RIBO-seq라고도 불리는 리보솜 프로파일링 기법은 현재 생체 내에서 단백질 합성 과정을 연구하는 가장 효과적인 도구입니다. 이 방법의 장점은 리보솜의 위치와 수를 정확하게 매핑하여 번역을 모니터링할 수 있다는 점입니다. RIBO-seq는 리보솜이 mRNA 분자에 결합하여, 리보누엘리스 소화시 녹취록의 매장된 조각을 보호한다는 사실에 근거한다.
리보솜 발자국이라고 불리는 얻어진 조각은 리보솜의 정확한 위치를 결정하는 결과로 서열화하여 원래의 성적증명서에 매핑될 수 있습니다. RIBO-seq에 동시에, 높은 처리량 총 mRNA 시퀀싱은 기준점을 제공하고 데이터 분석 중에 RIBO-seq 및 RNA-seq 모두에서 데이터의 비교를 가능하게 하기 위해 수행된다. 세포 수확 전에, 번역을 억제하기 위해, 밀리리터 당 100 마이크로 그램의 최종 농도에, 세균 문화에 클로람페니콜을 추가 할 수 있습니다.
1 분 동안 항생제로 문화를 배양하십시오. 이 단계는 수확이 평소보다 오래 걸리는 경우 중요합니다, 번역 억제는 샘플 수집 시간을 연장 할 수 있기 때문에. 미리 데워진 여과 시스템으로 샘플을 수집합니다.
성장 조건을 모방하기 위해 흔들림을 도입할 수 있습니다. 모든 미디어가 멤브레인을 통과했을 때 필터링을 중지하지만 필터가 완전히 건조되는 것을 허용하지 않습니다. 미리 따뜻해지고 소독된 스쿠뮬라를 사용하여 필터 디스크에서 세포를 빠르게 긁어내어 세균성 펠릿을 수집합니다.
즉시 액체 질소로 채워진 50 밀리리터 튜브에 수확 된 세포와 함께 전체 스쿠쿨라를 배치합니다. 수확된 펠릿은 액체 질소로 완전히 덮여 있어야 합니다. 펠릿을 철저히 얼게 하고 이전에 냉각된 스쿠쿨라를 사용하여 냉동 된 세포를 제거하십시오.
뚜껑을 닫고 구멍이 뚫렸는지 확인합니다. 이는 액체 질소가 증발 시 압력 변화로 인해 밀폐된 용기가 폭발할 수 있기 때문에 중요합니다. GMPP, DNA 면봉, 리사스를 위한 신선한 엡펜도르프 튜브를 준비하십시오.
필요한 경우 클로람페니콜을 추가하여 리시스 버퍼를 준비합니다. 샘플당 500마이크로리터의 리시스 버퍼를 별도의 Eppendorf 튜브에 할당하고 얼음 위에 놓습니다. 실험실 소독제와 70%에탄올로 박격포와 유봉을 오염 제거합니다.
박격포를 식히고 액체 질소를 박격포에 부어 유봉하십시오. 냉동 세균성 펠릿을 미리 차가운 박격포로 옮기고 분말로 갈아줍니다. 약 1부의 알루미늄 산화물을 추가하고 연삭을 계속합니다.
필요할 때 액체 질소를 부어 박격포, 유봉 및 세포를 냉각시키고 박격포의 내용이 해동되지 않도록하십시오. 사용하기 직전에, 리시스 버퍼 알리쿼트에 GMPPNP 및 DNA 면봉을 추가합니다. 솔루션을 박격포로 옮기고 계속 연마합니다.
연마하는 동안 리사즈가 천천히 해동하자. 리사스가 완전히 해동되면 혼합물을 미리 식힌 엡펜도르프 튜브로 옮기고 얼음으로 돌아갑니다. 원심분리기 는 섭씨 4도에서 5분 동안 20, 0000 G에서 리사스.
수퍼네이너트는 신선하고 미리 차가운 엡펜도르프 튜브로 옮기고 얼음 위에 놓습니다. NanoDrop을 사용하여 각 희석 된 샘플의 RNA 농도를 측정합니다. 각 용액을 두 부분으로 나누고, RIBO-seq를 위한 RNA의 0.5- 1 밀리그램, RNA-seq에 대한 나머지를 나눈다.
RNA의 1 밀리그램에, Tris pH 8에 있는 MNase의 3.8 마이크로리터를 추가하고, 500 마이크로리터의 총 부피에 용해 버퍼로 위로 얹습니다. 섭씨 25도, 분당 300발의 배양하여 45분간 배양합니다. 인큐베이션이 완료되면 시판되는 RNA 정리 키트로 샘플을 청소하십시오.
8개의 어금니우레아로 15%의 폴리아크릴아미드 TBE 젤을 준비하고 TBE 버퍼가 있는 탱크에 놓습니다. 200볼트의 일정한 전압에서 최소 10분 동안 사전 실행합니다. 샘플을 TBE-Urea 샘플 버퍼와 혼합합니다.
1 분 동안 섭씨 95섭씨도에서 자연을 변성하고 즉시 얼음 위에 놓습니다. 주사기를 사용하여 TBE 버퍼를 젤 웰에 주입하여 우레아를 씻어 내보라고 합니다. 샘플을 로드하여 각 샘플을 분리하고 교차 오염을 방지하기 위해 샘플 사이에 하나의 우물 공간을 남깁니다.
29 뉴클레오티드 긴 올리고를 사용 하 여, 그리고 26 및 32 뉴클레오티드 긴 올리고의 혼합 마커로. 전기 전도를 180 볼트의 일정한 전압으로 실행합니다. 하룻밤 잠복식을 위해 멸균 버퍼를 준비합니다.
전기전도가 끝나면 SYBR 골드로 젤을 얼룩지게 합니다. 멸균 바늘 또는 면도날을 가진 26그리고 32개의 뉴클레오티드 사이 젤의 조각을 소비하고, 별도의 Eppendorf 관에 젤 조각을 놓습니다. 샘플 사이에 바늘이나 면도날을 변경합니다.
각 Eppendorf에 하룻밤 인큐베이션 버퍼 200 마이크로리터를 추가하고 하룻밤 사이에 10 섭씨, 분당 1000 라운드에서 샘플을 배양합니다. 다음 날, RNA 정화 키트로 샘플을 청소하고 18 개의 핵리터가없는 물에서 그들을 엘테하십시오. 획득한 리보소말 발자국은 라이브러리 준비를 위한 준비가 되어 있습니다.
상용 키트를 사용하여 RNA-seq용 시료에 대한 리보소말 RNA 고갈을 수행한다. 다음으로 RNA 정리 키트로 샘플을 청소하십시오. 다음과 같이 알칼리성 가수 분해를 수행;알칼리성 가수 분해 버퍼를 준비하고, 한 부피의 버퍼를 샘플의 한 부피에 추가하고, 25분 동안 95°C에서 배양한다.
반응을 중지하기 위해 각 샘플에 3 개의 Molar 나트륨 아세테이트 pH 5.5의 5 마이크로 리터를 추가합니다. RNA 정화 키트로 샘플을 청소하고 18 개의 핵산염 수분으로 이 샘플을 엘테하십시오. 얻어진 무작위로 단편화된 RNA는 라이브러리 준비를 위한 준비가 되어 있습니다.
각 샘플에 10x 반응 버퍼10마이크로리터와 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 5마이크로리터를 추가합니다. 1시간 반 동안 섭씨 37도에서 배양합니다. 이 시간 후, 1 밀리머 ATP의 3 마이크로 리터를 추가하고 1 시간 동안 37 섭씨 도에서 배양.
다음으로 RNA 정리 키트로 샘플을 청소하십시오. 여기에 제공된 프로토콜에 따라 시판되는 키트를 사용하여 라이브러리 준비를 수행합니다. 6% 폴리아크릴아미드 젤을 사용하여 페이지를 수행합니다.
SYBR 골드로 젤을 얼룩지게 합니다. 라이브러리를 포함하는 절제 젤 조각. RNA-seq 샘플의 경우, 라이브러리는 135와 180뉴클레오티드 사이이며, RIBO-seq의 경우 135~170개의 뉴클레오티드 사이이다.
멸균 바늘이나 면도날을 사용하고 절제된 젤 조각을 별도의 엡펜도르프 튜브에 놓습니다. 샘플 사이에 바늘이나 면도날을 교체해야 합니다. 각 절제된 젤 단편에 100마이크로리터의 뉴클레아제 없는 물을 넣습니다.
그리고 하룻밤 사이에 10섭씨, 분당 450라운드로 배양합니다. 다음 날, DNA 정리 키트로 샘플을 청소하십시오. 획득한 라이브러리는 고감도, DNA 온칩 전기전경, 그리고 차세대 시퀀싱을 통해 품질 및 수량 제어를 위한 준비가 되어 있습니다.
생성된 cDNA 라이브러리는 고감도, DNA 온칩 전기포고증으로 확인된 차세대 시퀀싱에 필요한 적절한 양과 품질을 제시합니다. RIBO-seq 라이브러리를 나타내는 대역과 피크는 RNA-seq 라이브러리를 나타내는 이에 비해 더 좁고 더 잘 정의됩니다. 온칩 전기포에 따르면 라이브러리에는 예상 렌즈가 있습니다.
RIBO-seq 라이브러리에 존재하는 200개의 기본 쌍에 가까운 추가 피크는 완전히 소화되지 않는 리보솜, 예를 들어 rRNA, 또는 유물을 최대 절전 모드로 지정할 수 있으며, 시퀀싱에서 얻은 데이터가 트리밍되고 rRNA tRNA가 필터링될 때 생물정보 분석 중에 폐기될 수 있다. 라이브러리 준비에서 생성된 평균 양의 cDNA는 32나노그램으로 차세대 시퀀싱에 필요한 충분한 양의 물질을 제공합니다. 온칩 전기전도에 의한 품질 관리 후 일루미나넥스트세크 500 플랫폼에서 단일 및 50개의 베이스 페어 시퀀싱을 위해 라이브러리를 당겼습니다.
어댑터와 품질이 좋지 않은 서열을 트리밍하면 RNA-seq 샘플의 샘플당 25~4,700만 개의 판독이 발생했으며, RIBO-seq 샘플의 경우 샘플당 25~5,000만 개의 판독이 발생했습니다. 획득된 데이터는 FastQC로 확인된 품질 관리였습니다. RNA-seq 및 RIBO-seq 샘플 모두 매우 좋은 품질을 제시했습니다.
설명된 프로토콜에 따라 제조된 라이브러리의 매핑은 RNA-seq 샘플에 대한 샘플당 2.4~960만 개의 고유 매핑 된 판독값, RIBO-seq 샘플에 대한 2.3 ~ 1,040 만 개의 고유 매핑 된 판독을 산출했습니다. RIBO-seq 데이터는 RNA-seq 데이터에서 관찰되지 않는 리보솜 및 리보솜 발자국의 시동 리보솜 및 특성에 대응하는 세 배의 주기성과 키가 크고 좁은 피크를 나타낸다. 더욱이, 코딩 시퀀스의 리보소말 발자국 및 mRNA 조각의 평균 커버리지의 프로파일을 보여주는 플롯은 예상대로 RIBO-seq 데이터 세트에서 CDS에 매핑된 판독값의 더 높은 비율을 드러낸다.
매핑된 리보솜 발자국의 시각화는 자당 그라데이션 극심분리에 의한 단일화 회수를 포함하는 표준 RIBO-seq 절차에 따라 수행된 동일한 실험에서 얻은 결과에 비해 매우 유사한 패턴을 보였다. 우리의 프로토콜은 다양한 성장 조건에서 번역 조절을 조사하는 데 사용되었지만 번역 개시 부위 및 새로운 단백질 코딩 유전자의 검출과 같은 번역의 다른 측면을 연구하기 위해 적용 될 수 있습니다. 가이드라인에 따라 준비된 라이브러리의 시퀀싱은 포괄적인 생물정보 분석을 위한 충분한 데이터를 생성합니다.
여기에 제시하는 프로토콜은 빠르고 쉽고 비용 효율적이며 표준 실험실 장비로 수행 할 수 있습니다.
