNA 또는 RNA 순서를 선택 해야 합니다. 시작 샘플 충분히 큰 경우 반으로 나눌 수 있습니다. 그러나 작은 스케일에서, 샘플 분할로 인해 재료의 손실 라이브러리 품질에 영향을 하 고 셀 사이의 재미 있는 변화 밖으로 평균 수 샘플 풀링. 5 또한, 연구팀은 단일 세포 또는 작은 다른 유형의 종양 생 검 등 분할 수 없는 샘플 검사에 점점 관심이 있습니다. 6
이 문제를 해결 하려면 세 가지 프로토콜 최근 개발 된 동일한 시작 샘플에서 DNA와 RNA 시퀀싱 하: 젤-seq7,8G & T-seq 및 박사-seq9. 이 문서는 젤-seq, 동시에 몇 가지 사소한 추가 비용 100 셀으로에서 DNA와 RNA 라이브러리를 생성 하는 데 사용할 수 있습니다에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 젤-seq의 소설 측면 DNA와 RNA 독점적으로 저가 히드로 매트릭스를 사용 하 여 크기에 따라 분리 하는 기능입니다. 젤-Seq 프로토콜의 핵심 혁신은 RNA에서 DNA의 물리적 분리 이다. 이 분리 electrophoretically polyacrylamide 막이이 분자의 크기 차이 활용 하는의 조합을 사용 하 여 이루어집니다. 맥락에서 이러한 크기 차이 넣어, DNA와 RNA의 이미지로 어떻게 하는 것을 고려: DNA 미크론 단위에 존재 하는 동안 전통적인 현미경을 사용 하 여 볼 수 있습니다, RNA 나노미터 규모로 존재 하 고 cryo 전자 등 복잡 한 기술을 사용 하 여 촬영 해야 합니다 현미경 검사 법입니다. 10
이 프로토콜에서 DNA와 RNA를 분리 하는 접근 방식은 그림 1에 표시 됩니다. 왼쪽된 패널 DNA와 RNA 무료 솔루션 막 근처에 떠 있는 것을 보여줍니다. 전기 분야 적용, 오른쪽 패널에 표시 된 것 처럼, DNA와 RNA는 세포 막을 통해 마이그레이션 유도 전기 이동 힘 경험. 막 속성을 조정 하 여 우리는 RNA에서 DNA를 분리 하는 반 투과성 막을 만들었습니다. DNA 분자는 멤브레인에 대 한 적용 됩니다 하지만 그들의 큰 크기 때문에 가장자리에 얽히게 된다. 작은 RNA 분자, 다른 한편으로, 재구성 고 막 통해 그들의 방법을 짜 다 수 있습니다. Reptation로 알려진이 프로세스는 잔디를 통해 뱀 이동 방법와 비슷합니다. 결국 이러한 RNA 분자는 너무 어려운 작은 고분자에 대 한 두 번째, 고밀도 막 중단 되었습니다 (> 200 기본적인 쌍)을 통해 몸부림. 일단 물리적으로 분리, DNA와 RNA 복구 고 게놈 및 transcriptome에 대 한 정보를 생성 하는 처리. 우리는 DNA와 RNA를 분리할 수 있습니다, 하는 동안 우리는 RNA는 역방향 분리 전에 cDNA를 복사할 경우 더 나은 결과 얻을 수 있습니다 나타났습니다. CDNA/RNA 하이브리드 RNA 혼자 보다 더 안정 되며 저밀도 멤브레인 통해 전달할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57315/57315fig1.jpg"> 그림 1 . 젤-seq 운영 원칙. 육체적으로 DNA와 RNA를 분리 하는 데 사용 하는 기본 원리. 적용 된 전기 분야에서 작은 RNA 분자는 저밀도 막 통해 마이그레이션할 하지만 큰 DNA 분자 표면에 갇혀 있다. 이 그림은 화학의 왕 사회 허가 참고 7에서 재현 됩니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57315/57315fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
이 종이 젤-seq 장치 제조 자세히 설명 하 고 생성 하는 생물 학적 프로토콜 결합 DNA와 RNA 라이브러리. 둘 다에 대 한 개요는 그림 2에 표시 됩니다. 장치는 레이어 링 3 개의 서로 다른 밀도 polyacrylamide 젤 서로 표준 스태킹 젤을 만드는 유사한 과정에 의해 조작 됩니다. 11 생물 학적 프로토콜 100-1000 셀 PBS에 정지로 시작 합니다. 셀 lysed 고 RNA cDNA/RNA 하이브리드에서 게놈 DNA를 분리 하는 장치를 사용 하기 전에 cDNA로 변환 됩니다. 분리 및 복구, 게놈 및 transcriptomic 후 라이브러리 표준 전체 게놈 라이브러리 준비 키트 프로토콜을 다음과 밀접 하 게 하는 프로세스를 사용 하 여 준비가 되어 있습니다. 칩 게시 에 실험실에서 개발 및 젤-seq의 유효성 검사에 대 한 추가 세부 정보를 읽을 수 있습니다 "젤-seq: 전체 게놈 및 동시 낮은 입력 DNA와 RNA 라이브러리 준비 사용 하 여 반 투과성 히드로 장벽을 transcriptome 시퀀싱 ." 7 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57315/57315fig2.jpg"> 그림 2 . 젤-seq 프로토콜. 젤-seq 장치 및 생성 된 쌍을 이루는 DNA와 RNA 라이브러리에 프로토콜을 조작 하는 단계의 개요입니다. 이 그림의 일부는 화학의 왕 사회 허가 참고 7에서 재현 했다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57315/57315fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
단일 세포에서 DNA와 RNA 라이브러리를 생성 하기 위해 연구원은 G & T-seq 또는 박사가 G & T-Seq, 젤-seq 같은 사용 하 여 고려해 야, genomic DNA에서 RNA의 물리적 분리에 의존. 메신저 RNA (mRNA)에 의존 하는이 방법은 3 ' polyadenylated 꼬리 풀 다운 대상으로. mRNA에 자석 구슬을 biotinylated 올리고 dT 프라이 머를 사용 하 여 캡처됩니다. 일단는 mRNA를 캡처한 구슬 자석와 장소에서 개최 되 고 게놈 DNA를 포함 하는 상쾌한 수 있습니다 제거 하 고 다른 튜브로 전송. 이 물리적 분리 완료 되 면 DNA와 mRNA에서 별도 라이브러리를 생성할 수 있습니다. 그러나 8 이 이렇게 잘 관심의 RNA는 polyadenylated, 그것은 사용할 수 없습니다 ribosomal RNA, tRNA, 또는 RNA 원핵생물에서 같은 비-polyadenylated 증명서를 공부 하 작동 합니다.
박사-seq 같은 튜브에 DNA와 RNA에서 파생 하는 cDNA 증폭 됩니다 사전 증폭 단계에 의존 합니다. 샘플은 다음 둘 하 고 DNA와 RNA seq 라이브러리를 준비 하는 동시에 처리. 게놈 DNA와 RNA에서 파생 된 cDNA 사이 구별, 박사-seq 전산 접근을 걸립니다. 그 중 DNA 또는 RNA에서 유래 수로 exons는 현재 시퀀스 계산 genomic DNA 데이터에 억제 됩니다. 9 는이 방법의 장점은 그 DNA 및 cDNA/RNA 필요 하지 물리적으로 분리 될 젤-seq와 G & T이 이루어집니다. 그러나, 단점은 박사-seq 게놈 및 (즉, introns 대 exons), transcriptome 선험적 지식이 필요 하 고 이상적인 시퀀싱의 핵, 없는 많은 증명서는 아직 완벽 하 게 되지 않을 수도 있습니다. 접합 하 고 여전히 introns를 포함. 12
젤-seq의 소설 측면 DNA와 RNA 크기에 독점적으로 기반으로 셀의 수백에서 분리 하는 기능입니다. 이 메서드는 선험적 지식이 게놈 또는 transcriptome, 불완전 한 접합에 대 한 강력한 이며 폴 리 adenylated 증명서에 국한 되지 않습니다 필요 합니다. 애플리케이션에 연구원 적어도 100 셀 시작할 수 젤-seq 저렴 하 고 널리 사용 가능한 재료를 사용 하 여 간단한 접근을 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Reagents&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide Monomer</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8887-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Persulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678-25G</td><td></td></tr><tr><td>Ampure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>Referred to in the text as solid phase reversible immobilization (SPRI) beads</td></tr><tr><td>DNA Gel Loading Dye (6x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0611</td><td>Referred to in the text as 6X loading dye</td></tr><tr><td>Ethyl alcohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>KAPA SYBR FAST One-Step qRT-PCR Kits</td><td>Kapa BioSystems</td><td>7959613001</td><td>Referred to in the text as 2X qPCR mix</td></tr><tr><td>N,N&amp;prime;-Methylenebis(acrylamide)&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>146072-100G</td><td>Also known as bis-acrylamide</td></tr><tr><td>NexteraXT DNA Library Preparation Kit (referred to in the text as library preparation kit)</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td>Includes: TD (referred to in the text as transposase buffer), ATM (referred to in the text as transposase), NT (referred to in the text as transposase stop buffer), and NPM (Referred to in the text as library prep PCR mix)</td></tr><tr><td>Nuclease Free Water</td><td>Millipore</td><td>3098</td><td></td></tr><tr><td>Protease</td><td>Qiagen</td><td>19155</td><td></td></tr><tr><td>SMART-Seq v4 Kit (referred to in the text as whole-transcript amplification (WTA) kit)</td><td>Takara/Clontech</td><td>634888</td><td>Includes: Lysis buffer, RNase inhibitor, 3&amp;rsquo; SMART-Seq CDS Primer II A (referred to in the text as RT primer), 5X Ultra Low First Strand Buffer (referred to in the text as first strand buffer), SMART-Seq v4 Oligonucleotide (referred to in the text as template switch oligonucleotide (TSO)), SMART-Scribe Reverse Transcriptase (referred to in the text as reverse transcriptase), and PCR Primer II A (referred to in the text as cDNA PCR primer)</td></tr><tr><td>Random hexamer with WTA adapter&amp;nbsp;</td><td>IDT</td><td>n/a</td><td>5&amp;prime;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3&amp;prime;</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281-25ML</td><td></td></tr><tr><td>DNA AWAY Surface Decontaminant</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>7010PK&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Referred to in the text as DNA removal product</td></tr><tr><td>Tris-Borate-EDTA buffer (10X concentration)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4415-1L</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000X Concentrate in DMSO)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11494</td><td>Referred to in the text as gel stain</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Equipment&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Precisionglide&amp;nbsp;syringe needles, gauge 18</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z192554</td><td>Any equivalent hardware is acceptable</td></tr><tr><td>Branson CPX series ultrasonic bath</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z769363</td><td>Any equivalent hardware is acceptable</td></tr><tr><td>Empty Gel Cassettes, mini, 1.0 mm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC2010</td><td>Any equivalent hardware is acceptable</td></tr><tr><td>Mesh Filter Plate - Corning&amp;nbsp;HTS Transwell 96 well permeable supports - 8.0 &amp;micro;m pore size</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS3374</td><td>Referred to in the text as 8 um mesh filter plate</td></tr><tr><td>PowerPac HC Power Supply</td><td>Bio-Rad</td><td>1645052</td><td>Any equivalent hardware is acceptable</td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33216</td><td>Any equivalent hardware is acceptable</td></tr><tr><td>Vacufuge Concentrator</td><td>Eppendorf</td><td>22822993</td><td>Any equivalent hardware is acceptable</td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Cell system</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EI0001</td><td>Any equivalent hardware is acceptable</td></tr><tr><td>Bio-Rad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td><td>Bio-Rad</td><td>1855195&amp;nbsp;</td><td>Any equivalent hardware is acceptable</td></tr><tr><td>Amersham UVC 500 Ultraviolet Crosslinker</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>UVC500-115V</td><td>Discontinued, any equivalent hardware is acceptable</td></tr><tr><td>Gel Doc XR+ Gel Documentation System</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td>Referred to in the text as gel imager</td></tr><tr><td>Dark Reader Transilluminator</td><td>Clare Chemical Research</td><td>DR89</td><td>Referred to in the text as UV transilluminator</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Ultrasonic&amp;nbsp;Bath</td><td>Bransonic</td><td>1207K35</td><td>Any equivalent ultrasonic bath is acceptable.</td></tr></tbody></table>

gel-seq: a method for simultaneous sequencing library preparation of dna and rna using hydrogel matrices

능력을 증폭 하 고 작은 시작 샘플에서 DNA 또는 RNA 시퀀싱만 지난 5 년간에서 달성 되었습니다. 불행히도, 게놈 생성 또는 transcriptomic 라이브러리에 대 한 표준 프로토콜 호환 되지 않습니다 그리고 연구원은 특정 샘플에 대 한 DNA 또는 RNA 순서를 선택 해야 합니다. 젤-seq 연구원은 DNA와 RNA 100-1000 셀 하이드로 겔 간단한 장치를 사용 하 여 시작에 대 한 라이브러리를 동시에 준비 하 여이 문제를 해결 합니다. 이 종이 짝된 라이브러리를 생성 하는 생물 학적 프로토콜 소자의 제조에 대 한 상세한 접근을 제공 합니다. 우리 설계 젤-seq; 다른 연구자에 의해 쉽게 구현 될 수 있도록 많은 유전학 실험실 이미 젤-seq 장치 제작을 재현 하는 필요한 장비. 우리의 프로토콜 사용 하 여 두 전체 사본 증폭 (WTA)에 대 한 키트 일반적으로 사용 되 고 라이브러리 준비는 연구원에 게 이미 익숙할 것 또한 라이브러리 생성 하 게놈 그리고 transcriptomic에 정통한. 우리의 접근 연구원을 무시할 수 추가 비용와 분할 하지 않고 단일 샘플에 DNA와 RNA 시퀀싱의 힘을가지고 있습니다.

젤-seq 장치에서 gDNA 및 cDNA/RNA 하이브리드의 물리적 분리 형광 젤 영상; 통해 구상 될 수 있다 대표 결과 그림 3에 표시 됩니다. 패널 A 표시 조작된 젤-seq 장치; 거짓 색상 구별 다른 젤 지역에 추가 되었습니다. B 패널의 유효성 검사에 사용 하는 4 개의 다른 분판을 가까이 나타난다. 3 레인, 부정적인 컨트롤 배경 나타내고 인터페이스에서 젤의 아무 aut...

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Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

젤-seq 연구자를 준비가 동시에 라이브러리에 대 한 두 DNA-및 RNA-seq 간단한 히드로 장치를 사용 하 여 100-1000 셀에서 시작 하는 무시할 수 추가 비용 있습니다. 이 종이 짝된 라이브러리를 생성 하는 생물 학적 프로토콜 소자의 제조에 대 한 상세한 접근을 제공 합니다.

젤-seq: DNA와 RNA 히드로 매트릭스를 사용 하 여 동시 시퀀싱 라이브러리 준비를 위한 방법

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the ...

gel-seq-method-for-simultaneous-sequencing-library-preparation-dna

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.9K 조회수.  University of San Diego. 젤-seq 연구자를 준비가 동시에 라이브러리에 대 한 두 DNA-및 RNA-seq 간단한 히드로 장치를 사용 하 여 100-1000 셀에서 시작 하는 무시할 수 추가 비용 있습니다. 이 종이 짝된 라이브러리를 생성 하는 생물 학적 프로토콜 소자의 제조에 대 한 상세한 접근을 제공 합니다.

비디오: Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA libraries are needed for optimal results from next-generation sequencing. Environmental samples such as water may have low quality and quantities of DNA as well as contaminants that co-precipitate with DNA. The mechanical and enzymatic processes involved in extraction and library preparation may further damage the DNA. Gel size selection enables purification and recovery of DNA fragments of a defined size for sequencing applications. Nevertheless, this task is one of the most time-consuming steps in the DNA library preparation workflow. The protocol described here enables complete automation of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments. 
In this study, we describe a high-throughput approach to prepare high quality DNA libraries from freshwater samples that can be applied also to other environmental samples. We used an indirect approach to concentrate bacterial cells from environmental freshwater samples; DNA was extracted using a commercially available DNA extraction kit, and DNA libraries were prepared using a commercial transposon-based protocol. DNA fragments of 500 to 800 bp were gel size selected using Ranger Technology, an automated electrophoresis workstation. Sequencing of the size-selected DNA libraries demonstrated significant improvements to read length and quality of the sequencing reads.

This manuscript describes an automated gel size selection approach for purifying DNA fragments for next-generation sequencing. The Ranger Technology provides complete automation of the entire process of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments allowing for high-throughput and high quality next-generation sequencing libraries.

자동 젤 사이즈 선택은 환경 물 샘플에서 준비 차세대 시퀀싱 라이브러리의 질을 향상시키기 위해

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

연구

환경과학

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of cancer development. By using non-invasive or pre-malignant lesions from patients who later develop invasive disease, gene expression analyses may help identify early molecular alterations that predispose to cancer risk. It has been well described that nucleic acids recovered from FFPE tissues have undergone severe physical damage and chemical modifications, which make their analysis difficult and generally requires adapted assays. MicroRNAs (miRNAs), however, which represent a small class of RNA molecules spanning only up to ~18&#8211;24 nucleotides, have been shown to withstand long-term storage and have been successfully analyzed in FFPE samples. Here we present a 3&#39; barcoded complementary DNA (cDNA) library preparation protocol specifically optimized for the analysis of small RNAs extracted from archived tissues, which was recently demonstrated to be robust and highly reproducible when using archived clinical specimens stored for up to 35 years. This library preparation is well adapted to the multiplex analysis of compromised/degraded material where RNA samples (up to 18) are ligated with individual 3&#39; barcoded adapters and then pooled together for subsequent enzymatic and biochemical preparations prior to analysis. All purifications are performed by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), which allows size-specific selections and enrichments of barcoded small RNA species. This cDNA library preparation is well adapted to minute RNA inputs, as a pilot polymerase chain reaction (PCR) allows determination of a specific amplification cycle to produce optimal amounts of material for next-generation sequencing (NGS). This approach was optimized for the use of degraded FFPE RNA from specimens archived for up to 35 years and provides highly reproducible NGS data.

Formalin-fixed paraffin-embedded specimens represent a valuable source of molecular biomarkers of human diseases. Here we present a laboratory-based cDNA library preparation protocol, initially designed with fresh frozen RNA, and optimized for the analysis of archived microRNAs from tissues stored up to 35 years.

회고전 예측에 관한 시퀀싱: 보완 DNA 도서관 준비 프로토콜 포 르 말린 고정 파라핀 포함 RNA 견본을 사용 하 여

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

유전학

Mapping R-Loops and RNA:DNA Hybrids with S9.6-Based Immunoprecipitation Methods

R-loops constitute a prevalent class of transcription-driven non-B DNA structures that occur in all genomes depending on both DNA sequence and topological favorability. In recent years, R-loops have been implicated in a variety of adaptive and maladaptive roles and have been linked to genomic instability in the context of human disorders. As a consequence, the accurate mapping of these structures in genomes is of high interest to many investigators. DRIP-seq (DNA:RNA Immunoprecipitation followed by high throughput sequencing) is described here. It is a robust and reproducible technique that permits accurate and semi-quantitative mapping of R-loops. A recent iteration of the method is also described in which fragmentation is accomplished using sonication (sDRIP-seq), which allows strand-specific and high-resolution mapping of R-loops. sDRIP-seq thus addresses some of the common limitations of the DRIP-seq method in terms of resolution and strandedness, making it a method of choice for R-loop mapping.

R-loops constitute a prevalent class of transcription-driven non-B DNA structures that occur in all genomes depending on both DNA sequence and topological ...

AQRNA-seq를 사용한 tRNA 역학 분석

AQRNA-seq for Quantifying Small RNAs

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate quantification of the pool of small RNAs. The AQRNA-seq library preparation procedure described here involves the use of custom-designed sequencing linkers and a step for reducing methylation RNA modifications that block reverse transcription processivity, which results in an increased yield of full-length cDNAs. In addition, a detailed implementation of the accompanying bioinformatics pipeline is presented. This demonstration of AQRNA-seq was conducted through a quantitative analysis of the 45 tRNAs in Mycobacterium bovis BCG harvested on 5 selected days across a 20-day time course of nutrient deprivation and 6 days of resuscitation. Ongoing efforts to improve the efficiency and rigor of AQRNA-seq will also be discussed here. This includes exploring methods to obviate gel purification for mitigating primer dimer issues after PCR amplification and to increase the proportion of full-length reads to enable more accurate read mapping. Future enhancements to AQRNA-seq will be focused on facilitating automation and high-throughput implementation of this technology for quantifying all small RNA species in cell and tissue samples from diverse organisms.

저자 스포트라이트: AQRNA-seq의 Role in Mapping Small RNAs and Unraveling Protein Translation Mechanisms (작은 RNA 매핑 및 단백질 번역 메커니즘 규명에서 AQRNA-seq 역할)

Absolute quantification RNA sequencing (AQRNA-seq) is a technology developed to quantify the landscape of all small RNAs in biological mixtures. Here, both the library preparation and data processing steps of AQRNA-seq are demonstrated, quantifying changes in the transfer RNA (tRNA) pool in Mycobacterium bovis BCG during starvation-induced dormancy.

small RNA 정량을 위한 AQRNA-seq

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate ...

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of this method, in comparison to other approaches, is its ability to monitor translation by precisely mapping the position and number of ribosomes on a mRNA transcript.
In this article, we describe the consecutive stages of sample collection and preparation for RIBO-seq method in bacteria, highlighting the details relevant to the planning and execution of the experiment.
Since the RIBO-seq relies on intact ribosomes and related mRNAs, the key step is rapid inhibition of translation and adequate disintegration of cells. Thus, we suggest filtration and flash-freezing in liquid nitrogen for cell harvesting with an optional pretreatment with chloramphenicol to arrest translation in bacteria. For the disintegration, we propose grinding frozen cells with mortar and pestle in the presence of aluminum oxide to mechanically disrupt the cell wall. In this protocol, sucrose cushion or a sucrose gradient ultracentrifugation for monosome purification is not required. Instead, mRNA separation using polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by the ribosomal footprint excision (28-30 nt band) is applied and provides satisfactory results. This largely simplifies the method as well as reduces the time and equipment requirements for the procedure. For library preparation, we recommend using the commercially available small RNA kit for Illumina sequencing from New England Biolabs, following manufacturer&#39;s guidelines with some degree of optimization.
The resulting cDNA libraries present appropriate quantity and quality required for next generation sequencing (NGS). Sequencing of the libraries prepared according to the described protocol results in 2 to 10 mln uniquely mapped reads per sample providing sufficient data for comprehensive bioinformatic analysis. The protocol we present is quick and relatively easy and can be performed with standard laboratory equipment.

Here we describe the stages of sample collection and preparation for RIBO-seq in bacteria. Sequencing of the libraries prepared according to these guidelines results in sufficient data for comprehensive bioinformatic analysis. The protocol we present is simple, uses standard laboratory equipment and takes seven days from lysis to obtaining libraries.

박테리아의 RIBO-seq: NGS 시퀀싱을 위한 샘플 수집 및 라이브러리 준비 프로토콜

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

생화학

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

단일 셀 게놈 시퀀싱 초고 처리량 미세 플랫폼

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

생체공학

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes and analysis of complex structural variants. Nanopore platforms perform single-molecule sequencing by directly measuring the current changes mediated by DNA passage through the pores and can generate hundreds of kilobase (kb) reads with minimal capital cost. This platform has been adopted by many researchers for a variety of applications. Achieving longer sequencing read lengths is the most critical factor to leverage the value of nanopore sequencing platforms. To generate ultra-long reads, special consideration is required to avoid DNA breakages and gain efficiency to generate productive sequencing templates. Here, we provide the detailed protocol of ultra-long DNA sequencing including high molecular weight (HMW) DNA extraction from fresh or frozen cells, library construction by mechanical shearing or transposase fragmentation, and sequencing on a nanopore device. From 20-25 &#181;g of HMW DNA, the method can achieve N50 read length of 50-70 kb with mechanical shearing and N50 of 90-100 kb read length with transposase mediated fragmentation. The protocol can be applied to DNA extracted from mammalian cells to perform whole genome sequencing for the detection of structural variants and genome assembly. Additional improvements on the DNA extraction and enzymatic reactions will further increase the read length and expand its utility.

Long-read sequences greatly facilitate the assembly of complex genomes and characterization of structural variation. We describe a method to generate ultra-long sequences by nanopore-based sequencing platforms. The approach adopts an optimized DNA extraction followed by modified library preparations to generate hundreds of kilobase reads with moderate coverage from human cells.

전체 게놈 DNA 분석을 위한 매우 긴 읽기 시퀀싱

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct libraries of millions of genetically distinct strains, screening for a desired phenotype remains a significant obstacle. With existing screening techniques, there is a tradeoff between information output and throughput, with high-throughput screening typically being performed on one product of interest. Therefore, we present an approach to accelerate strain screening by adapting single cell RNA sequencing to isogenic picoliter colonies of genetically engineered yeast strains. To address the unique challenges of performing RNA sequencing on yeast cells, we culture isogenic yeast colonies within hydrogels and spheroplast prior to performing RNA sequencing. The RNA sequencing data can be used to infer yeast phenotypes and sort out engineered pathways. The scalability of our method addresses a critical obstruction in microbial engineering.

A bottleneck in the &#8216;design-build-test&#8217; cycle of microbial engineering is the speed at which we can perform functional screens of strains. We describe a high-throughput method for strain screening applied to hundreds to thousands of yeast cells per experiment that utilizes droplet-based RNA sequencing.

액적 기반 RNA 시퀀싱을 통한 높은 처리량 효모 균주 현상태핑

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

젤-seq: DNA와 RNA 히드로 매트릭스를 사용 하 여 동시 시퀀싱 라이브러리 준비를 위한 방법

요약

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자동 젤 사이즈 선택은 환경 물 샘플에서 준비 차세대 시퀀싱 라이브러리의 질을 향상시키기 위해

회고전 예측에 관한 시퀀싱: 보완 DNA 도서관 준비 프로토콜 포 르 말린 고정 파라핀 포함 RNA 견본을 사용 하 여

Mapping R-Loops and RNA:DNA Hybrids with S9.6-Based Immunoprecipitation Methods

small RNA 정량을 위한 AQRNA-seq

small RNA 정량을 위한 AQRNA-seq

small RNA 정량을 위한 AQRNA-seq

박테리아의 RIBO-seq: NGS 시퀀싱을 위한 샘플 수집 및 라이브러리 준비 프로토콜

단일 셀 게놈 시퀀싱 초고 처리량 미세 플랫폼

전체 게놈 DNA 분석을 위한 매우 긴 읽기 시퀀싱

액적 기반 RNA 시퀀싱을 통한 높은 처리량 효모 균주 현상태핑