이 프로토콜을 통해 Muller glia가 microRNA와 같은 특정 인자로 치료 한 후 망막 전구 세포로 전환 될 수있는 잠재력과 능력을 연구 할 수 있습니다. 이 기술의 장점은 microRNA 후보가 생체 내 응용 분야에서 사용하기 전에 효율성과 결과를 테스트할 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 데 도움이되는 것은 Stefanie Wohl 실험실의 박사 과정 학생 인 강서영입니다.
먼저, 제거 된 안구를 에탄올이 든 튜브에 잠깐 담그면 동물에서 박테리아가 이월되지 않도록하십시오. 그런 다음 얼음 위의 24웰 플레이트에 넣기 전에 10cm 페트리 접시에서 안구를 잠깐 씻습니다. 안구를 제거하고 청소한 후에는 광원이 있는 해부 현미경 아래에 놓인 해부 접시에 한쪽 눈을 놓습니다.
이제 Dumont 5 개의 미세한 집게로 시신경과 공막 주변의 주변 결합 조직을 잡고 해부 접시에 조심스럽게 눌러 한쪽 안구를 고정하십시오. 다음으로 정맥 가위가 더 쉽게 접근 할 수 있도록 30 게이지 바늘을 사용하여 각막 중앙에 구멍을 뚫습니다. 그런 다음 정맥 가위를 사용하여 모양체 주변의 각막을 해부하고 Dumont 5 미세 집게로 각막, 렌즈, 홍채 및 유리체를 조심스럽게 제거합니다.
나중에 시신경에 도달 할 때까지 정맥 가위로 공막을 해부하고 Dumont 5 미세 집게를 사용하여 망막을 조심스럽게 추출합니다. 이제 두 번째 Dumont 5 미세 집게를 사용하여 망막을 밀고 유리체를 완전히 제거하십시오. 망막을 멸균 이송 피펫의 끝에서 약 2.5 센티미터 절단하여 직경을 확대한다.
이제이 팁을 사용하여 조직을 손상시키지 않고 전체 망막을 집어 들고 망막을 차가운 HBSS가있는 새로운 멸균 페트리 접시에 옮기고 접시를 흔 듭니다. 다음으로, 새로운 멸균 이송 피펫을 사용하여 망막을 조심스럽게 밀어 망막 색소 상피 세포를 씻어냅니다. 분리된 망막을 즉시 1밀리리터의 HBSS로 채워진 24웰 플레이트의 새로운 깨끗한 웰에 놓고 해부 동안 24웰 플레이트를 얼음 위에 유지합니다.
원고에 설명 된대로 파파인 DNase I 해리 혼합물을 준비하십시오. 이제 확대 된 팁 전사 피펫으로 망막을 집어 올리십시오. 망막이 팁의 바닥에 정착 할 때까지 기다렸다가 과도한 HBSS없이 망막을 Papain DNase I 혼합물이 들어있는 튜브로 방출합니다.
다음으로 인큐베이터의 뉴테이터에 튜브를 놓고 섭씨 37도에서 10 분 동안 5 % 이산화탄소와 함께 배양합니다. 다음으로, 1 밀리리터 피펫으로 조심스럽게 위아래로 피펫팅하여 세포를 해리시킵니다. 세포가 해리된 후 파파인 해리 키트에서 275마이크로리터의 오보뮤코이드 프로테아제 억제제를 추가하여 파파인을 중화하고 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다.
튜브를 원심분리기에 넣고 섭씨 4도에서 300의 상대 원심력으로 8분 동안 회전시킵니다. 표피 성장 인자를 섭씨 37도에서 예열 된 성장 배지의 계산 된 부피에 첨가하십시오. 원심 분리기에서 튜브를 조심스럽게 제거하십시오.
튜브 바닥의 펠릿을 만지지 않고 상청액을 조심스럽게 완전히 제거하십시오. 이제 세포 펠렛을 500 마이크로리터의 표피 성장 인자 보충 성장 배지로 재현탁시킨다. 이어서, 세포 현탁액을 표지된 12 웰 플레이트의 하나의 웰로 옮긴다.
다른 500 마이크로 리터의 표피 성장 인자 보충 성장 배지로 튜브를 헹구고 우물에 첨가하십시오. 웰 플레이트를 조심스럽게 흔든 다음 플레이트를 이산화탄소와 함께 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣습니다. 90%에서 100%의 셀 컨플루언스를 확인하는 것으로 시작합니다.
다음으로, 배지를 제거하고 차가운 HBSS 1 밀리리터를 첨가하여 우물을 씻으십시오. 플레이트를 부드럽게 흔들고 흔적이 남지 않고 HBSS를 제거합니다. 나중에 500 마이크로 리터의 예열 된 트립신 함유 용액을 추가하여 웰에서 세포를 분리합니다.
부드럽게 흔들어 섭씨 37도 인큐베이터에서 2 분간 배양하십시오. 플레이트를 인큐베이터에서 바이오 안전 캐비닛으로 옮긴 후 기울이면서 트립신 함유 용액을 흡인합니다. 세포가 완전히 분리 될 때까지 우물 위에 조심스럽게 천천히 여러 번 분산시킵니다.
다음으로이 세포 현탁액을 멸균 된 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 튜브를 원심 분리기에 넣습니다. 섭씨 4도에서 8분 동안 300회 g으로 회전하고 튜브를 바이오 안전 캐비닛으로 다시 가져옵니다. 펠릿을 건드리지 않고 상청액을 제거하십시오.
이제 600 마이크로리터의 예열된 성장 배지를 추가하고 약 30-40회 위아래로 피펫팅하여 세포 펠릿을 조심스럽게 재현탁시킵니다. 마지막으로, 수득된 세포 현탁액 100 마이크로리터를 24 웰 플레이트의 6개의 코팅된 커버 슬립의 중앙에 시드한다. 플레이트를 인큐베이터 상에 놓고, 마이크로RNA 모조물을 사용한 후속 형질감염을 위해 세포를 침전시킨다.
그림은 형질감염 5일 후 몇 개의 Ascl1-Tomato 양성 세포가 존재하는 대조군 상태를 보여줍니다. 그러나 miR-25 치료 후 더 많은 Ascl1-토마토 양성 세포가 발견됩니다. 정량화 결과 대조군에 비해 miR-25 처리 웰에서 Ascl1-Tomato 양성 세포 수가 4배 증가한 것으로 나타났습니다.
가장 중요한 것은 riR-25 처리된 웰에서 발견되는 Ascl1-Tomato 양성 세포의 대다수가 뉴런 형태를 채택했다는 것입니다. 이 신경 형태의 특징에는 세포 체세포 크기 감소, 미세 과정의 발달 및 작은 네트워크의 형성이 포함되었습니다. 정량화 결과 모든 Ascl1-Tomato 양성 세포의 약 70%가 신경 특징을 가지고 있음이 밝혀졌습니다.
면역형광 표지는 뉴런 형태를 가진 Ascl1-Tomato 양성 세포가 신경 마커 OTX2 및 MAP2를 발현하여 뉴런 동일성을 확인함을 보여줍니다. 이들 세포의 정량화는 miR-25 과발현 후, 대조군에서 필드당 5개의 뉴런 세포와 비교하여 필드당 약 40개의 Ascl1-Tomato 양성 뉴런이 존재한다는 것을 밝혀냈다. 확인 된 신경 세포는 miR-70 처리 된 샘플의 전체 Ascl1-Tomato 양성 세포 집단의 약 25 %를 구성합니다.
또한, OTX2 및 MAP2 동시 발현 뉴런의 절대 수를 정량화한 결과, miR-25 처리 후, 대조군에서는 필드당 10개의 뉴런에 비해 필드당 약 60개의 뉴런이 발견되었다. 깨끗하고 살균 된 도구로 깨끗하고 살균 된 환경에서 작업하고 가혹한 취급을 피하면서 조심스럽게 작업하는 것이 필수적입니다. 다운스트림 응용 분야는 예를 들어 단백질 정량화, DNA 또는 RNA 분석 또는 전기생리학적 연구일 수 있습니다.
이 기술은 재생 의학 분야에 속하는 핵 재 프로그래밍에 대한 초기 질문을 탐구하는 데 도움이되었습니다. 그리고 새로운 질문을 탐구하기 위해 테스트 할 수있는 광범위한 요소와 조건이 있습니다.
