우리는 모든 이전 멤버 Bouchier 헤이즈 연구소의이 기술 개발에 기여를 인정 하 고 싶습니다. 이 작품 LBH 텍사스 아동 병원 소아 파일럿 수상에 의해 부분적으로 투자 되었다. 우리는 그녀의 팀과 함께 공동에서 출판 된 데이터를 포함 하는 허가 Joya 찬드라 (MD 앤더슨, 휴스턴, 텍사스) 감사 합니다. NIH (NIAID P30AI036211, NCI P30CA125123, 및 NCRR S10RR024574)와 조 엘 M. Sederstrom의 원조 자금 Cytometry 베일 러 의과대학에서 셀 정렬 코어에 의해 설명 하는 시 약의 개발 지원

1입니다. 셀 및 문화 요리 준비
참고: 조직 문화 층 류 두건에 1-3 단계를 수행 합니다. 장갑을 착용 한다.
<ol><li>경우 유리 하단 요리에 사용 하 여, fibronectin 함께 유리 코트. 플라스틱 접시를 사용 하 여 경우 1.2 단계를 건너뜁니다.<ol>
<li>Fibronectin의 0.1 mg/mL 해결책 확인: 1 X PBS의 9 mL에 1 mg/mL fibronectin 솔루션의 1 mL를 희석.</li>
		<li>0.5-1 각의 유리 하단 커버 fibronectin mL 및 실 온에서 1-5 분 동안 품 어.</li>
		<li>Fibronectin 솔루션을 수집 하 고 4 ° c.에서 저장 한 피 펫을 사용 하 여, 참고: fibronectin 솔루션 여러 번 다시 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>일단 1-2 mL 1 X PBS 가진 유리를 세척 하 고 PBS에서 발음.</li>
	</ol>
</li>
	<li>플레이트 1 x 105 셀 해당 셀의 2 ml에서 6 잘 플레이트의 당 문화 미디어 (다른 크기의 웰 스에 대 한 사용 하 여 셀 번호 표 1 참조). 셀 라인을 안정적으로 표현 하는 caspase BiFC 구성 요소 (내용 참조)를 사용 하 여 2 x 105 셀 접시 하 고 치료 단계 (3 단계)를 진행 합니다.</li>
	<li>조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 하룻밤 접시에 셀 수 있습니다.</li>
</ol>2. 세포의 transfection caspase BiFC 구성 요소를 소개 하
<ol><li>적절 한 transfection 시 셀 transfect 참고:이 프로토콜은 최소한의 독성에 대 한 최적화 된 Lipofectamine 2000에 대 한 지침을 설명 합니다. 이 프로토콜은 Hela 세포 MCF7 세포, LN18 세포에 성공적으로 사용 되었습니다. 추가 사용 하는 경우 transfection 시 약 제조업체의 지침에 따라 하 고 필요에 따라 최적화.<ol>
<li>무 균 튜브에 감소 된 혈 청 미디어의 750 µ L를 transfection 시 약의 12 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>5 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
		<li>10 추가 기자 플라스 미드 (형광 단백질, 예를 들어 빨간색 형광 단백질 [RFP], transfected 세포 레이블을 것입니다 인코딩 플라스)의 ng 페 수를 각 잘 살 균 1.5 mL 튜브에.</li>
		<li>20 추가 각 caspase BiFC 플라스 미드의 ng (예를 들어, 20 caspase-2 prodomain [C2 프로]의 ng-VC 및 20 ng C2 프로-VN의) 각 관 (표 2).</li>
		<li>감소 된 혈 청 미디어를 추가 하 여 100 µ L의 총 볼륨까지 각 튜브를가지고.</li>
		<li>P200 피 펫을 사용 하 여 추가 transfection 시 약 해결책의 100 µ L 단계 2.1.2에서에서 플라스 미드 혼합물에 dropwise 방식.</li>
		<li>실 온에서 20 분에 대 한 플라스 미드 transfection 시 믹스를 품 어.</li>
		<li>미디어는 피 펫을 사용 하 여 셀에서 또는 흡입으로 발음 하 고, 우물의 측면 아래로 부드럽게 혈 청 자유로운 미디어의 800 µ L 플라스틱 p1000 피 펫을 사용 하 여.</li>
		<li>P200 피 펫을 사용 하 여, 각 잘에 dropwise DNA-지질 복합체의 200 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>셀 3 h에 대 한 37 ° C에서 조직 문화 인큐베이터에 품 어.</li>
		<li>단층을 방해 하지 않도록 주의 복용는 피 펫 또는 포부 흡입을 사용 하 여 DNA 지질 복합물을 포함 하는 혈 청 무료 미디어를 제거.</li>
		<li>각의 측면 아래로 부드럽게 미리 따뜻하게 (37 ° C) 완전 한 성장 매체의 2 mL 플라스틱</li>
	</ol>
</li>
	<li>최적의 단백질 표정을 위한 24-48 h에 대 한 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 세포를 품 어.</li>
</ol>3입니다. caspase 활성화 유도
<ol><li>약물 또는 caspase 활성화 약 24 h 후 transfection 유도 자극으로 치료.<ol>
<li>원하는 농도의 약물을 미리 예 열 (37 ° C) 이미징 미디어 (완전 한 성장 매체 보충 Hepes [20 m m, pH 7.2-7.5]와 2-mercaptoethanol [55 μ M])와 섞어 부드럽게 추가 (표 3).</li>
		<li>미디어는 피 펫을 사용 하 여 셀에서 또는 흡입으로 발음 하 고, 우물의 측면 아래로 부드럽게 3.1.1에서 솔루션의 2 mL 플라스틱을 피 펫을 사용 하 여.</li>
		<li>치료 컨트롤 한 잘에 약물 없이 영상 미디어를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>37 ° C에서 조직 문화 인큐베이터에 셀을 품 어 또는 단계 4.3 시간 경과 실험에 대 한 진행.</li>
</ol>4입니다. Caspase BiFC 데이터 수집
<ol><li>
한 번 포인트 획득을 위한 Caspase BiFC
	<ol>
<li>현미경 및 형광 광원 제조업체의 지침에 따라 설정.</li>
		<li>RFP 필터 및 리포터 유전자 형광에 초점에서 세포를 찾아.</li>
		<li>손을-집계 카운터를 사용 하 여 시야에 RFP 긍정적인 세포의 모든 계산. 수를 기록 합니다.</li>
		<li>같은 시야를 유지 하면서는 GFP (YFP 필터 또는 사용 가능한 경우)로 전환 하 고, 녹색은 또한 적혈구의 수를 세 손을 집계 카운터를 사용 하 여 (금성 양성). 레드 셀만 금성 양성에 대 한 평가 되도록 두 필터 간에 앞뒤로 전환 합니다. (그림 3) 번호를 기록 합니다.</li>
		<li>각 접시의 세 가지 개별 영역에서 적어도 100 RFP 긍정적인 세포를 계산 합니다.</li>
		<li>각 지역에서 금성-긍정적인 transfected 세포 (즉, 레드 셀 또한 녹색)의 비율을 계산 합니다. 평균 표준 편차를 결과 백분율.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Caspase BiFC의 3-차원 영상
	<ol>
<li>제조업체의 지침에 따라 현미경 켜고 수집 소프트웨어 시작.</li>
		<li>60 x 63 x 오일 목표를 선택 하 고 목적에 오일 한 방울을 배치</li>
		<li>올바른 플레이트 홀더를 사용 하 여 현미경 스테이지에 문화 접시를 놓습니다.</li>
		<li>Using epifluorescence 광원 및 현미경 눈 조각 또는 confocal 레이저와 컴퓨터 화면, 관심 분야를 탐색 합니다.</li>
		<li>RFP 레이저 또는 필터를 사용 하 여 기자 형광에 초점.</li>
		<li>이 시점까지 epifluorescence를 사용 하는 경우 confocal 레이저 광원 전환 하 고 카메라에 의해 획득 및 인수 소프트웨어 컴퓨터 화면에 표시 되는 셀의 라이브 이미지를 시각화.</li>
		<li>조이스틱 제어 및 초점 휠 using, 미세 조정 초점 및 셀의 위치는 셀 뷰 파인더의 중앙에. 서로에서 분리 되어 하 고 중복 되지 셀을 선택 합니다.</li>
		<li>실험에 사용할 최적의 설정을 결정 하는 출발점으로 비너스와 RFP에 대 한 입력 100 ms에 노출 시간을 50% 비율 레이저 파워.</li>
		<li>결과 이미지와 함께 디스플레이 히스토그램 두 채널에 대 한 검사 및 라이브 캡처를 켭니다.</li>
		<li>신호는 낮은 경우 이미지 만들 어렵다 증가 이미지에서 신호까지 증가 백분율 레이저 파워 및 노출 시간 좋아 보인다.</li>
		<li>신호 포화를 도달 하지 않는 확인 하십시오. 뚜렷한 피크는 각 형 석에 대 한 표시 되도록 디스플레이 히스토그램을 검사 합니다. 피크 포함 전체 히스토그램 표시, 경우 낮은 레이저 전원 및 노출 설정 (그림 2)를 입력 합니다.</li>
		<li>신호가 특정 되도록 동일한 조건 하에서 제어 (치료 비 페) 세포를 시각화 합니다. 참고: 단일 색상 transfectants 사용할 수 있습니다 또한 제어 크로스 오버, 그러나 신호는 고유 공간 (예: cytosolic 대 미토 콘 드리 아) 하는 경우이 필요 하지 않습니다.</li>
		<li>선택 하거나 현미경 소프트웨어에서 Z 스택 모듈을 엽니다.</li>
		<li>초점 손잡이 사용 하 여 대략적인 해당 하는 셀의 중심 초점 위치.</li>
		<li>셀이 더 이상 표시 될 때까지 한 방향으로 초점을 조정, 최고 위치이 옵션을 선택 합니다.</li>
		<li>셀이 더 이상 다시 표시 될 때까지 반대 방향으로 초점을 조정 하 고 선택이 하단에 위치 합니다.</li>
		<li>최적의 스텝 크기 (일반적으로 약 20 µ m)을 선택 하 고 자동으로 각 위쪽 및 아래쪽 위치 사이 20 µ m 단계에서 각 채널에 단일 이미지를 데리고 카메라에 수집을 시작 합니다.</li>
		<li>3D 렌더링 소프트웨어를 사용 하 여 3D 이미지 (그림 4영화 1) 재구성.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Caspase BiFC의 시간 경과 영상
	<ol>
<li>실험 전에 적어도 1 시간 현미경 켜고 설정 온도 37 ° c</li>
		<li>40 x 60 x, 또는 63 x 오일 목표를 선택 하 고 목적에 오일 한 방울을 배치.</li>
		<li>올바른 플레이트 홀더를 사용 하 여 현미경 스테이지에 문화 접시를 놓습니다.</li>
		<li>CO2 소스를 사용할 수 있는 접시 홀더 위에 CO2 배달 장치 (일반적으로 CO2를 제공 하는 튜브에 부착 된 플 렉 시 유리 뚜껑)를 배치 합니다. 5% CO2 수준을 설정 하 고 소프트웨어에서 CO2 컨트롤러를 켭니다. CO2 소스를 사용할 수 없는 경우 20 mM Hepes 미디어 버퍼를 포함 합니다.</li>
		<li>이동 transfected 세포 분야 하 고 카메라에 의해 획득 및 인수 소프트웨어 RFP 레이저를 사용 하 여 컴퓨터 화면에 표시 되는 셀의 라이브 이미지를 시각화.</li>
		<li>다음 단계 4.2.8-4.2.12, RFP 레이저에 대 한 백분율 레이저 전원 및 노출 시간에 대 한 설정을 입력 합니다. 가능한 한 낮은 형광 신호를 감지할 수 이러한 값을 유지.</li>
		<li>긍정적인 통제를 사용 하 여 샘플 (예제 표 3 참조 하십시오), 따라 YFP 레이저 빛에 대 한 백분율 레이저 전원 및 노출 시간에 대 한 설정을 입력 하려면 단계 4.2.8-4.2.12. 가능한 한 낮은 아직도 금성 신호를 감지할 수 있는 동안 이러한 값을 유지.</li>
		<li>접시의 각 음에 대 한 다양 한 기자를 표현 하는 하나 이상의 셀을 포함 하는 다른 위치를 선택 합니다.</li>
		<li>촬영 프레임의 시간 경과 및 총 수의 각 프레임 사이의 시간 간격을 입력 합니다. 확인 시간 전에 다음 프레임은 받을 것 이다 모든 선택한 위치를 얻으려고 합니다.</li>
		<li>각 위치를 다시 방문 하 고 수정 하 고 필요에 따라 초점을 업데이트.</li>
		<li>온도 또는 외부 진동의 변화에서 발생할 수 있는 초점 드리프트를 수정 하려면 초점 드리프트 보정 시스템 (사용 가능한 경우)를 켭니다.</li>
		<li>시간 시작 하 고 데이터를 저장.</li>
		<li>(그림 5영화 2) 사용할 수 있는 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 데이터를 분석 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

이 프로토콜 caspase 유도 근접 측정을 분할 형광 단백질의 사용을 설명 합니다. 때문에 매우 밝은, 높은 photostable는 refolding 이며 빠른 13분할 금성이이 기술을 위해 선택 되었다. 따라서, caspase 유도 근접 시 refolding 비너스의 분석은 caspase 단백질 상호 작용 역동성의 실시간 의견 가까이 제공할 수 있습니다. 금성 금성 (비너스-N 또는 VN) 구성 아미노산 1-173의 N terminus 두 약간 겹치는 ?...

Caspase 프로 테아 제 가족은 apoptosis와 타고 난 면제 1에 그들의 중요 한 역할에 대 한 알려져 있다. 그들의 중요성 때문에 결정 언제, 어디서, 그리고 어떻게 효율적으로 특정 caspases 활성화 활성화 경로 caspase의 메커니즘에 대 한 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기에 설명 된 이미징 기반된 프로토콜 caspase 활성화 폭포의 가장 이른 단계 시각화 수 있습니다. 이 기술은 활용 동적 단백질: 단백질 상호 작용의 그 드라이브 caspase 활성화.
Caspases는 두 그룹으로 분할 될 수 있다: 초기자 caspases (caspase-1,-2,-4,-5,-8,-9,-10, 및-12)와 사형 집행 caspases (caspase 3-6과-7). 사형 집행 caspases 미리 형성한 이합체로 셀에 존재 하 고 크고 작은 소 단위 2사이 분열에 의해 활성화 됩니다. 활성화 되 면, 그들은 apoptosis 3의 결과로 수많은 구조 및 규제 단백질을 쪼개 다. 초기자 caspases는 통로에서 활성화 될 및 일반적으로 사형 집행 caspases의 활성화를 방 아 쇠를 첫 번째 caspases. 사형 집행 caspases, 달리 초기자 caspases 이합체 화 4,5에 의해 활성화 됩니다. 이 이합체 화 활성화 플랫폼으로 알려진 특정 큰 분자량 단지를 비활성 단위체의 채용에 의해 촉진 된다. 정품 인증 플랫폼의 특정 단백질: 단백질 상호 작용의 일련에 의해 규율 됩니다. 이러한 보존된 단백질 상호 작용 주제 시작자 caspase의 proform에 의해 중재 되 고 죽음 도메인 (DD), 죽음 이펙터 도메인 (DED) 및 caspase 신규 모집 도메인 (카드) 6 (그림 1A)를 포함 합니다. 정품 인증 플랫폼은 일반적으로 수용 체 단백질과 접합 기 단백질을 포함. 수용 체는 일반적으로 수많은 분자의 oligomerization 수 있도록 구조적 변화를 유도 한 ligand의 바인딩 시 활성화 됩니다. 수용 체 다음 중 채용 caspase 직접 또는 어댑터 분자는 차례로 caspase는 복잡 합니다. 따라서, 수많은 caspase 분자 이합체 화를 허용 하는 가까이에 서. 이 유도 근접 모델 7이라고 합니다. 일단, dimerized는 caspase autoprocessing 활성 효소 4,8을 안정화 하는 역할을 겪 습. 예를 들어 Apaf1 apoptosome의 시 토 크롬 c 미토 콘 드리 아 외 막 permeabilization (MOMP) 라는 프로세스에서 미토 콘 드리 아에서 출시를 다음에 의해 트리거됩니다. Apaf1는 차례로 caspase-9 카드 두 단백질 9에 의해 중재 되는 상호 작용을 통해 보충 한다. CD95 죽음의 복잡 한 신호 유도 (디스크) caspase-8 활성화; 리드 어셈블리에 비슷한 단백질 상호 작용 결과 caspase-2;를 활성화할 수 있습니다 PIDDosome 그리고 다양 한 inflammasome 단지 caspase-1 정품 인증 10,,1112을 시작 하는. 따라서, 초기자 caspases는 유도 근접 고 이합체 화 없이 활성화를 발생 하지 것입니다 일반적인 메커니즘에 의해 특정 활성화 플랫폼을 채용.
Caspase 분자 형광 보완성 (BiFC)는 초기자 caspases의 활성화에서이 첫 번째 단계를 측정 하기 위해 개발 된 영상 기반 분석 결과 caspase 유도 근접 다음 활성화 플랫폼의 직접 시각화 어셈블리입니다. 이 방법은 분할 형광 단백질 비너스의 속성 활용합니다. 금성은 더 밝고 비 형광과 약간 겹치는 두 조각으로 분리 될 수 있다 노란 형광 성 단백질 (YFP)의 더 photostable 버전: 금성 금성 N (VN), 비너스 (금성 C 또는 VC)의 C-말단의 N terminus. 이 파편 refold 될 때 근접 13에 형광을 유지 합니다. 각 비너스 조각 활성화 플랫폼을 caspase의 최소 부분입니다 caspase의 prodomain에 융합 이다. 그러면 그는 caspases 효소 활동을 유지 하지 않습니다 및 따라서 생 이벤트와 관련 된 다운스트림 이벤트의 동시 분석 가능 하다. 금성 파편 refold caspase prodomains 활성화 플랫폼을 채용 하 고 유도 근접을 받 다. (그림 1B)입니다. 결과 금성 형광 정확 하 고 구체적으로 subcellular 지 방화, 활동, 그리고 단일 셀에서 초기자 caspase 활성화 플랫폼의 조립의 효율성을 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다. Confocal 현미경 검사 법에 의해 또는 표준 형광 현미경 검사 법에 의해 취득 될 수 있다 데이터 이미징 및 다른 현미경 방법 등의 숫자에 적응 시킬 수 있다: 실시간으로; caspase 활성화 추적 시간 경과 영상 subcellular 지 방화;의 정확한 결정을 위한 고해상도 이미징 그리고 활성화의 효율성의 끝점 정량화입니다.
이 기술은 caspase-214의 활성화를 조사 하기 위해 처음 개발 되었다. Caspase-2에 대 한 정품 인증 플랫폼은 PIDDosome 생각 된다, 하는 동안 구성 된 수용 체 PIDD (죽음 도메인으로 유도 하는 p53 단백질)와 RAIDD (죽음 도메인 RIP 관련 ICH-1/CAD-3 동종 단백질), 어댑터 PIDDosome-독립적인 caspase-2 정품 인증 보고 되었습니다. 이 caspase-2에 대 한 추가 활성화 플랫폼 존재 15,16나왔다. 모르고 caspase-2 활성화 플랫폼의 전체 구성 요소, 불구 caspase BiFC 기술은 분자 수준 14,17caspase-2 신호 통로의 성공적인 심문을 위해 허용 했다. 우리 또한 성공적으로이 프로토콜 염증 caspases (caspase-1,-4,-5-12)에 대 한 적응 18 , 원칙적으로, 동일한 접근 마찬가지로 나머지 초기자 caspases의 각각을 분석 하는 것을 충분 해야 한다. 이 프로토콜 마찬가지로 적응 될 수 있는 다른 경로 조사 이합체 화는 주요 활성화 신호 했다. 예를 들어, STAT 단백질 이합체 화 Janus 키 니 아 제 (JAK) 19에 따라 인 산화에 의해 활성화 됩니다. 따라서, BiFC 시스템 합계 활성화 뿐만 아니라 많은 다른 경로 동적 단백질 상호 작용에 의해 규제에 대 한 시각화 사용 될 수 있습니다. 다음 프로토콜 이미지 수집 및 분석을 위한 방법론 뿐만 아니라 세포로 기자 들의 도입에 대 한 단계별 지침을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes</td><td>Mattek</td><td>P06G-1.5-20-F</td><td></td></tr><tr><td>Human Plasma Fibronectin Purified Protein</td><td>Millipore</td><td>FC010-10MG</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma</td><td>D8537-6x500ML</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 reagent</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>OPTI MEM I</td><td>Invitrogen</td><td>31985088</td><td></td></tr><tr><td>C2-Pro VC plasmid</td><td>Addgene</td><td>49261</td><td></td></tr><tr><td>C2-Pro VN plasmid</td><td>Addgene</td><td>49262</td><td></td></tr><tr><td>Inflammatory caspase BiFC plasmids</td><td></td><td></td><td>available by request from LBH</td></tr><tr><td>HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components</td><td></td><td></td><td>available by request from LBH</td></tr><tr><td>DsRed mito plasmid</td><td>Clontech</td><td>632421</td><td>similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>2 Mercaptoethanol 1000X</td><td>Invitrogen</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>q-VD-OPH</td><td>Apex Bio</td><td>A1901</td><td></td></tr></tbody></table>

lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation

프로 테아 제 caspase 제품군 apoptosis와 타고 난 면제에 필수적인 역할을 한다. 이 중, 초기자 caspases로 알려진 네가이 경로에서 활성화 될 먼저 있습니다. 이 그룹 포함 caspase-2,-8, 및-9, 뿐만 아니라 염증 caspases, caspase-1,-4, 그리고-5. 초기자 caspases 모두 다음 모집 활성화 플랫폼 이라고 하는 특정 multiprotein 복합물을 이합체 화에 의해 활성화 됩니다. Caspase 분자 형광 보완성 (BiFC)은 어디 caspases 초기자 caspases 그들의 활성화 플랫폼 및 그 결과의 채용을 시각화 하는 데 사용 되는 시작자를 융합 하는 형광 단백질을 분할 영상 기반 접근 유도 근접입니다. 이 형광 판독을의 초기자 caspase 활성화에 필요한 초기 단계 중 하나를 제공 합니다. 다양 한 다른 현미경-기반 접근을 사용 하 여,이 기술은 caspase 활성화 크기 및 caspase 활성화의 활동 인구 수준에 caspase 활성화의 효율성에 양적 데이터를 제공할 수 있습니다. 셀 당 기초에 있는 복합물

DNA 손상에 의해 유도 된 caspase-2 BiFC의 예는 그림 3에 표시 됩니다. Camptothecin는 topoisomerase 나 억제제, DNA 손상 및 caspase-2 활성화를 유도 하는 데 사용 되었다. 빨간 형광 단백질 mCherry 셀 BiFC 프로브 표현 게재 하 고 셀의 총 수를 시각화 하기 기자로 서 사용 되었다. 금성 형광 녹색으로 표시 됩니다 및 큰 puncta는 caspase-2 대표 근접을 유도. 이 세포는 금성...

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Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

이 프로토콜 설명 caspase 분자 형광 보완성 (BiFC); 그들의 활성화에 있는 첫걸음은 초기자 caspases의 유도 근접을 시각화 하는 데 사용할 수는 영상 기반 방법입니다.

Caspase 활성화 분자 형광 보완성을 사용 하 여 경로를 조명

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first ...

lighting-up-pathways-to-caspase-activation-using-bimolecular

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.0K 조회수.  Baylor College of Medicine. 이 프로토콜 설명 caspase 분자 형광 보완성 (BiFC); 그들의 활성화에 있는 첫걸음은 초기자 caspases의 유도 근접을 시각화 하는 데 사용할 수는 영상 기반 방법입니다.

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Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and decreases waste in costs and reagents. Here we describe optimization of a multiplex assay to assess apoptosis following a palmitic acid (PA) challenge in an in vitro hypothalamic model, using both fluorescent and luminescent based assays to measure viable cell counts and caspase-3/7 activity in a 96-well microtiter plate format. Following PA challenge, viable cells were determined by a resazurin-based fluorescent assay. Caspase-3/7 activity was then determined using a luminogenic substrate, DEVD, and normalized to cell number. This multiplexing assay is a useful technique for determining change in caspase activity following an apoptotic stimulus, such as saturated fatty acid challenge. The saturated fatty acid PA can increase hypothalamic oxidative stress and apoptosis, indicating the potential importance of assays such as that described here in studying the relationship between saturated fatty acids and neuronal function.

Multiplex assays can provide beneficial information for basic cellular mechanisms&#160;and eliminate waste of reagents and unnecessary repetitive experiments. We describe here a multiplex caspase-3/7 activity assay, using fluorescent- and luminescent-based methods, to determine cell viability in an in vitro hypothalamic model following oxidative challenge with palmitic acid.

시상 하부 세포 모델에서 세포 사멸을 결정하는 카스파 다중 분석의 사용

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and ...

연구

신경과학

Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators and executioners of apoptosis, the most studied form of programmed cell death. Apoptosis occurs during developmental processes and is a necessary event in tissue homeostasis. Pyroptosis is another form of cell death that utilizes caspases and is a critical process in activating the immune system through the activation of the inflammasome, which results in the release of members of the interleukin-1 (IL-1) family. To assess caspase activity, target substrates can be assessed. However, sensitivity can be an issue when examining single cells or low-level activity. We demonstrate how a fluorogenic substrate can be used with a population-based assay or single-cell assay by flow cytometry. With proper controls, different amino acid sequences can be used to identify which caspases are active. Using these assays, the simultaneous loss of the inhibitors of apoptosis proteins upon tumor necrosis factor (TNF) stimulation has been identified, which primarily induces apoptosis in macrophages rather than other forms of cell death.

The present protocol describes two methods to measure caspase activity through a fluorogenic substrate using flow cytometry or a spectrofluorometer.

형광 분석 또는 유세포분석을 사용한 카스파제 활성 측정

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators ...

생화학

Bimolecular Fluorescence Complementation

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as immunoprecipitation do not provide information on the spatial localization of complexes. In contrast, BiFC monitors the interaction and subcellular compartmentalization of protein complexes. In this method, a fluororescent protein is split into amino- and carboxy-terminal non-fluorescent fragments which are then fused to two proteins of interest. Interaction of the proteins results in reconstitution of the fluorophore (Figure 1)1,2. A limitation of BiFC is that once the fragmented fluorophore is reconstituted the complex is irreversible3. This limitation is advantageous in detecting transient or weak interactions, but precludes a kinetic analysis of complex dynamics. An additional caveat is that the reconstituted flourophore requires 30min to mature and fluoresce, again precluding the observation of real time interactions4. BiFC is a specific example of the protein fragment complementation assay (PCA) which employs reporter proteins such as green fluorescent protein variants (BiFC), dihydrofolate reductase, b-lactamase, and luciferase to measure protein:protein interactions5,6. Alternative methods to study protein:protein interactions in cells include fluorescence co-localization and F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)7. For co-localization, two proteins are individually tagged either directly with a fluorophore or by indirect immunofluorescence. However, this approach leads to high background of non-interacting proteins making it difficult to interpret co-localization data. In addition, due to the limits of resolution of confocal microscopy, two proteins may appear co-localized without necessarily interacting. With BiFC, fluorescence is only observed when the two proteins of interest interact. FRET is another excellent method for studying protein:protein interactions, but can be technically challenging. FRET experiments require the donor and acceptor to be of similar brightness and stoichiometry in the cell. In addition, one must account for bleed through of the donor into the acceptor channel and vice versa. Unlike FRET, BiFC has little background fluorescence, little post processing of image data, does not require high overexpression, and can detect weak or transient interactions. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) is a method similar to FRET except the donor is an enzyme (e.g. luciferase) that catalyzes a substrate to become bioluminescent thereby exciting an acceptor. BRET lacks the technical problems of bleed through and high background fluorescence but lacks the ability to provide spatial information due to the lack of substrate localization to specific compartments8. Overall, BiFC is an excellent method for visualizing subcellular localization of protein complexes to gain insight into compartmentalized signaling.

The subcellular localization of proteins is important in determining the spatio-temporal regulation of cell signaling. Here, we describe bimolecular fluorescence complementation (BiFC) as a straightforward method for monitoring the spatial interactions of proteins in the cell.

Bimolecular 형광 Complementation

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

생물학

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death processes that are generally assumed to be intrinsically irreversible. Promoting anastasis could in principle rescue or preserve injured cells that are difficult to replace such as cardiomyocytes or neurons, thereby facilitating tissue recovery. Conversely, suppressing anastasis in cancer cells, undergoing apoptosis after anti-cancer therapies, may ensure cancer cell death and reduce the chances of recurrence. However, these studies have been hampered by the lack of tools for tracking the fate of cells that undergo anastasis in live animals. The challenge is to identify the cells that have reversed the cell death process despite their morphologically normal appearance after recovery. To overcome this difficulty, we have developed Drosophila and mammalian CaspaseTracker biosensor systems that can identify and permanently track the anastatic cells in vitro or in vivo. Here, we present in vivo protocols for the generation and use of the CaspaseTracker dual biosensor system to detect and track anastasis in Drosophila melanogaster after transient exposure to cell death stimuli. While conventional biosensors and protocols can label cells actively undergoing apoptotic cell death, the CaspaseTracker biosensor can permanently label cells that have recovered after caspase activation - a hallmark of late-stage apoptosis, and simultaneously identify active apoptotic processes. This biosensor can also track the recovery of the cells that attempted other forms of cell death that directly or indirectly involved caspase activity. Therefore, this protocol enables us to continuously track the fate of these cells and their progeny, facilitating future studies of the biological functions, molecular mechanisms, physiological and pathological consequences, and therapeutic implications of anastasis. We also discuss the appropriate controls to distinguish cells that undergo anastasis from those that display non-apoptotic caspase activity in vivo.

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis is technically challenging to detect in vivo because the cells that have reversed the cell death process can be morphologically indistinguishable from normal healthy cells. Here we describe protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis in live animals by using our newly developed in vivo CaspaseTracker biosensor system.

Anastasis에서 Vivo에서 CaspaseTracker 바이오 센서에 의해 감지

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death ...

의학

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct regulation of inflammatory signaling and is activated by proximity-induced dimerization following recruitment to inflammasomes. Caspase-1 is abundant in the monocytic cell lineage and induces maturation of the pro-inflammatory cytokines interleukin (IL)-1&#946; and IL-18 to active secreted molecules. The other inflammatory caspases, caspase-4 and -5 (and their murine homolog caspase-11) promote IL-1&#946; release by inducing pyroptosis. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is a tool used to measure inflammatory caspase induced proximity as a readout of caspase activation. The caspase-1, -4, or -5 prodomain, which contains the region that binds to the inflammasome, is fused to non-fluorescent fragments of the yellow fluorescent protein Venus (Venus-N [VN] or Venus-C [VC]) that associate to reform the fluorescent Venus complex when the caspases undergo induced proximity. This protocol describes how to introduce these reporters into primary human monocyte-derived macrophages (MDM) using nucleofection, treat the cells to induce inflammatory caspase activation, and measure caspase activation using fluorescence and confocal microscopy. The advantage of this approach is that it can be used to identify the components, requirements, and localization of the inflammatory caspase activation complex in living cells. However, careful controls need to be considered to avoid compromising cell viability and behavior. This technique is a powerful tool for the analysis of dynamic caspase interactions at the inflammasome level as well as for the interrogation of the inflammatory signaling cascades in living MDM and monocytes derived from human blood samples.

This protocol describes the workflow to obtain monocytes-derived macrophages (MDM) from human blood samples, a simple method to efficiently introduce inflammatory caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) reporters into human MDM without compromising cell viability and behavior, and an imaging-based approach to measure inflammatory caspase activation in living cells.

인간 단핵구 유래 대식세포에서 근접성을 유도한 염증성 카스파제의 시각화

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

면역학 및 감염병학

Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is the initiation of innate immune programmed cell death (PCD) to eliminate infected or damaged cells and propagate immune responses. However, excess PCD is associated with inflammation and pathology. Therefore, understanding the activation and regulation of PCD is a central aspect of characterizing innate immune responses and identifying new therapeutic targets across the disease spectrum.
This protocol provides methods for characterizing innate immune PCD activation by monitoring caspases, a family of cysteine-dependent proteases that are often associated with diverse PCD pathways, including&#160;apoptosis,&#160;pyroptosis, necroptosis, and PANoptosis. Initial reports characterized caspase-2, caspase-8, caspase-9, and caspase-10 as initiator caspases and caspase-3, caspase-6, and caspase-7 as effector caspases in apoptosis, while later studies found the inflammatory caspases, caspase-1, caspase-4, caspase-5, and caspase-11, drive pyroptosis. It is now known that there is extensive crosstalk between the caspases and other innate immune and&#160;cell death molecules across the previously defined PCD pathways, identifying a key knowledge gap in the mechanistic understanding of innate immunity and PCD and&#160;leading to the characterization of PANoptosis. PANoptosis is a unique innate immune inflammatory PCD pathway regulated by PANoptosome complexes, which integrate components, including caspases,&#160;from other cell death pathways.
Here, methods for assessing the activation of caspases in response to various stimuli are provided. These methods allow for the characterization of PCD pathways both in vitro and in vivo, as activated caspases undergo proteolytic cleavage that can be visualized by western blotting using optimal antibodies and blotting conditions. A protocol and western blotting workflow have been established that allow for the assessment of the activation of multiple caspases from the same cellular population, providing a comprehensive characterization of the PCD processes. This method can be applied across research areas in development, homeostasis, infection, inflammation, and cancer to evaluate PCD pathways throughout cellular processes in health and disease.

This protocol describes a comprehensive method for assessing caspase activation (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9, and caspase-11) in response to both in vitro and in vivo (in mice) models of infection, sterile insults, and cancer to determine the initiation of cell death pathways, such as pyroptosis, apoptosis, necroptosis, and PANoptosis.

선천면역세포사멸을 평가하기 위한 카스파아제 활성화 평가

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is ...

Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important checkpoints of apoptosis, including mitochondrial fragmentation, release of mitochondrial cytochrome c into the cytosol, activation of caspases, chromatin condensation, DNA damage, nuclear fragmentation, plasma membrane blebbing, cell shrinkage, cell surface exposure of phosphatidylserine, and formation of apoptotic bodies. Anastasis can occur when apoptotic stimuli are removed prior to death, thereby allowing dying cells to reverse apoptosis and potentially other death mechanisms. Therefore, anastasis appears to involve physiological healing processes that could also sustain damaged cells inappropriately. The functions and mechanisms of anastasis are still unclear, hampered in part by the limited tools for detecting past events after the recovery of apparently healthy cells. Strategies to detect anastasis will enable studies of the physiological mechanisms, the hazards of undead cells in disease pathology, and potential therapeutics to modulate anastasis. Here, we describe effective strategies using live cell microscopy and a mammalian caspase biosensor&#160;for identifying and tracking anastasis in mammalian cells.

The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis.

추적 아나스타시스, 세포 사멸을 취소 세포 생존 현상에 대한 전략

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important ...

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by available technologies, apoptosis is generally assumed to occur shortly thereafter. Caspases can cleave many functional and structural components to cause rapid and complete cell destruction within a few minutes. However, accumulating evidence indicates that in normal healthy cells the same caspases have other functions, presumably at lower enzymatic levels. Studies of non-apoptotic caspase activity have been hampered by difficulties with detecting low levels of caspase activity and with tracking ultimate cell fate in vivo. Here, we illustrate the use of an ultrasensitive caspase reporter, CaspaseTracker, which permanently labels cells that have experienced caspase activity in whole animals. This in vivo dual color CaspaseTracker biosensor for Drosophila melanogaster transiently expresses red fluorescent protein (RFP) to indicate recent or on-going caspase activity, and permanently expresses green fluorescent protein (GFP) in cells that have experienced caspase activity at any time in the past yet did not die. Importantly, this caspase-dependent in vivo biosensor readily reveals the presence of non-apoptotic caspase activity in the tissues of organ systems throughout the adult fly. This is demonstrated using whole mount dissections of individual flies to detect biosensor activity in healthy cells throughout the brain, gut, malpighian tubules, cardia, ovary ducts and other tissues. CaspaseTracker detects non-apoptotic caspase activity in long-lived cells, as biosensor activity is detected in adult neurons and in other tissues at least 10 days after caspase activation. This biosensor serves as an important tool to uncover the roles and molecular mechanisms of non-apoptotic caspase activity in live animals.

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

To detect healthy cells in whole animals that contain low levels of caspase activity, the highly sensitive biosensor designated CaspaseTracker was generated for Drosophila. Caspase-dependent biosensor activity is detected in long-lived healthy cells throughout the internal organs of adult animals reared under optimized conditions in the absence of death stimuli.

생체 내에서 바이오 센서는 초파리에서 비 세포 사멸 카스파 활동을 추적

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by ...

Visualization of Caspase Activation in Human Monocyte-Derived Macrophages

Source: Bol&#237;var, B. E., et. al., <a href="https://app.jove.com/v/63162">Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages.</a> J. Vis. Exp. (2022).
This video demonstrates the activation of caspase proteins in human macrophages using bimolecular fluorescence complementation reporter proteins. The pro-domains of caspase-1 are fused with non-fluorescent fragments of Venus proteins, which are recruited to inflammasome complexes. The proximity of inflammasomes induces the refolding and fluorescence of Venus fragments, confirming caspase activation in the macrophages.

Source: Bol&#237;var, B. E., et. al., Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. 
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JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immune Response

Immune Modulation

Chemiluminescent Western Blot Assay for Protein Processing

Source: Hillert-Richter, L. K. et al., <a href="https://app.jove.com/v/62842">Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex.</a> J. Vis. Exp. (2021).
This video describes the chemiluminescence-based western blotting of immunoprecipitated lysates. The technique helps determine protein processing and activation. The chemiluminescent signal detected is proportional to the level of protein processing during its activation.

단백질 가공을 위한 화학발광 웨스턴 블롯 분석

Source: Hillert-Richter, L. K. et al., Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex. J. ...