이 프로토콜은 초장거리 시퀀스 어레이를 생성하는 능력의 기술적 격차를 채웁니다. 그것은 우리가 게놈에 있는 현재 짧은 읽기 접근에 의해 제한되는 게놈 복잡성을 검토하는 것을 가능하게 합니다. 이 방법은 성능, 견고성, 다기능성 및 유망한 새로운 응용 프로그램과 통합할 수 있는 잠재력면에서 독특합니다.
그것은 다른 재료에 적용 할 수 있으며 다른 인스턴트 크기에 맞게 변조 할 수 있습니다. 이 기술은 임상 풍경에 혁명을 시작했다. 반복 확장 장애의 진단 유틸리티는 많은 현재의 단점을 극복했습니다.
일부 이식 레지스트리는 더 나은 임상 결과를 위해 고해상도 HLA 타이핑을 이용했습니다. 이러한 메서드는 이전에 는 변조 및 복잡한 구조 분산과 같은 액세스할 수 없는 장거리 정보를 제공합니다. 단일 테스트에서 후성 유전학 판독과 결합하면 정밀 의학을 가능하게합니다.
그것은 많은 새로운 기술을 가진 긴 프로토콜이며 최종 시퀀싱까지 작동하는지 알기 가 어렵습니다. 샘플을 실행하기 전에 오래된 흐름 셀에 로딩을 연습하는 것이 좋습니다. 공동 작업자는 일부 기술이 짧은 읽기 접근 방식에 비해 혼란스럽다고 말했습니다.
특히, 추출은 고품질, 고분자 DNA로 인해 더 부드럽습니다. HMW DNA의 추출을 시작하려면 먼저 50 밀리리터 튜브에 10 밀리리터의 리시스 버퍼에 세포 현탁액의 200 마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 3 초 동안 최고 속도로 소용돌이합니다.
그리고 1 시간 동안 섭씨 37도에서 솔루션을 배양하십시오. 인큐베이션이 끝나면 용액에 RNS-A의 마이크로리터 2개를 추가합니다. 50 밀리리터 튜브를 부드럽게 회전하여 샘플을 혼합하고 1시간 동안 섭씨 37도에서 배양합니다.
인큐베이션 후, 리자테에 페놀 클로로폼-이소아밀 알코올 혼합물의 페놀 층의 10 밀리리터를 첨가한다. 그리고 연기 후드 아래 10 분 동안 20 rpm에서 회전기에 튜브를 넣어. 젤 튜브를 원심분리한 후, 새로운 50밀리리터 튜브에 상피물을 조심스럽게 붓습니다.
그런 다음, 얼음 차가운 100 % 에탄올의 25 밀리리터를 추가하고 DNA가 침전 될 때까지 손으로 튜브를 부드럽게 회전시합니다. 후크를 만들기 위해 20 마이크로 리터 팁을 구부립니다. 후크를 사용하여 HMW DNA를 조심스럽게 꺼내 액체를 떨어 뜨립니다.
그런 다음 DNA를 70%에탄올의 40밀리리터를 포함하는 50 밀리리터 튜브에 넣고 튜브를 세 번 부드럽게 반전하여 DNA를 세척합니다. 기계 전단 기반 라이브러리를 준비하려면 먼저 100 밀리리터 바늘이없는 주사기를 사용하여 모든 DNA를 갈망하십시오. 그런 다음 27 게이지 바늘을 주사기에 넣고 모든 DNA를 부드럽고 천천히 접시에 배출합니다.
29번 반복합니다. 다음으로, 다시 매달린 자기 구슬 143개와 DNA 수리 반응 혼합물의 143마이크로리터를 튜브에 첨가한다. 튜브를 6번 쓸어 서 부드럽게 섞고 튜브를 20 rpm에 회전기에 30분간 놓습니다.
실온에서 2초 동안 1000G에서 튜브를 원심분리하여 시료를 회전한 다음 튜브를 자기 랙에 10분 동안 놓습니다. 다음으로, 튜브가 랙에 있는 동안 상체를 폐기합니다. 갓 준비된 70%에탄올의 마이크로리터 400기를 추가합니다.
30초 동안 기다립니다. 그런 다음 에탄올을 제거합니다. 그런 다음 실온에서 2초 동안 1000G에서 튜브를 원심분리하여 시료를 회전시합니다.
튜브를 마그네틱 랙에 다시 놓고 잔류 에탄올을 제거합니다. 펠릿을 30초 동안 공기 건조시합니다. 다음으로, 자기 랙에서 튜브를 제거하고 T-E 버퍼의 103 마이크로 리터를 추가합니다.
그런 다음 튜브를 부드럽게 쓸어 서 구슬이 버퍼에 덮여 있고 30 분 동안 실온에서 회전에 튜브를 놓습니다. 마지막으로 튜브를 자기 랙에 10분 동안 다시 놓아 구슬을 펠릿합니다. P200 와이드 보어 팁을 사용하여 용액의 100 마이크로리터를 0.2 밀리리터 튜브로 전송하고 최종 수리 dA-tailing 및 어댑터 리칭 반응을 진행합니다.
트랜스포사제 단편화 기반 라이브러리를 준비하기 위해 먼저 HMW DNA의 22마이크로리터, 10 밀리머 트리스 10개, pH 8의 마이크로리터, 0.02%트리톤 X-100, 단편화 믹스의 1마이크로리터를 0.2밀리터 튜브에 첨가하여 DNA 태그화 반응을 유도한다. 다음으로, P200 넓은 보어 팁을 사용하여 반응을 6번 혼합하고 1분 동안 섭씨 30도에서 배양한 다음 1분 동안 섭씨 80도가 됩니다. 섭씨 4도에 잡습니다.
마지막으로 P200 와이드 보어 팁을 사용하여 반응을 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 빠른 어댑터 믹스 1 마이크로리터를 빠르게 추가합니다. P200 와이드 보어 팁을 사용하여 반응을 6번 혼합합니다. 실온에서 1시간 동안 반응을 배양하고 시퀀싱을 진행한다.
시퀀싱을 시작하려면 먼저 나노포어 장치의 채널 중 하나에 새 유량 셀을 삽입합니다. 그런 다음, 함께 시퀀싱 제어 소프트웨어에서 유동 셀의 위치 상자를 확인합니다. 올바른 흐름 셀 유형을 선택하고 검사 흐름 셀의 워크플로를 클릭합니다.
시작 테스트 버튼을 클릭하여 흐름 셀 QC 분석을 시작합니다. 다음으로, P1000 파이펫을 100 마이크로리터로 설정하면 30마이크로리터 미만의 버퍼를 다시 그려 유동 셀에서 거품을 제거합니다. 프라이밍 믹스의 마이크로리터 30를 추가하여 프라이밍 포트의 상단을 덮어 거품을 도입하지 않도록 합니다.
그런 다음 프라이밍 포트에 프리밍 믹스의 파이펫 800 마이크로리터가 유동 셀을 로드합니다. 프라이밍 믹스의 약 50 마이크로리터가 남아 있을 때 팁을 꺼내 프라이밍 포트 상단에 프라이밍 믹스의 나머지 부분을 추가합니다. 다음으로 P1000 파이펫을 사용하면 프라이밍 믹스 200 마이크로리터를 유량 셀에 추가합니다.
그런 다음 로딩 직전에 80 마이크로리터로 설정된 P200 파이펫을 사용하여 DNA 라이브러리를 6번 위아래로 피펫합니다. 마지막으로, 라이브러리믹스드롭와이즈를 샘플 포트를 통해 유량 셀에 로드하고, 시퀀싱 및 데이터 분석을 진행한다. 기계전계 라이브러리 시공을 위한 DNA의 QC 분석은 약 1.9의 260~280의 순도 비, 그리고 260 대 230 비율의 약 2.3의 결과, 좋은 DNA 샘플을 나타냈다.
동일한 결과는 DNA 에 대한 트랜스포세아제 단편화 기반 라이브러리 구조를 사용하여 보였다. 펄스 필드 젤 전기포에 의한 바늘-시어드 HMW DNA의 크기 품질 관리는 HMW DNA의 대다수가 50킬로베이스보다 큰 것으로 나타났다. HG00733 셀을 사용한 4개의 실행 결과, 기계식 전단 기반 라이브러리의 N50이 트랜스포지아제 조각화 기반 라이브러리보다 짧다는 것을 보여주었습니다.
또한, 네 개의 실행 모두 100 킬로베이스보다 긴 길이와 2300 개 이상의 읽기를했다. 기계 전단 기반 라이브러리에 비해 준비 시간이 짧은 트랜스포사제 조각화 기반 라이브러리에서 최대 길이가 더 길어졌습니다. 기계전 기반 라이브러리는 트랜스포사제 조각화 기반 라이브러리에 비해 총 읽기가 더 많이 생성되어 수율이 더 높습니다.
두 라이브러리 모두 일관된 고품질을 보였으며 전체 염기의 97% 이상이 인간 기준 게놈과 일치했습니다. 예상 크기 분포는 네 개의 실행 모두 50킬로베이스 이상의 데이터 비율이 큰 반면, 트랜스포세이션 조각화 기반 라이브러리는 초장기 판독 비율이 더 높은 것으로 나타났습니다. 전반적인 목표는 DNA를 그대로 유지하는 것이므로 DNA의 가혹한 취급을 피하는 것이 중요합니다.
메서드의 값을 최대화할 수 있는 핵심 요소는 계산 해석입니다. 우리 팀은 높은 감도로 모든 범위의 SV를 감지 할 수있는 PICKY라는 긴 읽기 분석 파이프 라인을 개발했습니다. 복잡한 SV 를 감지하고 단일 분자 수준에서 재배열 및 수정을 단계적화하는 것과 같은 흥미로운 영역에 새로운 길을 열 것입니다.
이것은 게놈 건축에 대한 우리의 이해를 크게 향상시킬 것입니다. 페놀은 매우 부식성입니다. 장갑, 안전 안경, 실험실 코트, 긴 바지 및 신발을 포함한 개인 보호 장비가있는 연기 후드에서 작업해야합니다.
