Name: development and validation of an ultrasensitive single molecule array digital enzyme-linked immunosorbent assay for human interferon-α
Uploaded: 2018-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
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DD와 안산 지원은 ANR에서 인정 (프로젝트 IFNX, 아니. CE17001002)와 단일 클론 항 체를 제공 하기 위한 ImmunoQure AG. 우리 감사 브리 짓 베이더 Meunier, 나탈리 아 Bellon, 크리스틴 Bodemer, 알렉스 Belot, 이자벨 Melki, 그리고 피에르 Quartier 임상 샘플 제공. 유럽 연구 위원회를 인정 하는 안산 (GA 309449: 안산 교제), 베어링 참고 ANR-10-IAHU-01 "미래 위한 투자" 프로그램 국가 연구 기관 (프랑스)에 의해 관리 되는 국가 보조금.

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저자는 공개 없다.

여기, 우리 개발 및 인간의 샘플 ( 표 1에 요약 된 단계)에서 IFN-α 단백질의 직접 정량화에 대 한 높은 재현성, 磁 단일 분자 배열 디지털 ELISA의 유효성 검사를 설명 합니다. 분석 결과의 개발에서 가장 중요 한 단계 중 하나는 항 체 쌍16, 속도 론 및 성공적인 분석 결과 핵심 되는 epitope 바인딩 특성의 선택입니다. 대상으로 동일한 epitope 또는 그 입체 장애를 일으킬 짝된 단일 클론 항 체의 사용을 피하기 위해 중요 하다. Polyclonal 항 체는 이러한 한계를 극복 하기 위해 탐지 항 체로 사용 될 수 있습니다. 어떤 주어진된 단계에서 원하는 감도 달성 되지 않은, 경우 추가 최적화 가능성 고려 되어야 한다. 이 대체 항 체 쌍, 매개 단백질 종류에에서 변화를 사용 하 여 포함 될 수 있습니다 (예: BSA < 카 제인), pH (6.0-8.5), 이온 강도, 버퍼링 용량 (예: NaCl 및 인산 염 농도), 캐리어 구슬, 또는 계면의 존재. 다양 한 매개 변수 절약 최적화 된 단일 분자 배열 분석 결과 개발할 때. 그러나, 전반적으로, 높은 신호: 배경 비율 및 최소한의 Lod를 주는 조건이 선호 하는 것 ( 그림 1, 그림 2및 그림 3참조).
특이성에 관한 IFN-α 분석 결과 다른 IFNs에 대 한 교차 반응 없음 테스트 (β, γ, λ1, λ2, ω) 보였다 (그림 4a)와 모든 13 IFN-α 하위 (그림 4b) 탐지 가능 했다. 그러나, 분석 결과 IFN-α2 하위 형식, (그림 4b 및 보충 표 4)에 대 한 낮은 선호도 보였다. 흥미롭게도, IFN-α2 (a, b의 c)의 다른 클래스에 대 한 서로 다른 감도 또한 관찰 되었다, 고유 제조 절차 또는 다른 아미노산 시퀀스를 수 있는 IFN-α2 하위 했다 다른 상업적으로 공급 업체입니다. 이 유일한 예외와 함께 모든 IFN-α 종 매우 비슷한 응답 했다. 분석 결과의 특이성은 안티-IFN-α (그림 6 및 보충 표 6) 신호를 폐지 한 복제와 샘플의 전처리에 의해 입증 되었습니다.
이 기술의 주요 장점 중 하나입니다 관심의 모든 분석 대상된16수 잠재적으로. 또한, 다른 생물 표본 테스트할 수 있습니다, 혈 청, 플라스마, 중추 신 경계, 세포 lysates, 문화 supernatants31 심지어 숨을32등. 일반적으로, 플라즈마의 1:3 희석 잠재적인 단일 분자 배열 분석기의 막힘을 피하기 위해 수행 됩니다. 그러나, 관심의 분석 관련 생물학 견본에서 매우 낮은 농도에서 존재 될 수 있고 샘플의 높은 농도 (분석 감도)에 따라 필요한33수 있습니다. 좋은 감도34유지 하면서 멀티플렉싱 가능성이 있지만, 그것은 더 많은 도전 과정 6 단백질 같은 실험에서 아직 수35개발 보다 큰 측정 분석 실험.
감지 하 여 cytokines와 같은 낮은 농도에 다른 생물학 관련 단백질 계량 능력 응용 프로그램33,36의 완전히 새로운 범위를 연다. 그것은 잘 알려진 수많은 단백질 인 지금까지 최고의 ELISAs37의 검출 한계 이하로 매우 낮은 농도 에서도 그들의 효과 발휘. 다른 immunoassay 기술을 기존의 ELISA19이점을 제공, 제시 여기 단일 분자 배열 디지털 ELISA는 낮은 농도에서 cytokines의 磁 탐지에 대 한 재현 가능 하 고 강력한 플랫폼 인간의 샘플입니다. 따라서,이 기술은 바이오 마커 발견과 다양 한 질병의 향상 된 환자 관리에 대 한 엄청난 잠재력을 제공합니다.

유형 I IFNs는 항 바이러스 면역 응답을 꾸미고 있는 중앙 역할 cytokines의 가족. 그들은 처음 발견 되었다이 삭과 Lindenmann 60 여 년 전1,2 , 그것은 지금 polypeptides의이 다른 유형의 가족 14 다른 서브 클래스 (13 IFN-α 하위 및 1 IFN-β) 구성 알려져. 유형과 유형 I IFNs는 바이러스 성 감염의 허가에 필수적인 하지만 또한 다양 한 인간의 질병 상태, 자가 면역 질환 반성 루 푸 스 (SLE), 청소년 dermatomyositis (JDM)를 포함 하 여의 병 리에 연루 되어 내가 interferonopathies 구성 유형에서 IFN 유도 신호 나 병 리3,,45,,67에 결과.
공부 유형 I IFN 단백질 수준의 생물 학적 샘플에 도전 하고있다 그것의 초기 식별 이후는 "방해 물질"1,2. 현재, 샌드위치 Enzyme-Linked ImmunoSorbent 분석 결과 (ELISA) IFN-α 단백질의 검출에 대 한 가장 널리 사용 되는 방법 이다. 불구 하 고 특정, 간단 하 고 빠른, 종류와 같은 중요 한 한계를 제시 나 IFN ELISAs 감도 제한. 또한, 모든 IFN-α의 측정 자신의 감지 능력 및 감도 여러 분석 실험의 사용을 해야합니다. 상업적인 ELISAs IFN-α의 다른 하위를 검색 하는 동안, 그들의 감도 제한 됩니다 (1.95 pg/mL, 12.5 pg/mL, 및 12.5 pg/mL, 각각)는 종종 생물학 견본에서 IFN-α 단백질을 검출 하기 충분 하지 않습니다. 이 제한을 극복 하기 위해 분석 척도 개발 되었습니다 몇 가지 생물 학적 프록시 유형 I IFN 유도 유전자 발현 또는 기능 활동8,,910,11, 를 측정 하 여 12 , 13 , 14. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 분석 IFN-α 단백질의 직접 측정을 제공 하지 않습니다.
본이 연구에서는 단일 분자 배열 디지털 ELISA 기술은 단일 IFN-α 단백질 분자의 검출에 대 한 분석 결과 개발에 사용 되었다. 그러나 디지털 ELISA 기존의 ELISA로 동일한 기본적인 화학, 반응 50000 개별 46 femtoliter 크기의 웰 스15,16으로 구성 된 배열에서 일어난다. 단일 단백질 분자는 항 체-코팅 된 상자성 구슬에 의해 점령 하 고는 biotinylated 탐지 항 체, 효소 공액, streptavidin-β-galactosidase (SBG)의 바인딩 다음으로 표시. 그 후, 구슬 fluorogenic 효소 기질, resorufin-β-D-galactopyranoside (까지), 단일 분자 배열에 함께 일시 중단 됩니다. 볼륨을 줄여 반응 2 십억 번17, 형광 신호의 높은 현지 농도 달성 하 고 단일 분자 수로 각 분자는 이제 안정적으로 될 수 있는 신호를 생성 가능 하 고, 될 측정18. 본질적으로 단일 분자 배열은 단일 immunocomplexes를 계산 하 고 구슬 (AEB) 당 효소의 평균 수를 결정 할 수 있다. 단백질 농도 immunocomplexed 구슬과 구슬에의 총 수 사이의 비율 사이 직접적인 상관으로 단백질 분자의 정량화/디지털화 허용 신호를 감지 하는 microwells를 계산 femtoliter 크기의 약 실입니다.
양 외. 9 다른 기술 및 4 개의 cytokine immunoassays19다른 플랫폼 걸쳐 분석 결과 정밀도, 감도, 그리고 데이터 상관 관계를 비교 하는 것을 목적으로 사용 하는 광범위 한 크로스-플랫폼 평가 연구를 수행 합니다. 연구의 주요 조사 결과 중 하나는 단일 분자 배열 및 단일 분자 immunoassay 계산 하위-pg/mL 농도 범위 내 인간의 혈 청에서 cytokines의 검출에 대 한 높은 감도 제시 했다. 단일 분자 배열 디지털 ELISA cytokine 분석 실험 Crohn의 질병20, IFN-α interferonopathy 및 자동-면역 환자 7, 일리노이-6와 TNF-α의 역할을 연구 하기 사용 되 고 다른 post-translationally C-X-C의 형태 수정 만성 간염 및 건강 한 기증자 sitagliptin21,22수신 모티브 chemokine 10 (CXCL10) 당뇨병 성 망막 증23; 환자에 rhodopsin의 측정을 포함 하는 다른 응용 프로그램 neurofilament의 혈 청/플라즈마 측정을 통해 뇌 병 리의 연구에 빛 다 발성 경화 증 및 알 츠 하이 머 병의 맥락에서24 및 아 밀 로이드 β 1-42 펩 티 드25, 각각. HIV 바이러스 성 저수지26의 특성 등 향상 된 병원 체 감지 하 고 또한 DNA27 마이크로 RNAs28의 검출에 대 한 단일 분자 배열 분석 실험도 사용할 수 있습니다. 특정 항 체 쌍을 사용할 수 경우 관심의 어떤 분석에 대 한 분석 결과 개발 될 수 있는 단일 분자 배열 기술의 주요 이점은이 다용도입니다. 또한, 사제 시험 장비는 상업적으로 사용할 수 있는 프로토콜 아래의 수정 된 형태로 상세한 새로운 분석의 개발을 허용.
여기, 단 하나 분자 배열 분석 결과 대 한 개발 및 유효성 검사 단계에 대 한 자세한 설명은 IFN-α 단백질 검출에 대 한 향상 된 감도에 그 결과 제공 됩니다. 단일 분자 배열 분석 실험에 대 한 항 체는 매우 구체적인, (와 함께 종 특이성 경우 관련) 관련 단백질 교차 반응성을 피하 해야 합니다. 이상적으로, KD 10-9 M 보다 작은 항 체는 선택 되어야 한다; 높은 선호도 높은 신호 생산 강한 바인딩을 확인합니다. 항 체-항 원 바인딩의 활동 또한 중요 하 고, 빠른 K에에 있으며 느린 K에서 항 원-항 체 복잡 한 어셈블리를 부탁 합니다. 항 체 쌍을 1-100 pg/ml, 탐지 (LOD)의 고전 ELISA에 좋은 성능을 시작 매우 민감한 단일 분자 배열 분석 결과 얻기의 가능성이 높아집니다. 장 및 동료 분석 감도18를 예측 하는 방정식의 세트를 제안 하 고 모든 단일 단계에서 발생 하는 바이오 상호 작용의 상세한 운동 연구 수행. 그들은 그 단일 분자 배열 디지털 ELISA 항 체 친 화력의 광범위 한 범위 내에서 효과적인 것 처럼 보였다 (KD ~ 10−11 -10−9 M), 뿐만 아니라 그 신호 발생은 더 많은 같은 항 체의에 속도에 의존.
높은 선호도 활용 하려면 우리 면역 polyendocrinopathy 증후군을 가진 환자에서 항 체 분리의 이용을 했다 항 체 1/면역 polyendocrinopathy-칸디 다 증-ectodermal 영양 (APS1/APECED)29를 입력 합니다. 이유로 아직 이해 되지 않는다, 아이 불충분 한 개인의 대다수는 모든 IFN-α 하위29에 대 한 높은 갈망 항 체의 코어 세트를 개발 하 고 우리는 상호 보완적인 바인딩 선호도의 두 안티-IFN-α 항 체 클론을 선택 다른 IFN-α 하위 유형에 대 한, IC50 값에 의해 추산 되. 단일 분자 배열 기술로 이러한 독특한 높은 친 화력 항 체의 조합 attomolar (fg/mL) 농도에서 IFN-α의 직접 정량화를 사용할 수 있습니다. 이러한 磁 IFN-α 단백질 검출 자연, 규칙 및 다른 질병에서 IFN 유도 응답의 생물 학적 영향의 더 나은 이해에 기여할 것입니다.

<table><tbody><tr><td>Anti-IFN-&amp;alpha; antibody A (8H1 clone)</td><td>ImmunoQure AG</td><td>NA</td><td>Not commercially available</td></tr><tr><td>Anti-IFN-&amp;alpha; antibody B (12H5 clone)</td><td>ImmunoQure AG</td><td>NA</td><td>Not commercially available</td></tr><tr><td>Anti-IFN-&amp;alpha; antibody EBI-1 clone</td><td>eBioscience</td><td>BMS216C</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IFN-&amp;alpha; antibody BMS216BK clone</td><td>eBioscience</td><td>BMS216BK</td><td>Not an ELISA kit but bulk abs</td></tr><tr><td>IFN &amp;alpha;2c</td><td>eBioscience</td><td>BMS305</td><td>OK</td></tr><tr><td>IFN &amp;alpha;I (17)</td><td>PBL</td><td>11150-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &amp;alpha;2a</td><td>PBL</td><td>11100-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &amp;alpha;2a</td><td>PeproTech</td><td>No longer available</td><td></td></tr><tr><td>IFN &amp;alpha;2b</td><td>PBL</td><td>11105-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &amp;alpha;1</td><td>PBL</td><td>11175-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &amp;alpha;4a (M1)</td><td>PBL</td><td>11177-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &amp;alpha;4b (a4)</td><td>PBL</td><td>11180-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &amp;alpha;B2 (a8)</td><td>PBL</td><td>11115-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &amp;alpha;C (a10)</td><td>PBL</td><td>11120-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &amp;alpha;D (a1)</td><td>PBL</td><td>11125-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &amp;alpha;G (a5)</td><td>PBL</td><td>11135-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &amp;alpha;F (a21)</td><td>PBL</td><td>11130-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &amp;alpha;H2 (a14)</td><td>PBL</td><td>11145-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &amp;alpha;J1 (a7)</td><td>PBL</td><td>11160-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &amp;alpha;K (a6)</td><td>PBL</td><td>11165-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &amp;alpha;WA (a16)</td><td>PBL</td><td>11190-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &amp;lambda;1</td><td>PeproTech</td><td>300-02L</td><td></td></tr><tr><td>IFN &amp;lambda;2</td><td>PeproTech</td><td>300-02K</td><td></td></tr><tr><td>IFN &amp;omega;</td><td>PeproTech</td><td>300-02J</td><td></td></tr><tr><td>IFN &amp;beta;</td><td>PeproTech</td><td>300-02BC</td><td></td></tr><tr><td>IFN &amp;gamma;</td><td>PeproTech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IFN-&amp;alpha; ELISA</td><td>PBL</td><td>41115.1</td><td></td></tr><tr><td>96-well plates</td><td>Corning</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>ISRE-Reporter</td><td>Qiagen</td><td>CCS-008L</td><td></td></tr><tr><td>Fu-GENE HD Transfection Reagent</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Reduced Serum Mediuem</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Dual-Luciferase Reporter assay</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40 Substitute</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer NanoDrop 1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>No longer available</td><td></td></tr><tr><td>Amicon micocentrifuge tubes - 0.5mL filtres</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC505096</td><td></td></tr><tr><td>Bead Conjugation Buffer</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>Can not be ordered separately</td></tr><tr><td>Non-Encoded Paramagnetic Beads</td><td>Quanterix</td><td>101360</td><td></td></tr><tr><td>Bead Wash Buffer</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>Can not be ordered separately</td></tr><tr><td>EDC</td><td>Fisher Scientific</td><td>11844071</td><td></td></tr><tr><td>Bead Blocking Buffer</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>Can not be ordered separately</td></tr><tr><td>Bead Diluent Buffer</td><td>Quanterix</td><td>101362</td><td></td></tr><tr><td>Detector and Sample Diluent</td><td>Quanterix</td><td>101359</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylation Reaction Buffer</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>Can not be ordered separately</td></tr><tr><td>NHS-PEG4-Biotin</td><td>Fisher Scientific</td><td>11891195</td><td></td></tr><tr><td>diH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge for 1.7mL microcentrifuge tubes (Heraens Fresco 21 Centrifuge)</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002478</td><td></td></tr><tr><td>Standard laboratory vortex mixer (MS2 Minishaker)</td><td>IKA</td><td>MS2</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes (10, 20, 200 and 1000 &amp;mu;l)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tips (10, 20, 200 and 1000 &amp;mu;l)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.7mL microcentrifuge tubes</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnetic separator that accomodates 1.7mL microcentrifuge tubes (Life Technologies DynaMag-2)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Mini benchtop centrifuge (Galaxy MinisStar)</td><td>VWR</td><td>521-2844</td><td></td></tr><tr><td>Mixer/Shaker (Eppendorf Thermomixer Comfort)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Single molecule array (Simoa) reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SBG, Bead and Detector Barcode Labels</td><td>Quanterix</td><td>101652</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Reagent Bottles</td><td>Quanterix</td><td>102411</td><td></td></tr><tr><td>Simoa specimen 96-well plates</td><td>Quanterix</td><td>101457</td><td></td></tr><tr><td>Simoa Discs</td><td>Quanterix</td><td>100001</td><td></td></tr><tr><td>Simoa 2.0 conductive Tips</td><td>Quanterix</td><td>101726</td><td></td></tr><tr><td>Simoa Cuvettes</td><td>Quanterix</td><td>100803</td><td></td></tr><tr><td>Simoa SBG Reagent</td><td>Quanterix</td><td>102295</td><td></td></tr><tr><td>Simoa RGP Reagent</td><td>Quanterix</td><td>101736</td><td></td></tr><tr><td>Simoa System Buffer 1</td><td>Quanterix</td><td>100486</td><td></td></tr><tr><td>Simoa System Buffer 2</td><td>Quanterix</td><td>100487</td><td></td></tr><tr><td>Sealing Oil</td><td>Quanterix</td><td>100206</td><td></td></tr><tr><td>ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Simoa HD-1 Analyzer</td><td>Quanterix</td><td>100032</td><td></td></tr><tr><td>&lt;u&gt;Technologies&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single molecule array (Simoa)</td><td>Quanterix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single molecule counting Erenna Immunoassay Systems</td><td>Singluex</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

development and validation of an ultrasensitive single molecule array digital enzyme-linked immunosorbent assay for human interferon-&#945;

이 프로토콜의 주요 목표는 개발 및 유효성 검사는 인터페론 (IFN)의 설명-α 단일 분자 배열 디지털 Enzyme-Linked ImmunoSorbent 분석 결과 (ELISA) 분석 결과. 이 시스템 수 있습니다 인간의 IFN-α 단백질의 정량화를 전례 없이 높은 감도, 그리고 아무 분 IFN의 다른 종족에 대 한.
프로토콜의 첫 번째 주요 단계 다음에 캡처 항 체의 활용 상자성 구슬과 biotinylation 탐지 항 체의 항 체 쌍의 선택입니다. 이 단계에 따라 최적의 감도 얻을 때까지 분석 결과 구성, 검출기 항 체 농도, 버퍼 구성 등의 다른 매개 변수를 수정할 수 있습니다. 마지막으로, 특이성, 재현성 메서드의 결과에 신뢰를 보장 하기 위해 평가 됩니다. 여기, 우리는 0.69 fg/mL 높은 선호도 자가 면역 polyendocrinopathy를 일으키는 면역 레 귤 레이 터 (아이) 단백질 biallelic 돌연변이 가진 환자에서 격리를 사용 하 여의 검출도 IFN-α 단일 분자 배열 분석 결과 개발 증후군 종류 1/면역 polyendocrinopathy-칸디 다 증-ectodermal 영양 (APS1/APECED). 중요 한 것은, 이러한 항 체는 모든 13 IFN-α의 감지를 사용할 수 있습니다.
이 새로운 방법론 수 있습니다 검출 및 정량화 IFN-α 단백질의 attomolar 농도에서 인간의 생물 학적 샘플에서 처음으로. 이러한 도구는 매우 인간의 건강 및 질병 상태,이 사이토카인의 수준을 모니터링 하는 데 유용 있을 것입니다 대부분 특히 감염, 자가 면역, 그리고 autoinflammation.

요약 하자면, 0.69 fg/mL, 2 단계 구성을 사용 하 여 캡처 구슬의 검출 한계는 팬-IFN-α 단일 분자 배열 분석 결과와 코팅 0.3 mg/mL의 안티-IFN-α는 항 체 및 안티-IFN-α B 탐지 항 체 biotinylated의 비타민 b 복합체: 항 체 비에 30 개발 되었다. Biotinylated 탐지 항 체 및 SBG 사용 농도 했다 0.3 µ g/mL 및 150 오후, 각각. 이 매우 구체적인 분석 결과 모든 13 IFN-α 하위 감지 수 이며 IFNs의 다른 유형으로 교차 반응 하지 않습니다. 따라서, 그것은 식별 하 고 IFN-α의 각 개별 종 계량 가능, 모두 검출 될 수 있다 고 함께 13 다른 서브 클래스를 구성 하는 IFN-α에 대 한 총 농도 값을 주는 측정.
이 새로 개발된 된 분석 결과의 잠재적인 진단 가치 탐험, 플라즈마와 건강 한 개인에서 혈 청 IFN-α 단백질 측정 하 고 SLE와 JDM 고통 받아 환자에서 샘플과 비교 했다. 그림 7에서 볼 수 있듯이 건강 한 통제에 비교 하 여 두 질환 동료에 IFN-α 단백질의 높은 수준은 발견 했다. 점선은 어떻게이 이렇게 것 이다 감지 하지 IFN-α 단백질이이 고기가이 cytokine의 알려진된 연결에도 불구 하 고 이러한 환자 그룹을 보여주는 기존의 상용 ELISA의 LOD를 나타냅니다. 또한, IFN-α는 분석 결과, 분석 결과의 매우 민감한 성격을 확인 1-10 fg/mL 사이 감지 레벨의 넓은 동적 범위를 보여주는 5 로그의 크기를 통해 측정할 수 수 있습니다.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57421/57421fig7.jpg"> 그림 7: 플라즈마와 동료 환자에서 혈 청 IFN-α 단백질의 정량화. 이 그림은 Rodero 외에서 수정 되었습니다. 2017. 건강 한 컨트롤에서 플라즈마 (n = 20)와 SLE 고통 받는 환자 (n = 72) 및 JDM (n = 43) 팬 IFNα 단일 분자 배열 분석 결과 함께 테스트 했다. 분석 비교 사용 하 여 단방향 ANOVA 테스트 (Kruskal-월리스)와 던의 여러 그룹 간의 테스트를 수행 했습니다. 중간값은 그려져 있습니다. 점선 참조 인간의 안티-IFN-α ELISA의 LOD를 나타냅니다 (1.95 pg/mL = 1950 fg/mL). <a href="/files/ftp_upload/57421/57421fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>단계</td>
			<td>고려 사항</td>
			<td>참조</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1. 항 체 쌍 선택</td>
			<td>대상 다른 epitopes</td>
			<td rowspan="3">표 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>높은 선호도</td>
		</tr>
<tr>
<td>K에에 빠른 / 느린 K에서
</td>
		</tr>
<tr>
<td>2. 항 체 쌍 방향</td>
			<td rowspan="3">검출의 최저 제한 조건을 선택합니다</td>
			<td rowspan="3">그림 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>3. 항 체 농도 캡처</td>
		</tr>
<tr>
<td>4. biotin: 검출기 항 체 비율</td>
		</tr>
<tr>
<td>5입니다. 2 대 3 단계 구성</td>
			<td>높은 신호: 배경 비율 조건 선택</td>
			<td>그림 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>6. 검출기 항 체 농도</td>
			<td rowspan="2">검출의 최저 제한 조건을 선택합니다</td>
			<td rowspan="2">그림 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>7. SBG 농도</td>
		</tr>
<tr>
<td>8입니다. 특이성</td>
			<td>분을 평가</td>
			<td rowspan="2">그림 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>9입니다. 감도</td>
			<td>(있는 경우)의 인식 평가</td>
		</tr>
<tr>
<td>10입니다. 재현성</td>
			<td>분석 결과 변화를 평가</td>
			<td>그림 5</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 개발 및 단일 분자 배열 분석 결과의 최적화를 위한 단계의 요약. 이 표에서 개발 및 재현성 평가까지 항 체 쌍의 초기 선택에서 단일 분자 배열 분석 결과의 최적화에 필요한 여러 단계를 요약 합니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>항 원</td>
			<td>8 H 1 (A)</td>
			<td>12 H 5 (B)</td>
			<td>Sifalimumab</td>
			<td>Rontalizumab</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ1</td>
			<td>28.3</td>
			<td>51.3</td>
			<td>460</td>
			<td>22.63</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ2</td>
			<td>2563</td>
			<td>10.7</td>
			<td>9.02</td>
			<td>2.15</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ4</td>
			<td>5.11</td>
			<td>2.99</td>
			<td>35.35</td>
			<td>325.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ5</td>
			<td>2.01</td>
			<td>19.6</td>
			<td>93.29</td>
			<td>2.49</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ6</td>
			<td>64.7</td>
			<td>3.03</td>
			<td>4.97</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ7</td>
			<td>0.9</td>
			<td>0.63</td>
			<td>233.1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ8</td>
			<td>302</td>
			<td>0.83</td>
			<td>691</td>
			<td>10.86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ10</td>
			<td>2.54</td>
			<td>0.71</td>
			<td>43.2</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ14</td>
			<td>3224</td>
			<td>2.1</td>
			<td>14.52</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ16</td>
			<td>1.83</td>
			<td>32.99</td>
			<td>59.18</td>
			<td>28.65</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ17</td>
			<td>2.21</td>
			<td>0.77</td>
			<td>890.9</td>
			<td>23.86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ21</td>
			<td>2.78</td>
			<td>12.87</td>
			<td>1769</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 팬-알파 항 체 선택. IC50 (ng/mL) 인터페론 자극 응답 요소 (ISRE)를 사용 하 여 결정-Luciferase 중화 분석 결과. 테이블의 모든 IFN-α 하위에 대 한 단일 분자 배열 분석 결과에 사용 되는 mAbs IC50 값을 보여 줍니다. 10000 HEK 293 MSR 셀 흰색 반 지역 96 잘 접시에 시드 되었고 50 ng 혼합 ISRE-반딧불 luciferase 기자와 Renilla luciferase 구문을 사용 하 여 transfection 시 약 제조업체의 지침에 따라 리버스 페. Luciferase 표현 구문 내부 정규화 컨트롤로 제공 됩니다. 셀은 불필요 한 아미노산은 0.1 m m, 1mm 나트륨 pyruvate, 37 ° C에서 0.5% 태아 둔감 한 혈 청, 5% CO2 습도 분위기에서 보충 감소 혈 청 매체에 하룻밤 incubated 했다. 하룻밤 배양 한 후 세포 재조합 인간 IFN-α 또는 안티-IFN-α mAbs 또는 제어 1 h 37 ° c.에 대 한 preincubated 했다 IgG 없이 혼합물을 포함 하는 매체와 24 h에 대 한 자극 했다 자극의 24 h 후 듀얼 luciferase 기자 분석 실험은 제조업체의 지침에 따라 수행 했다. «-» 결정 되지. Sifalimumab는 완전히 인간 면역 글로불린 g 1 κ 단일 클론 항 체에 바인딩하고; IFN-α의 대부분을 중화 하는 Rontalizumab은 IFN-α에 대 한 인간 답게 단일 클론 항 체 이다. 메이어 연구진이 2016 및 Rodero 그 외 여러분 에서 적응 2017입니다.
보충 표 1: 다양 한 항 체 방향, 구슬 및 biotinylation 비율에 항 체 농도 캡처. 서로 다른 두 가능한 구성을 테스트, 탐지 항 체 (A), 그리고로 캡처 항 체 및 안티-IFN-α B 안티-IFN-α A를 사용 하 여 반대 (B). IFNα-2 c 항으로 사용 되었다. 다른 캡처 항 체 농도 뿐만 아니라 비타민 b 복합체: 항 체 (B:A) 비율 구성 모두에 대 한 테스트도 했다. 채도 (토). LOD 계산; 사용 된 주황색: 브라질 우주국 값 이 농도 꾸준히 남아 AEB 값으로 빈 간주 됐다. LOD 의미 빈 + 3SD.로 계산 되었다 <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_1.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 표 2: 2 vs 3 단계 구성의 테스트. 2, 3-단계 구성으로 항 원 c IFNα-2를 사용 하 여 평가 됐다. AEB 값 뿐만 아니라 신호/배경 식량 (S/B) 표시 됩니다 두 조건에 대 한. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_2.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 표 3: 검출기와 SBG 농도 최적화. SBG의 3 개의 다른 농도 함께 biotinylated 검출기 항 체 (0.1, 0.3, 0.6 µ g/mL)의 3 개의 다른 농도 (50, 150, 및 250 오후) 평가 했다. AEB 값 9 테스트 조건에 대 한 표시 됩니다. LOD 계산; 사용 된 주황색: 브라질 우주국 값 이 농도 꾸준히 남아 AEB 값으로 빈 간주 됐다. LOD 의미 빈 + 3SD.로 계산 되었다 <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_3.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 표 4: 최적화 된 IFNα 단일 분자 배열 분석 결과의 감도 및 특이성. 구슬 값 당 평균 효소 IFN β, IFN-λ1, IFN-λ2, IFN-ω, 그리고 IFN-γ 재조합 단백질은 시험 때 (A)의 IFN-α (B) 16 하위 함께 표시 됩니다. «-» 결정 되지. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_4.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 표 5: 최적화 된 IFNα 단일 분자 배열 분석 결과의 재현성. 모든 3 개의 독립적인 실행에 대 한 평균값 AEB 10.000 fg/mL의 농도를 표시 됩니다. «-» 결정 되지. 채도 (토). <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_5.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 표 6: 단백질 경쟁 분석 결과. 구슬 값 당 평균 효소 테스트 하는 모든 조건에 대 한 표시 됩니다. 측정은 중복에서 수행 했다. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_6.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

여기 우리는 개발 및 유효성 검사는 단일 분자 배열 디지털 ELISA 분석 결과의 인간의 샘플에서 모든 IFN-α의 매우 민감한 탐지를 가능 하 게 설명 하는 프로토콜을 제시.

개발 및 검증 磁 단일 분자의 배열 디지털 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 인간 인터페론-α에 대 한

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

development-validation-an-ultrasensitive-single-molecule-array

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.9K 조회수.  Institut Pasteur. 여기 우리는 개발 및 유효성 검사는 단일 분자 배열 디지털 ELISA 분석 결과의 인간의 샘플에서 모든 IFN-α의 매우 민감한 탐지를 가능 하 게 설명 하는 프로토콜을 제시.

비디오: Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-α

An ELISA Based Binding and Competition Method to Rapidly Determine Ligand-receptor Interactions

A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and reliable point-by-point protocols of enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) for the investigation of ligand-receptor interactions: the direct ligand-receptor interaction assay (LRA) and the competition LRA. As a case study, the ELISA based analysis of the interaction between different lambda interferons (IFNLs) and the alpha subunit of their receptor (IL28RA) is presented: the direct LRA is used for the determination of dissociation constants (KD values) between receptor and IFN ligands, and the competition LRA for the determination of the inhibitory capacity of an oligopeptide, which was designed to compete with the IFNLs at their receptor binding site. Analytical steps to estimate KD and half maximal inhibitory concentration (IC50) values are described. Finally, the discussion highlights advantages and disadvantages of the presented method and how the results enable a better molecular understanding of ligand-receptor interactions.

The presented protocols describe two enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based techniques for the rapid investigation of ligand-receptor interactions: The first assay allows the determination of dissociation constant between ligand and receptor. The second assay enables a rapid screening of blocking peptides for ligand-receptor interactions.

ELISA 기반 바인딩과 경쟁 방법은 신속 리간드 - 수용체 상호 작용을 확인하는 방법

A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and ...

연구

화학

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

면역학 및 감염병학

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

높은 처리량 정량 실시간 RT-PCR 분석 유형 I과 III 인터페론 하위 유형의 발현 양상을 결정하는

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Development of a Lateral Flow Immunochromatographic Strip for Rapid and Quantitative Detection of Small Molecule Compounds

Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, physiological index and clinical biomarker detection. In this protocol, we provide a detailed description of the steps to develop a rapid, sensitive and quantitative lateral-flow immunoassay (using AuNPs as a marker and mAbs as a probe). The procedure describes the preparation and characterization of colloidal gold, synthesis of the AuNP-mAb conjugate, assembly of the immunochromatographic strip, and methodological investigation of the assay. The results showed that the final strips can be further utilized for the rapid and convenient self-diagnosis of a small molecule, which may provide an alternative tool in the rapid and precise analysis of physiological and biological indices.

소분자 화합물의 신속하고 정량적 검출을 위한 측면 흐름 면역크로모그래피 스트립 개발

Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, ...

생화학

Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay Testing Methodology and Troubleshooting

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if animals have been exposed to adventitious infectious agents (viruses, mycoplasma, and other fastidious microorganisms). Infections of immunocompetent animals are generally transient, yet serum antibody responses to infection often can be detected within days to weeks and persist throughout the life of the host. Serology is the primary diagnostic methodology by which laboratory animals are monitored. Historically the indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has been the main screening method for serosurveillance. The ELISA is performed as a singleplex, in which one microbial antigen-antibody reaction is measured per well. In comparison the MFIA is performed as a multiplexed assay. Since the microspheres come in 100 distinct color sets, as many as 100 different assays can be performed simultaneously in a single microplate well. This innovation decreases the amount of serum, reagents and disposables required for routine testing while increasing the amount of information obtained from a single test well. In addition, we are able to incorporate multiple internal control beads to verify sample and system suitability and thereby assure the accuracy of results. These include tissue control and IgG anti-test serum species immunoglobulin (&alpha;Ig) coated bead sets to evaluate sample suitability. As in the ELISA and IFA, the tissue control detects non-specific binding of serum immunoglobulin. The &alpha;Ig control (Serum control) confirms that serum has been added and contains a sufficient immunoglobulin concentration while the IgG control bead (System Suitability control), coated with serum species immunoglobulin, demonstrates that the labeled reagents and Luminex reader are functioning properly.

Using Luminex Corporation&#x2019;s xMAP microsphere technology, we have developed the Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay (MFIA) for serosurveillance of various laboratory animal species. The MFIA is a suspension microarray where antigen, tissue control or immunoglobulins are covalently linked to color-coded polystyrene microspheres. The MFIA testing method as well as various troubleshooting topics is addressed.

멀티 플렉스 Fluorometric 면역 분석법 테스트 방법론 및 문제 해결

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if ...

생물학

An Optimized Hemagglutination Inhibition (HI) Assay to Quantify Influenza-specific Antibody Titers

Antibody titers are commonly used as surrogate markers for serological protection against influenza and other pathogens. Detailed knowledge of antibody production pre- and post-vaccination is required to understand vaccine-induced immunity. This article describes a reliable point-by-point protocol to determine influenza-specific antibody titers. The first protocol describes a method to specify the antigen amounts required for hemagglutination, which standardizes the concentrations for subsequent usage in the second protocol (hemagglutination assay, HA assay). The second protocol describes the quantification of influenza-specific antibody titers against different viral strains by using a serial dilution of human serum or cell culture supernatants (hemagglutination inhibition assay, HI assay).
As an applied example, we show the antibody response of a healthy cohort, which received a trivalent inactivated influenza vaccine. Additionally, the cross-reactivity between the different influenza viruses is shown and methods to minimize cross-reactivity by using different types of animal red blood cells (RBCs) are explained. The discussion highlights advantages and disadvantages of the presented assays and how the determination of influenza-specific antibody titers can improve the understanding of vaccine-related immunity.

An Optimized Hemagglutination Inhibition HI Assay to Quantify Influenza-specific Antibody Titers

The presented protocols describe how to perform a hemagglutination inhibition assay to quantify influenza-specific antibody titers from serum samples of influenza vaccine recipients. The first assay determines optimal viral antigen concentrations by hemagglutination. The second assay quantifies influenza-specific antibody titers by hemagglutination inhibition.

인플루엔자-특정 항 체 Titers 계량에 최적화 된 Hemagglutination 억제 (HI) 분석 결과

Antibody titers are commonly used as surrogate markers for serological protection against influenza and other pathogens. Detailed knowledge of antibody ...

의학

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the spontaneous non-obese diabetes (NOD) mouse model, insulin is the primary target, and genetic manipulation of these animals to remove a single key insulin epitope prevents disease. Thus, selective elimination of professional antigen presenting cells (APCs) bearing this pathogenic epitope is an approach to inhibit the unwanted insulin-specific autoimmune responses, and likely has greater translational potential.
Chimeric antigen receptors (CARs) can redirect T cells to selectively target disease-causing antigens. This technique is fundamental to recent attempts to use cellular engineering for adoptive cell therapy to treat multiple cancers. In this protocol, we describe an optimized T-cell retrovirus (RV) transduction and in vitro expansion protocol that generates high numbers of functional antigen-specific CD8 CAR-T cells starting from a low number of naive cells. Previously multiple CAR-T cell protocols have been described, but typically with relatively low transduction efficiency and cell viability following transduction. In contrast, our protocol provides up to 90% transduction efficiency, and the cells generated can survive more than two weeks in vivo and significantly delay disease onset following a single infusion. We provide a detailed description of the cell maintenance and transduction protocol, so that the critical steps can be easily followed. The whole procedure from primary cell isolation to CAR expression can be performed within 14 days. The general method may be applied to any mouse disease model in which the target is known. Similarly, the specific application (targeting a pathogenic peptide/MHC class II complex) is applicable to any other autoimmune disease model for which a key complex has been identified.

This article describes a protocol for the generation of antigen-specific CD8 T cells, and their expansion in vitro, with the aim of yielding high numbers of functional T cells for use in vitro and in vivo.

자가 면역 당뇨병 모델에서 기능 테스트를 위한 항원 특이적 원발성 원발성 T 세포의 고효율 생성

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...

Dynamic Monitoring of Seroconversion using a Multianalyte Immunobead Assay for Covid-19

Multiplex technologies for interrogating multiple biomarkers in concert have existed for several decades; however, methods to evaluate multiple epitopes on the same analyte remain limited. This report describes the development and optimization of a multiplexed immunobead assay for serological testing of common immunoglobulin isotypes (e.g., IgA, IgM, and IgG) associated with an immune response to SARS-CoV-2 infection or vaccination. Assays were accomplished using a flow-based, multiplex fluorescent reader with dual-channel capability. Optimizations focused on analyte capture time, detection antibody concentration, and detection antibody incubation time. Analytical assay performance characteristics (e.g., assay range (including lower and upper limits of quantitation); and intra- and inter-assay precision) were established for either IgG/IgM or IgA/IgM serotype combination in tandem using the 'dual channel' mode. Analyte capture times of 30 min for IgG, 60 min for IgM, and 120 min for IgA were suitable for most applications, providing a balance of assay performance and throughput. Optimal detection antibody incubations at 4 &#181;g/mL for 30 min was observed and are recommended for general applications, given the overall excellent precision (percent coefficient of variance (%CV) &#8804; 20%) and sensitivity values observed. The dynamic range for the IgG isotype spanned several orders of magnitude for each assay (Spike S1, Nucleocapsid, and Membrane glycoproteins), which supports robust titer evaluations at a 1:500 dilution factor for clinical applications. Finally, the optimized protocol was applied to monitoring Spike S1 seroconversion for subjects (n = 4) that completed a SARS-CoV-2 vaccine regimen. Within this cohort, Spike S1 IgG levels were observed to reach maximum titers at 14 days following second dose administration, at a much higher (~40-fold) signal intensity than either IgM or IgA isotypes. Interestingly, we observed highly variable Spike S1 IgG titer decay rates that were largely subject-dependent were observed, which will be the topic of future studies.

This article describes a convenient method for monitoring dynamic changes in antibody titers for two immunoglobulin isotypes concurrently (either IgA, IgM, or IgG) resulting from an immune response to SARS-CoV-2 infection or vaccination. This 'Multianalyte Covid-19 Immune Response Panel' employs three indirect immunoassays built on coded microspheres that are read using a flow-based multiplex reader with 'dual-channel' capability.

Covid-19에 대한 다중 분석 물질 면역 비드 분석을 사용한 혈청 전환의 동적 모니터링

Multiplex technologies for interrogating multiple biomarkers in concert have existed for several decades; however, methods to evaluate multiple epitopes ...

ELISA Assays: Indirect, Sandwich, and Competitive

Source: Whitney Swanson1,2, Frances V. Sjaastad2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4 
1 Department of Urology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
2 Center for Immunology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
3 Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
4 Masonic Cancer Center, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is frequently used to measure the presence and/or concentration of an antigen, antibody, peptide, protein, hormone, or other biomolecule in a biological sample. It is extremely sensitive, capable of detecting low antigen concentrations. The sensitivity of ELISA is attributed to its ability to detect the interactions between a single antigen-antibody complex (1). Moreover, the inclusion of an enzyme-conjugated antigen-specific antibody permits the conversion of a colorless substrate into a chromogenic or fluorescent product that can be detected and easily quantitated by a plate reader. When compared to the values generated by titrated amounts of a known antigen of interest, the concentration of the same antigen in the experimental samples can be determined. Different ELISA protocols have been adapted to measure antigen concentrations in a variety of experimental samples, but they all have the same basic concept (2). Choosing the type of ELISA to perform, indirect, sandwich, or competitive, depends on a number of factors, including the complexity of the samples to be tested and the antigen-specific antibodies available to use. The indirect ELISA is frequently used to determine the outcome of an immunological response, such as measuring the concentration of an antibody in a sample. The sandwich ELISA is best suited for analyzing complex samples, such as tissue culture supernatants or tissue lysates, where the analyte, or antigen of interest, is part of a mixed sample. Finally, the competitive ELISA is most often used when there is only one antibody available to detect the antigen of interest. Competitive ELISAs are also useful for detecting a small antigen with only a single antibody epitope that cannot accommodate two different antibodies due to steric hinderance. The protocol will describe the basic procedures for the indirect, sandwich, and competitive ELISA assays.
The indirect ELISA assay is commonly used to measure the amount of antibodies in serum or in the supernatant of a hybridoma culture. The general procedure for the indirect ELISA assay is:
<ol>
	<li>Coat wells with antigens</li>
	<li>Add serum or hybridoma culture supernatant containing antibody (primary or 1&#176; antibody)</li>
	<li>Incubate and wash</li>
	<li>Add secondary (or 2&#176;) enzyme-conjugated antibody</li>
	<li>Incubate and wash</li>
	<li>Add substrate</li>
</ol>
The sandwich ELISA assay differs from the indirect ELISA assay in that the method does not involve coating the plates with a purified antigen. Instead, a &#34;capture&#34; antibody is used to coat the wells of the plate. The antigen is &#34;sandwiched&#34; between the capture antibody and a second &#34;detection&#34; enzyme-conjugated antibody - where both antibodies are specific for the same antigen, but at different epitopes (3). By binding to the capture antibody/antigen complex, the detection antibody remains in the plate. Either monoclonal antibodies or polyclonal antisera can be used as the capture and detection antibodies. The main advantage of the sandwich ELISA is that the sample does not have to be purified before analysis. Moreover, the assay can be quite sensitive (4). Many commercially available ELISA kits are of the sandwich variety and use tested, matched pairs of antibodies. The general procedure for the sandwich ELISA assay is:
<ol>
	<li>Coat wells with capture antibody</li>
	<li>Add test samples containing antigen</li>
	<li>Incubate and wash</li>
	<li>Add enzyme-conjugated detection antibody.</li>
	<li>Incubate and wash</li>
	<li>Add substrate</li>
</ol>
Most commercially available sandwich ELISA kits come with enzyme-conjugated detection antibodies. In cases where an enzyme-conjugated detection antibody is not available, a secondary enzyme-conjugated antibody specific for the detection antibody can be used. The enzyme on the secondary antibody performs the same role, which is to convert the colorless substrate to a chromogenic or fluorescent product. The above-mentioned secondary enzyme-conjugated antibody would more like to be used in a &#34;homemade&#34; sandwich ELISA developed by an investigator who has generated their own monoclonal antibodies, for example. One drawback to using a secondary enzyme-conjugated antibody is to be sure it only binds to the detection antibody, and not the capture antibody bound to the plate. This would result in a measurable product in all wells, regardless of the presence or absence of antigen or detection antibody.
Finally, the competitive ELISA assay is used to detect soluble antigens. It is simple to perform, but it is only suitable when the purified antigen is available in a relatively large amount. The general procedure for the competitive ELISA assay is:
<ol>
	<li>Coat wells with antigen</li>
	<li>Incubate and wash</li>
	<li>Preincubate test sample with enzyme-conjugated primary antibodies</li>
	<li>Add mixture to well</li>
	<li>Incubate and wash away any unbound enzyme-conjugated primary antibody</li>
	<li>Add substrate</li>
</ol>
The &#34;competition&#34; in this assay comes from the fact that more antigen in the test sample used in step 3 will result in less antibody available to bind to the antigen coating the well. Thus, the intensity of the chromogenic/fluorogenic product in the well at the end of the assay is inversely related to the amount of antigen present in the test sample.
A key component in any type of ELISA is the titrated standards of known concentrations that will allow the user to determine the antigen concentration present in the test samples. Typically, a series of wells are designated for creating a standard curve, where known amounts of a purified recombinant protein are added to the wells in decreasing amounts. When these wells are processed at the same time as the test samples, the user can then have a reference set of absorbance values obtained from a microplate reader for known protein concentrations to go along with the absorbance values for the test samples. The user can then calculate a standard curve to which the test samples can be compared for determining the amount of protein of interest present. The standard curve can also determine the degree of precision of the user&#39;s dilution making.
Finally, the last step in each of the ELISA types listed above calls for the addition of a substrate. The degree of conversion of the substrate to product is directly related to the amount of enzyme present in the well. Horseradish peroxidase (HRP) and alkaline phosphatase (AP) are the most common enzymes found conjugated to antibodies. As expected, there are a number of substrates available specific for either enzyme that produce a chromogenic or fluorescent product. Moreover, substrates are available in a range of sensitivities that can increase the overall sensitivity of the assay. The user must also take into consideration the type of instrumentation available for reading the plate at the end of the experiment when picking the type of substrate to use, along with its corresponding enzyme-conjugated antibody.
Commonly used chromogenic substrates for HRP include 2,2&#39;-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS) and 3,3&#39;,5,5&#39;-tetramethylbenzidine (TMB), whereas p-Nitrophenyl Phosphate (PNPP) is used for AP. ABTS and TMB produce water-soluble green and blue colored reaction products, respectively. The green ABTS product has two major absorbance peaks, 410 and 650 nm, while the blue TMB product is best detected at 370 and 652 nm. The colors of ABTS and TMB change to yellow upon the addition of an acidic stop solution, which is best read at 450 nm. Color development for ABTS is slow, while it is fast for TMB. TMB is more sensitive than ABTS, and may produce a higher background signal if the enzymatic reaction proceeds too long. PNPP produces a yellow water-soluble product after AP conversion that absorbs light at 405 nm.

ELISA 분석: 간접, 샌드위치 및 길항

Source: Whitney Swanson1,2, Frances V. Sjaastad2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4
1 Department of Urology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
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교육

JoVE Science Education

심화생물학

면역학

Quantification of Bioactive Type-I Interferons using a Secreted Embryonic Alkaline Phosphatase Reporter Assay

Source: Bego, M. G. et al., <a href="https://app.jove.com/v/51207">Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates secreted embryonic alkaline phosphatase assay using HEK-Blue interferon-&#945;/&#946; reporter cells to quantify the type-I interferons (IFNs) released following stimulation of plasmacytoid dendritic cells by HIV-1 Infected CD4+ T cells.

Secreted Embryonic Alkaline Phosphatase Reporter Assay를 사용한 Bioactive Type-I 인터페론의 정량화

Source: Bego, M. G. et al., Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture ...