이 프로토콜은 세포 사멸 과정의 활성화에 대한 다면적인 이해를 제공하여 질병 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공하고 치료 전략을 알릴 수 있습니다. 이 프로토콜은 더 간단한 기술의 사용에 의존하고 활성화를 크게 결정하기 위해 내인성 세포의 단일 집단에서 필수적인 여러 카스파제의 활성화에 액세스합니다. 선천성 면역 세포 사멸은 감염에서 염증성 질환, 암에 이르기까지 질병 스펙트럼 전반에 걸쳐 연루되어 있습니다.
카스파아제 활성화를 통한 세포 사멸의 분자 메커니즘을 이해하면 질병 과정에 대한 중요한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 실험실의 박사후 연구원인 Dr.Julieann이 절차를 시연할 것입니다. 골수를 분리하고 BMDM을 분화시킨 후 세포를 인플루엔자 A 바이러스로 감염시킵니다.
20 개의 플라크 형성 단위의 감염 다중도에서 필요한 바이러스 부피를 계산하십시오. BMDM에서 배지를 제거하고 500 마이크로리터의 PBS로 세포를 한 번 세척합니다. 열 비활성화 FBS가 없는 고포도당 DMEM에 450 마이크로리터의 인플루엔자 A 바이러스를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 섭씨 37도에서 1시간 동안 가습 인큐베이터에서 1시간 동안 배양하여 흡수되도록 합니다.
1 시간의 배양이 끝나면 50 마이크로 리터의 열 비활성화 FBS를 추가하고 총 12 시간 동안 섭씨 37 도의 인큐베이터로 플레이트를 되돌립니다. 배양 12 시간 후, 배양기에서 플레이트를 제거한다. 150마이크로리터의 상층액을 흡인하고 이를 버리거나 상층액 분석을 위해 저장합니다.
나머지 상층액을 제거하지 마십시오. 이제 웰당 50 마이크로리터의 카스파제 용해 완충액과 100 마이크로리터의 4개의 XSDS 완충액을 결합하여 단백질 수집 용액을 만듭니다. 그런 다음 150 마이크로 리터의 혼합물을 각 웰에 첨가하십시오.
각각의 웰에 대해, 용해된 세포 및 상청액을 수집하기 위해 혼합물을 피펫팅한다. 피펫팅하는 동안 피펫 팁으로 웰 바닥을 긁어 세포를 파쇄합니다. 긁어내고 피펫팅한 후 단백질 용해물을 라벨이 붙은 1.5밀리리터 튜브에 수집합니다.
열 블록을 사용하여 모든 튜브를 섭씨 100도까지 12분 동안 가열합니다. 열 블록에서 튜브를 제거하고 실온에서 30초 동안 14, 500G에서 원심분리하여 불용성 성분을 펠릿화합니다. 10웰이 있는 12% 폴리아크릴아미드 겔로 전기영동 장치를 준비합니다.
전기 영동 장치에 실행 버퍼를 채우고 젤 빗을 제거합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 100도에서 5분 동안 가열합니다. 로딩하기 전에 샘플을 실온에서 30초 동안 14, 500G에서 원심분리합니다.
그런 다음 30마이크로리터의 샘플을 각 웰에 천천히 로드합니다. 카스파제 1, 3, 7 및 8 블롯에 대해 상청액 및 단백질 용해물 및 카스파제 용해 완충액 또는 조직 균질액을 조합하여 사용하고, 카스파제 11 및 9에 대해서는 프로토콜에 기재된 단백질 용해물 DN RIPA 완충액 또는 조직 균질액을 사용한다. 6개의 카스파제를 한 번에 모두 평가하려면 동일한 절차를 사용하여 동일한 샘플을 6개의 겔 각각에 로드합니다.
전기 영동 장치를 전원에 연결하고 전원을 80 분 동안 20 볼트로 설정하여 겔 실행을 시작합니다. 처음 20분 후 100-45분 동안 전원을 60볼트로 조정합니다. 염료 전면을 관찰하십시오.
염료 전면이 젤 바닥에 도달하면 전원을 끕니다. 겔이 실행되는 동안 원고에 설명된 대로 전사 완충액을 준비합니다. 매번 용액을 신선하게 만드십시오.
겔 방출기를 사용하여 전기영동 장치로부터 겔을 제거한다. 젤의 전사 스택을 설정하려면 PVDF 멤브레인을 메탄올에 1분 동안 담가 활성화합니다. 두 조각의 여과지, 겔, 및 PVDF 멤브레인 및 전사 완충액을 5분 동안 미리 적십니다.
이 5분 배양 동안 PVDF 멤브레인과 젤을 별도의 용기에 보관하십시오. 세미 드라이 시스템에서 이송 스택 조립을 시작합니다. 하단 백금 나노면에 여과지 한 장, PVDF 멤브레인, 젤, 마지막으로 여과지 한 장을 놓습니다.
레이어 사이의 기포를 부드럽게 굴리거나 누르고 시스템 상단을 닫습니다. 이제 전원에 연결하십시오. 25분 동안 전원을 40볼트로 설정합니다.
이송 후 이송 스택을 분해하고 멤브레인을 모아 정사각형 페트리 접시에 넣습니다. 다음으로, 5 % 탈지 우유 용액 15 밀리리터를 첨가하여 막 차단을 수행하고 실온에서 50-70 RPM의 로킹 쉐이커에서 1 시간 동안 멤브레인을 배양합니다. 인큐베이션 후, 블로킹 용액을 제거하고, 희석된 항체 용액 10밀리리터를 첨가하고, 이전에 입증된 바와 같이, 실온 또는 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 2시간 동안 인큐베이션한다.
그런 다음 항체 용액을 수집하고 실온에서 10분 동안 흔들리는 진탕 상에서 멤브레인에 15밀리리터의 TBST를 첨가하여 멤브레인을 세척합니다. TBST를 폐기하십시오. 15 밀리리터의 TBST로 세척을 세 번 반복하십시오.
희석된 2차 HRP 접합 항체 용액 10밀리리터를 추가합니다. 실온에서 1 시간 동안 흔들리는 셰이커에서 배양하십시오. 배양이 끝나면 항체 용액이 제거되면 실온에서 10분 동안 흔들리는 셰이커에 TBST 15ml를 첨가하여 멤브레인을 세척합니다.
세척 단계를 완료하고 TBST를 제거한 후 고감도 HRP 기질 10 밀리리터를 첨가합니다. 실온에 1분간 둡니다. 기판에서 멤브레인을 제거합니다.
액세서리 흰색 트랜스 트레이가 하단 위치에 삽입된 상태에서 화학발광 이미저를 사용하여 이미징을 직접 진행합니다. 자동 노출 모드를 사용하여 멤브레인을 노출시킵니다. 인플루엔자 A 바이러스 감염 후의 야생형 및 ZBP1 돌연변이체에서 프로파아제 1, 11, 3, 7, 8 및 9, HSV1 감염 후의 야생형 및 AIM2 돌연변이, 및 Francisella novicida 감염 후의 야생형 및 NLRP3 돌연변이 BDMs를 지질다당류 및 ATP 자극 후의 활성형 카스파제 1, 11, 3, 7, 8 및 9를 분석한다.
업스트림 PANoptosis 센서가 없는 세포는 동족 PANoptosis 유도 자극에 대한 반응으로 강력한 세포 사멸을 겪지 않습니다. 인플루엔자 A 바이러스 감염은 ZBP1-PANoptosome의 형성을 유도하고 ZBP1 결핍 세포는 인플루엔자 A 바이러스 감염 동안 세포 사멸로부터 유의하게 보호된다. 유사하게, HSV1 및 Francisella novicida 감염은 AIM2 PANoptosome의 형성을 유도하고, AIM2 결핍 세포는 이러한 감염에 대한 반응으로 강력한 세포 사멸을 겪지 않습니다.
업스트림 인플라마솜 센서가 없는 세포는 각각의 자극에 대한 반응으로 세포 사멸로부터 보호되며, NLRP3 결핍 세포는 지질다당류 및 ATP에 대한 반응으로 세포 사멸을 겪지 않습니다. 특정 카스파아제를 결정하기 위해 두 세포 용해물의 혼합물을 준비하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 제트를 로딩한 후, 발광 샘플은 후속 조치를 위한 카스파제 목표의 무결성을 유지하기 위해 영하 20도 동안 보관해야 합니다. 이 프로토콜과 함께 실시간 세포 사멸 이미징 또는 LDH 분석을 사용하여 세포 사멸의 실행을 모니터링할 수 있으며 ELIZA를 사용하여 다양한 유형의 세포 사멸을 겪고 있는 세포에서 사이토카인 또는 DAMP의 방출을 확인할 수 있습니다.
