ITSN, PI3K - C2β,이 프로토콜에 사용되는 제어 벡터는 비상업적인 목적으로만, 요청시 저자에서 사용할 수 있습니다. 저자는 친절하게 조언하고 오브라이언의 실험실에서 BiFC 프로토콜을 수립에 사용되는 시약을 제공하는 장 박사 - Deng 후진타오을 인정하고 싶습니다. 카우는 재단 제롬 레조 이네의 기금에 의해 지원되었다. 오브라이언 실험실에서 작업은 NIH (HL090651), DOD (PR080428) 세인트 Baldrick의 재단과 재단 제롬 레조 이네의 기금에 의해 지원됩니다.

A. BiFC 보정 <ol><li> 형광단을 선택합니다. BiFC 퓨전 파트너 (표 1)으로 잘 작동 등 YFP과 금성 등 여러 fluorophores가있다. 비너스의 아미노 및 카르복시 - 터미널 엔드 YFP BiFC 조각이 형광단 형성 2 촉진하기 위해 30 ° C에서 미리 배양을 요구하면서, 37 ° C에서 복잡한를 형성 할 수 있습니다. 낮은 온도에서이 부화 일부 세포 프로세스를 변경할 수 있으며, 조각을 선택할 때 고려되어야합니다. 단백질의 카르복시 - 말단에 융합 비너스의 벡터 Addgene (에서 구할 수 있습니다 <a href="http://www.addgene.org/pgvec1">http://www.addgene.org/pgvec1</a> 컨트롤로 사용하기 위해 추가 구성 예와 함께, seepBiFC - VN173 및 pBiFC - VC155) <a href="http://www.addgene.org/pgvec1?f=c&amp;identifier=22012&amp;atqx=BiFC&amp;cmd=findpl">pBiFC - bJunVN173</a> 그리고 pBiFC - bFosVC155 2. 아미노 터미널 비너스 벡터 (pFLAG - VN173 및 PHA - VC155) 등 추가 벡터는 다음 사이트에서 구할 수 있습니다 <a href="http://people.pnhs.purdue.edu/%7Ehu1/">http://people.pnhs.purdue.edu/ ~ hu1 /</a> . </li><li> 관심의 단백질에 태그를 추가하십시오. BiFC 조각이 후보 단백질의 아미노 또는 카르복시 - 터미널을 종료하기 위해 융합하고 있습니다. 어떤 단백질은 단백질 기능의 장애로 인해 양쪽 끝에 태그를 허용하지 않을 수 있습니다. 예를 들어, GTPases의 라스의 superfamily의 많은 회원들은 그 끝에 BiFC 조각의 카르복시 - 말단 따라서 precluding 첨부 파일에서 수정 지질 있습니다. 따라서 BiFC 조각의 첨부 파일이 관심의 단백질의 기능에 영향을 미칠 수있는 방법에 대한 몇 가지 아이디어를 가지고하는 것이 중요합니다. 그것이 단백질이 어떤 영향을 미치는지 명확하지 않은 경우 태그의 기능은 여러 가지 조합을 테스트해야합니다. BiFC 조각 이외에, 펩티드 링커는 조각 형광단 및 후보 단백질 사이의 유연성을 높이기 위해 포함될 수 있습니다. BiFC 벡터에 여러 복제 사이트 (MCS)은 충분한 유연성, RSIAT, KQKVMNH 및 RPACKIPNDLKQKVMNH linkers를 제공할 수 있습니다 짧은 아미노산 펼쳐진를 인코딩하는 동안 성공적으로 BiFC 실험 3,9에 사용되었습니다 </li><li> transfection 조건을 확인합니다. 여러 돌연변이를 테스트하기 전에, 몇 가지 제어 실험을 수행하여야한다. 시도해야합니다 처음 두 BiFC 조합은 상호 작용하는 것으로 알려진 한 야생 유형과 상호 작용하지 돌연변이 두 야생 유형 단백질입니다. 이 두 조합을 이용하여 DNA와 transfection 시간의 다른 금액은 후보 단백질에 대한 BiFC 신호를 검출 최적의 조건을 결정하기 위해 테스트해야합니다. 우리는 6 자 요리 잘 한 각 BiFC 구조의 0.25ug, 0.5ug, 1.0ug을 테스트하는 것이 좋습니다. 신호 개발을위한 최적의 시간을 결정하기 위해 형광 현미경에 의해 transfection 모니터 세포 다음날. <a href="http://www.addgene.org/pgvec1?f=c&amp;identifier=22012&amp;atqx=BiFC&amp;cmd=findpl">pBiFC - bJunVN173</a> 및 pBiFC - bFosVC155이 구조는 BiFC 유용 긍정적인 제어하고 Addgene (위 참조)에서 사용할 수 있습니다. 또한, 서양 얼룩 분석은 구성의 동일한 표현을 확인하기 위해 수행되어야합니다. 조건은 형광 신호가 두 야생 유형 단백질 있지만 신호에 약간의 사이에서 관찰되는 등이 야생 타입과 돌연변이 단백질 사이의 관찰 선정해야합니다. 마지막으로,이 이외의 특정 상호 작용을 방지하기 위해 가능한 한 낮은 단백질 발현을 유지하는 것이 좋습니다. </li><li> BiFC 조각의 추가 관심의 단백질의 지방화을 바꿀지도 모르겠어 있는지 확인합니다. 각 BiFC 구조 역시 HA 또는 깃발 에피토프 태그를 포함하고 있습니다. Immunostain는 HA 또는 깃발 에피토프 태그뿐만 아니라 B​​iFC 태그가 관심의 단백질의 지방화에 영향을 미치는 경우에는 확인하기 위해 잘 내생 단백질 (가능한 경우) 모두에 대한 세포를 transefected. </li></ol> 세포의 B. 도금 및 Transfection <ol><li> COS 세포는 (1.3x10 5) 1 유리 바닥 Matek 플레이트 및 샘플 당 6 잘 판의 두 우물로 각각 도금하고 있습니다. 세포가 하루 37 ° C. 해결하도록 허용 관심의 후보 단백질에 더 관련된 다른 세포 유형도 사용할 수 있습니다. </li><li> transfection에 대한 DNAs를 준비합니다. 우리는 일반적으로 COS의 transfections에 대한 Lipofectamine (Invitrogen)을 사용합니다. 그러나, 다른 시약 관심의 세포 라인에 대한 더 적절한 수 있습니다. transfection 혼합물 하나의 유리 바닥 요리와 6 자 판의 두 우물 사이에서 분할되기 때문에,이 부문에 대한 계정으로 DNA의 적절한 금액을 사용합니다. 혈청 무료 (SF) DMEM의 250uL에서 DNA를 희석. transfection 제어 등 총 BiFC DNAs의 1 / 5 금액 CFP를 추가합니다. BiFC 부량 들어, CFP 양성에만 세포가 BiFC 신호의 존재에 대해 분석합니다. 따라서 다른 transfection 제어, CFP 스펙트럼은 표 1에 BiFC 쌍 일부 중복됩니다아마 필요했습니다. 250uL SF DMEM (DNA의 10uL Lipofectamine/1ug)에 Lipofectamine을 희석. DNA와 Lipofectamine의 dilutions를 섞습니다. 20 분 대한 상온에서 알을 품다. 참고 : Lipofectamine : DNA의 비율이 세포 유형에 따라 다를 수 있습니다. 관심의 세포 라인에 해당하는 transfection 방법을 사용합니다. </li><li> 따뜻한 SF DMEM과 2X 세포 린스. 6 잘 요리 잘 각 유리 바닥 플레이트 또는 SF DMEM의 2mL를 추가합니다. </li><li> 유리잔 하나 바닥 요리와 6 자 요리의 두 우물 사이에 균등하게 각 transfection 혼합물을 분리. </li><li> 5hrs에 대해 37 ° C에서 세포를 품어. </li><li> transfection 미디어를 제거하고 (DMEM 10% FBS) 전체 미디어 바꿉니다. </li><li> 37 밤새 품어 세포 ° C. 인큐베이션 다음의 transfection의 길이는 관심의 단백질의 표현 수준에 따라 달라집니다. 이 단계는 경험적으로 결정되어야합니다 때문에 장시간 배양이 아닌 구체적인 상호 작용이 발생할 수 있습니다. </li></ol> 이미징을위한 세포의 C. 준비 <ol><li> 세포는 처음에는 긍정적인 컨트롤이 형광 있는지 확인하는 epifluorescent 현미경 검사입니다. 그렇지 않다면 그것은 신호가 관찰됩니다 ° C까지 37 셀을 추가 시간을 허용해야 할 수 있습니다. </li><li> PBS (산도 7.4)로 3 배 세포 린스. 유리 바닥 접시에있는 세포 2 % paraformaldehyde (산도 7.4)을 추가합니다. 얼음 10 분에 대한 세포를 수정. PBS (산도 7.4)로 3 배 세포 린스. 4 스토어 세포 ° C 1mL PBS (산도 7.4)가 있었다. 세포 이미징에 대한 고정해야 없지만, 일단 BiFC 조각은 역동적인 상호 작용 3 돌이킬 수 때문에 예방 분석하는 손상 형광단 개혁. 또한 떼어낸 세포가 신호를 개발하기 위해 지속 것을 명심하십시오. 6 잘 접시에있는 세포를 Lyse과 서양 얼룩 분석을위한 lysates을 준비합니다. lysed 세포가 몇 군데 세포의 대표 수 있도록 모든 세포가 동시에 준비하는 것이 중요합니다. </li></ol> D. 이미징 세포 <ol><li> 형광 강도는 세포마다 계산됩니다. 이미지 각각의 세포를해야합니다. </li><li> CFP는 tranfection 컨트롤로 포함되었습니다에만 CFP 양성 세포 BiFC 신호의 분석을 위해 선택됩니다. 우리는 세포가 CFP와 transfected있다면, 그것은 또한 BiFC 구조와 transfected 있다고 가정합니다. 이러한 접근 방식은 BiFC 신호를 부족 군데 세포가 관심의 단백질이 아닌 하나의 부재로 인해 또는 셀에 두 BiFC 표현 구조 사이의 상호 작용의 부족으로 인해 부정적인 것을 보장합니다. </li><li> 우리는 세포 이미징을위한 자이스 혈구 LSM 510 공촛점 현미경을 사용합니다. 이 현미경을 사용하는 경우 그것은 줌, 핀홀, 검출기 이득, 증폭기 오프셋, 프레임 크기, 스캔 속도, 스캔 평균, 그리고 레이저의 파워 일관성을 유지하는 것이 중요합니다. 모든 이미징 시스템을 사용하는 경우 그것은 형광이 샘플 사이에 비교할 수 있도록 설정을 지속적으로 유지하는 것이 중요합니다. 또한, 형광을 quantifying 때 픽셀이 포화되지 않은 것이 중요합니다. </li></ol> E.가 형광을 Quantifying <ol><li> 형광은 어떤 이미징 소프트웨어를 사용하여 계량 수 있습니다. 우리는 NIH (http://rsb.info.nih.gov/ij/)에서 다운 받으시면됩니다 ImageJ을 활용한다. ImageJ에있는 이미지 파일을 엽니다. AnalyzeSet​​ 측정로 이동합니다. 지역에 대한 확인란을 선택하고 측정 상자에 회색 가치를 의미합니다. </li><li> &#39;자유 재량의 선택&#39;도구를 사용하여 CFP 채널의 전체 세포의 가장자리 주위에 테두리를 그립니다. </li><li> 장소에이 윤곽을 떠나, YFP 채널 이동. AnalyzeMeasure로 이동합니다. 평균 회색 값 픽셀의 숫자 (즉, 세포의 지역 당 평균 형광 강도)로 나누어 선택의 모든 픽셀의 회색 값의 합계입니다. </li><li> 각 이미지에 대한 세포를 포함하지 않는 영역에서 YFP 채널에 원을 그립니다. 배경으로이 지역에 대한 측정을 가져가라. 각각의 이미지에서 배경을 뺍니다. </li><li> 한 샘플에서 몇 군데의 모든 세포에 대한 평균 값을 뺀 회색 배경에 평균. 이것은 세포의 인구의 평균 형광 강도 것입니다. 우리는 세 실험을 통해 약 60 세포 계량 될 제안합니다. </li></ol> F. 대표 검색 결과 : 우리 연구실은 다중 도메인 비계 단백질, 여러 생화학 및 신호 경로에게 10,11,12,13,14을 규제하기 위해 수많은 단백질과 상호 작용 intersectin (ITSN)에 초점을 맞추고 있습니다. ITSN 두 Eps15 상동 (EH) 도메인, 코일 - 코일 지역 다섯 SRC의 상동 3 (SH3) 도메인이 포함되어 있습니다. ITSN의 이상 이소형도 Dbl 상동 (DH)와 Cdc42 15 구아닌 염기 교환 요소로 콘서트에서 pleckstrin의 상동 (PH) 도메인되는 행위가 포함되어 있습니다. 이것은 모듈식 구조는 단백질의 증진 : 단백질 상호 작용과 BiFC 실험을위한 이상적인 후보자를 ITSN 수 있습니다. ITSN의 subcellular 지방화는 바인딩 파트너를 변경하므로 ITSN (unpublis 규제 경로를 변경할 수 있습니다쓰인 데이터). 최근 우리 연구소는 ITSN이 소설 클래스 II PI3K, PI3K - C2β 11 규제를 통해 생존의 연결을 조절 것을 보여주었다. PI3K - C2β의 아미노 터미널 프로 풍부한 도메인 ITSN의 SH3 도메인을위한 두 바인딩 사이트를 포함하고 있습니다. ITSN와 PI3K - C2β 절단 돌연변이와 함께 공동 immunoprecipitation를 사용하여 우리는 ITSN의 SH3A과 SH3C 도메인은 PI3K - C2β의 아미노 터미널 지역과 상호 작용하는 것을 보여주었다. 다음, 우리는이 단지의 subcellular 지방화를 시각화하는 BiFC를 사용합니다. ITSN는 비너스 (PHA - VC155)의 카르복시 - 말단에 융합 비너스 (pFLAG - VN173)와 PI3K - C2β 구조의 아미노 말단에 융합되었다. 또 다른 대조군으로가 아닌 특정 펩타이드는 PHA - VC155에 융합되었다. VN - ITSN 및 VC - PI3K - C2β은 구두점 분포 (그림 2A, 상단 패널)와 BiFC 복잡한을 형성. ITSN와 PI3K - C2β의 공동 침전을 방해 PI3K - C2β의 프로 풍부한 도메인에 변이가 BiFC 신호 (그림 2A, 낮은 패널) 11 감소. ITSN 두 개의 PI3K - C2β 단백질 사이 BiFC 신호의 이러한 차이는 단백질의 표현의 차이 (그림 2B)에 의한되지 않았습니다. <img src="/files/ftp_upload/2643/2643fig1.jpg" alt="그림 1" /> . 그림 1 BiFC에서는 형광단가 (이 경우에는 비너스) (VN) 아미노산으로 분할합니다 - 카르복시 (VC) - 단자 끝납니다. 이 끝을은 흥미가있는 두 개의 단백질을 융합하고 있습니다. 두 단백질이 상호 작용하면, VN 및 VC 조각을 다시 연결 상호 작용의 사이트에 형광단 및 형광의 reconstitution의 결과. 단백질 상호 작용 5 BiFC 단백질을 측정하는 데 사용되는 단백질 조각의 complementation 분석 (PCA)의 구체적인 예입니다. <img src="/files/ftp_upload/2643/2643fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. ITSN와 PI3K - C2β 양식 BiFC 복잡. A. VN - 태그 ITSN은 VC - 태그 PI3K - C3β WT 또는 프롤린 부유한 도메인과 공동 tranfected되었다 돌연변이 (PI3K - C2β - PA). ITSN 및 WT PI3K - C2β 양식 복잡한 (녹색). CFP (적색)은 서양 얼룩이 구성의 동일한 표현을 증명하기 위해 수행되었다 transfection 제어 B.으로 사용되었다. VC - 태그 구성은 HA가 추가됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2643/2643table1.jpg" alt="표 1" /> 표 1. BiFC와 호환되는 여러 벡터가 있습니다. YN155 : YFP 1 - 155aa, YC155 : YFP의 155 - 238aa; YN173 : YFP 1 - 172aa, YFP의 YC173, 173 - 238aa, VN155 : 금성의 1 154aa, VC155 : 금성의 155-238, VN173 : 비너스의 1 172aa, VC173 : 금성의 173 - 238aa, CN155 CFP의 1 154aa, CC155 CFP의 155 - 238aa, GN173 : GFP 중 1 172aa, CitN155 : 시트린 1 - 155aa, CitC155 : 중 155 - 238aa 시트린, CitN173 : 시트린 1 - 172aa, CitC173 : 시트린의 173 - 238aa, CerN173 : 세룰리안 2,3,9 1 - 172aa.

<ol>
	<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+molecular+interactions+by+fluorescence+complementation.">Visualization of molecular interactions by fluorescence complementation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 449-456 (2006).</li><li>Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+fluorescent+protein+fragments+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis+under+physiological+conditions.">Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions.</a> Biotechniques. 40, 61-66 (2006).</li><li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+AP-1+NF-kappaB+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET.">Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 151-156 (2008).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

전체 세포의 단백질 상호 작용과 이들 단지의 subcellular 지방화를 결정 : BiFC 단백질을 시각화를위한 훌륭한 방법입니다. BiFC의 장점은 상호 작용하는 단백질이 형광 것을 있으며, 과도 상호 작용을 안정화하고, 영상 데이터의 후처리가 최소집니다. 이 방법의 두 가지 단점은 형광단 및 형광단 복합의 비가 역성에 대한 성숙 시간입니다. 일부 응용 프로그램에서이 비가 역성은 장점으로 사용할 수 ?...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>10-013</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>35-011-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Bottom Microwell dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Matek</td>
<td>P35G-1.5-14C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-well dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>35-3846</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18324020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>21-031-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Confocal Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>LSM510 META</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

bimolecular fluorescence complementation

신호 단지의 subcellular 배포를 정의하면 해당 복잡한에서 출력을 이해하는 데 필수적입니다. 같은 immunoprecipitation과 같은 기존의 방법은 단지의 공간적 지방화에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 반대로, BiFC는 상호 작용과 단백질 단지의 subcellular compartmentalization을 모니터링합니다. 이 방법에서는 fluororescent 단백질 그 다음으로 흥미가있는 두 개의 단백질에 융합 아르 아미노 및 카르복시 - 터미널이 아닌 형광등 조각으로 분할합니다. 형광단의 reconstitution (그림 1) 1,2에있는 단백질 결과의 상호 작용. BiFC의 제한은 조각난 형광단가 재구성되면 복잡한 3 되돌릴 수있다는 것입니다. 이러한 제한은 일시적인 또는 약한 상호 작용을 검출에 유리하지만, 복잡한 역학의 운동 분석하는 걸로. 추가 주의해야 할 점은 재구성 flourophore 다시 실시간으로 상호 작용 4의 관찰을 precluding, 성숙하고 형광을 30 분 필요합니다. 단백질 상호 작용 5,6 : BiFC는 녹색 형광 단백질 변형으로 기자 단백질 (BiFC), dihydrofolate 환원 효소, B - lactamase, 그리고 단백질을 측정 루시페라제 고용 단백질 조각의 complementation 분석 (PCA)의 구체적인 예입니다. 단백질 연구에 다른 방법 : 세포의 단백질 상호 작용 형광 공동 현지화 및 포스터 공명 에너지 전달 (무서워) 7을 포함합니다. 공동 지방화를위한 두 개의 단백질이 개별적으로 직접 형광단 또는 간접 immunofluorescence을 통해 태그가 있습니다. 그러나,이 방법은 어려운 공동 현지화 데이터를 해석할 수 있도록 아닌 상호 작용하는 단백질의 높은 배경에 이르게한다. 또한, 공촛점 현미경의 해상도의 한계로 인해 두 단백질은 반드시 상호 작용없이 공동화된 나타날 수 있습니다. 관심의 두 단백질이 상호 작용하면 BiFC으로 형광은 관찰됩니다. 안달은 단백질 연구를위한 또 다른 우수한 방법이다 : 단백질 상호 작용을하지만, 기술적으로 도전하실 수 있습니다. 안달 실험은 기증자와 수용체가 세포에서 유사한 밝기와 stoichiometry 것으로합니다. 또한, 하나는 수용체의 채널과 반대로 기증자의를 통해 출혈을 차지합니다. 걱정과는 달리, BiFC는 이미지 데이터의 작은 배경 형광, 작은 후처리가 높은 overexpression을 필요로하지 않으며, 약하거나 과도 상호 작용을 감지할 수 있습니다. Bioluminescence의 공명 에너지 전달 (브렛)은 기증자가이를 흥미로운 수용체 발광 생물이 될 수있는 기판을 catalyzes 효소 (예 : 루시페라제)입니다 제외하고 걱정 비슷한 방법입니다. 브레트 통해 출혈의 기술적인 문제와 높은 배경 형광이 부족하지만, 인해 특정 구획 8 기판 지방화의 부족으로 공간 정보를 제공하는 능력이 부족. 전체 BiFC는들에게만 신호에 대한 통찰력을 얻기 위해 단백질 단지의 subcellular 지방화를 시각화를위한 훌륭한 방법입니다.

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Bimolecular Fluorescence Complementation

단백질의 subcellular 지방화는 세포 신호의 spatio - 시간적 규정을 결정 중요합니다. 여기, 우리는 세포에있는 단백질의 공간적 상호 작용을 모니터링을위한 간단한 방법으로 bimolecular 형광 complementation (BiFC)를 설명합니다.

Bimolecular 형광 Complementation

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Research

JoVE Journal

Biology

27.7K 조회수.  University of Illinois at Chicago. 단백질의 subcellular 지방화는 세포 신호의 spatio - 시간적 규정을 결정 중요합니다. 여기, 우리는 세포에있는 단백질의 공간적 상호 작용을 모니터링을위한 간단한 방법으로 bimolecular 형광 complementation (BiFC)를 설명합니다.

비디오: Bimolecular Fluorescence Complementation

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

식물 Protoplasts의 형광 활성 세포 정렬

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

연구

생물학

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

헬리 우스 진 건을 사용하여 양파 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 Bimolecular 형광 Complementation (BiFC) 어세이

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

게이트웨이 가능 Bimolecular의 형광 Complementation (BiFC) 시스템을 사용하여 공장에서 단백질 상호 작용의 검출

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns

Microbes typically live in communities. The spatial organization of cells within a community is believed to impact the survival and function of the community1. Optical sectioning techniques, including confocal and two-photon microscopy, have proven useful for observing spatial organization of bacterial and archaeal communities2,3. A combination of confocal imaging and physical sectioning of yeast colonies has revealed internal organization of cells4. However, direct optical sectioning using confocal or two-photon microscopy has been only able to reach a few cell layers deep into yeast colonies. This limitation is likely because of strong scattering of light from yeast cells4.
Here, we present a method based on fixing and cryosectioning to obtain spatial distribution of fluorescent cells within Saccharomyces cerevisiae communities. We use methanol as the fixative agent to preserve the spatial distribution of cells. Fixed communities are infiltrated with OCT compound, frozen, and cryosectioned in a cryostat. Fluorescence imaging of the sections reveals the internal organization of fluorescent cells within the community.
Examples of yeast communities consisting of strains expressing red and green fluorescent proteins demonstrate the potentials of the cryosectioning method to reveal the spatial distribution of fluorescent cells as well as that of gene expression within yeast colonies2,3. Even though our focus has been on Saccharomyces cerevisiae communities, the same method can potentially be applied to examine other microbial communities.

We present a protocol for freezing and cryosectioning yeast communities to observe internal patterns of fluorescent cells. The method relies on methanol-fixing and OCT-embedding to preserve the spatial distribution of cells without inactivating fluorescent proteins within a community.

형광 패턴 검사를위한 효모 커뮤니티 Cryosectioning

Microbes typically live  in communities. The spatial organization  of cells within a community is believed to impact the survival and function of the  ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

이분자 형광 보완의 유세포 분석 : 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 높은 처리량 정량 방법

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

신속한 분석 및 형광 현미경 이미지의 탐사

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

담배 원형질체 및 잎에 이분자 형광 보완에 의해 시각 단백질 - 단백질 상호 작용

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

비례 생체 분자 비콘을 사용하여 살아있는 세포의 단일 엔지니어링 RNA 성적 증명서의 실시간 영상

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

살아있는 세포의 단백질 조각 보완 분석 (PCA)에 의해 게놈 전체 단백질 - 단백질 상호 작용 상영

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...