이 작품은 NIH (NIDDK) 5에 의해 지원 되었다 R01 DK083402-07 부여 (YZ).

오염 방지, 살 균 조직 문화 후드 내에서 전체 프로토콜을 수행 합니다. 승인 된 신시내티 대학 IRB 프로토콜에 따라 소매 위절제술을 받은 환자에서 인간의 fundic 조직 수집 (IRB 프로토콜 번호: 2015-4869). 모든 마우스 연구는 신시내티 대학 제도 동물 보호와 사용 위원회 (IACUC) 평가의 미국 협회 및 인증의 실험실 동물 배려 (AAALAC) 시설 유지 관리에 의해 승인 되었다.
1. 인간 파생 3D 위 Fundic Organoids 구축
참고:이 프로토콜은 이전이 랩8에 발표 된 연구에 근거한 다.
<ol><li>50 %Wnt 조절 하 고 20 %R-spondin 조절 미디어 구성 된 3D organoid 미디어를 준비 합니다.<ol>
<li>단련 하는 Wnt 미디어 준비, Wnt 성장 매체에 L 셀 문화 (Dulbecco 독수리 매체 (DMEM), 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1% 수정의 페니실린/스) 7 일, 수확, 매체 및 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 필터링.</li>
		<li>R-spondin 조건 미디어를 준비 합니다. R-spondin 성장 매체에서 수정된 HEK 293T R-spondin 은닉 세포 라인을 성장 (Dulbecco 독수리 매체 (DMEM), 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1% 수정의 페니실린/스). 2 시간 후 첨부 파일에 매체에서에서 변경 이러한 셀 OPTIMEM 성장 매체, 1% 페니실린/스. 7 일 동안 세포 문화. R-spondin 조절 미디어 수확 그리고 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 필터링 합니다. 참고:이 프로토콜 이전 게시 되었습니다 및 자세한 프로토콜 6,,78를 참조 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>성장 인자 감소, 페 놀 레드 무료 지하실 멤브레인 매트릭스 4 ° c.에 얼음에 16 h에 대 한 해 동 에는 얼음 차가운 캘리포니아2 +/Mg2 +조직 수집-큰 플라스틱 용기에 DBPS 무료. 시작 단계 1.4까지 얼음에 저장 합니다. 참고: 조직 소매 위절제술을 받은 환자에서 수집 됩니다.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 세척 살 균 비 커 100ml Ca2 +/Mg2 +포함 하에서 적극적으로 조직-Dulbecco의 인산 염 버퍼 염 분 (DPBS) 무료. 세척 약 30 s 또는 파편과 혈액 제거 되었습니다 때까지. 다음, 멸 균 거 즈를 사용 하 여, 상피에서 점액 레이어를 멀리 닦으십시오.</li>
	<li>조직의 힘과 근육 층을 파악, 멀리는 곡선된 hemostatic 포 셉을 사용 하 여 상피를 긁어 단단히 포 셉을 사용 하 여. 살 균, 폴리스 티 렌 페 트리 접시에 긁힌 것된 상피 파편을 수집 합니다.</li>
	<li>상피 조직 조직 소화를 최적화 하기 위해 면도기를 사용 하 여 약 2.0 x 2.0 m m2 크기의 조각으로 말하다. 캘리포니아2 +/Mg2 + 조직 파편을 씻고-DBPS 항생제로 보충 무료 (캘리포니아2 +/Mg2 + -무료 DPBS, 1% 페니실린/스, 0.25 mg/mL 암포 B 10 mg/mL Gentamicin, 50 mg/mL 대) 때까지 세척은 혈액의 무료입니다. 필요한 경우 여러 세척을 수행 합니다. 신중 하 게 폐기물 비 커에 씻어 멸 균 거 즈를 통해 필터링 하 여 세척을 삭제 합니다.</li>
	<li>수집 25 m m 저 어 바와 미리 데워 부 화 미디어 플라스 크 하단 라운드 125 mL 유리에 파편을 씻어 (2 m L-글루타민, 1% 보충 기초 미디어 페니실린/스, 10 mM HEPES 버퍼, 1 mg/mL 콜라 타입 1, 2 mg/mL 세포 배양 학년 소 혈 청 알 부 민). 고무 격 막과 둥근 바닥 플라스 크를 밀봉 하십시오.</li>
	<li>septa에 20 G 척수 바늘을 삽입 하 고 고무 뿌리고와 산소 탱크에 연결. 어떤 오염 물질을 필터링 하려면 필터를 만드는 튜브에 휴지를 삽입 합니다. 낮은에 산소 유출 켭니다. 격 막의 파열을 피하기 위해 septa에 10-15 유출 바늘을 삽입 합니다.</li>
	<li>클램프를 사용 하 여 링 스탠드에 최대 집합을 장악 하 고 37 ° c 30-45 분 동안 저 어 플레이트 보정 물 욕조에 배치. 후 조직 15 분 동안 배양 되어, 천연된 샘에 대 한 시각적으로 부 화 미디어의 50 µ L을 제거 합니다. 선 밀도 또는 하지 않은 경우 추가 5-10 분 동안 떠나 조직 으로부터 분리.</li>
	<li>50 mL을 추가, 부 화 직후 살 균 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 부 화 미디어 또는 외피 혼합물에 직접 붓는 의해 미리 DMEM/F12를가 열.</li>
	<li>4 50 mL 원뿔 튜브로 멸 균 거 즈를 통해 선 혼합물을 필터링 합니다. 추출 된 땀 샘 원뿔 튜브의 하단에 정착 수 있도록 15 분 동안 얼음에 여과 액을 유지 합니다. 수 정착된 동맥 방해, 제거 하 고 상단 표면에 뜨는 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 40 mL을 삭제 하지 않도록 주의 하십시오. 항생제로 보충 하는 DPBS의 10 mL에 나머지 10 mL를 resuspend.</li>
	<li>5 mL 셀 문화 시험관으로 혼합물을 균등 하 게 배포 합니다. 4 ° C에서 65 x g에 5 분 동안 centrifuge 고 상쾌한 한 피 펫을 사용 하 여 신중 하 게 제거 합니다. 피 펫 또는 200 µ L 넓은 피 펫 팁을 사용 하 여 해 동된 지하실 멤브레인 매트릭스에 선 펠 릿 resuspend 동 질 때까지 섞는다. 참고: 얼음에이 단계를 수행 하 고 혼합 하는 동안 지하실 멤브레인 행렬의 합을 피하기 위하여 결정적 이다. 또한, 그것은 시각적으로 선 밀도 50 µ L에 대 한 샘플링 검사 하는 것이 중요입니다. 최적의 밀도 ~ 70 %confluency입니다.</li>
	<li>다음으로, 지하실 멤브레인 매트릭스 넓은 스쳐 피 펫을 사용 하 여 50 µ L에 선 접시. 도금 하는 동안 모든 거품을 생성 하지 마십시오.</li>
	<li>37 ° c.에 10-15 분 동안 품 어 유해를 지하실 멤브레인 매트릭스를 허용 하려면 12 잘 문화 접시에 도금 하는 경우 추가 hFGO 미디어의 1 mL (고급 Dulbecco의 수정된이 글 매체/F12 매체 보충 2 mM L-글루타민, 1% 페니실린/스, 0.25 mg/mL 암포 B 10 mg/mL Gentamicin, 50 mg/mL 대, 10 mM HEPES 버퍼, 1 m m n-Acteylcystine, 1 x N2, B27, Wnt 조절 매체 50%, 20% R spondin 조절 매체 100 ng/mL으로 보충 1 뼈 morphogenetic 단백질 억제제, 1 nM gastrin, 50 ng/mL 표 피 성장 인자, 200 ng/mL 섬유 아 세포 성장 인자 10, 10 니코틴, 및 10 µ M Y-27632 바위 억제제) 잘 당. 그렇지 않으면 12-잘 문화 접시를 사용 하 여 추가 지하실 멤브레인 매트릭스 거품 잠수함 충분 한 미디어.</li>
	<li>5% CO2 습도 셀 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 세포 문화. 모든 4-5 일 미디어를 변경 합니다.</li>
</ol>2. 마우스 파생 3D 위 Fundic Organoids 구축
참고:이 프로토콜은 이전에 게시 6되었습니다. 얼음 지하실 멤브레인 매트릭스를 해 동 하 고 시작 하기 전에 모든 시 약 준비.
<ol><li>연구 수행 되 고 있는 연구 기관에 의해 승인 메서드를 사용 하는 쥐를 희생. 마우스에서 위를 제거 하 고 이전에 게시 프로토콜 6따라 해 부. 20 mL 얼음 차가운 캘리포니아2 +/Mg2 +세척-DBPS 무료. 참고: C57BL/6 마우스, 세 8-10 주 fundic 위 organoid 문화에 대 한 사용 됩니다. 쥐 위 제거 하기 전에 수동 경부 전위 뒤 이산화탄소의 흡입에 의해 안락사 되었다.</li>
	<li>위장에서 근육 층을 제거 하 고 모든 보이는 혈관 이전 6출판.</li>
	<li>동굴에서 살 균 면도날을 사용 하 여 forestomach는 저를 구분 합니다. 작은 수술가 위를 사용 하 여 파편 약 2.0 x 2.0 m m. 집게를 사용 하 여에 컷된 저 EDTA 인큐베이션 버퍼를 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브에 파편을 수집 (캘리포니아2 +/Mg2 +-무료 DPBS, 5 mM EDTA)와 함께 2 h 4 ° C에서 품 어 부드러운 동요입니다.</li>
	<li>살 균 후드, 원뿔 관 두고 그대로 조각 가능한 많은 외피 버퍼를 제거 하는 피 펫을 사용 하는 약 5 분에 대 한 얼음 조각. 추가 버퍼를 떨고 5 mL (1 g D-솔 비 톨, 100 ml Ca2 +/Mg2 +1.47 g 자당-DPBS 무료) 2 분 허용 정착 하 고 서둘러, 1000 p 피 펫을 사용 하 여 제거 아직 정착 해야 작은 조각 큰 조각 힘으로 손으로 흔들어 상위 계층.</li>
	<li>65 x g에서 4 ° C에서 5 분 동안 제거 조각 회전.</li>
	<li>공기 거품을 피하 면 서,는 상쾌한을 제거 하 고 지하실 멤브레인 매트릭스에 resuspend 때까지 균질 성 혼합.</li>
	<li>넓은 팁 피 펫을 사용 하 여 잘 당 50 µ L에서 지하실 멤브레인 매트릭스 접시와 다음 20 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>충분 한 mFGO 성장 매체 추가 (고급 Dulbecco의 수정이 글 매체/F12 매체 2 mM L-글루타민, 1% 페니실린/스, 10mm 보충 HEPES 버퍼, 1 m m n-Acteylcystine, 1 x N2, 1 x B27, 50 %Wnt 조절 매체, 20% R spondin 조절 매체와 100 ng/mL 뼈 morphogenetic 단백질 억제제, 10 nM gastrin, 50ng/mL 표 피 성장 인자, 10 ng/mL 섬유 아 세포 성장 인자 10, 10 µ M Y-27632 바위 억제제 보충) 거품 잠수함.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO2 습도 셀 문화 인큐베이터에서 세포 문화. 모든 4-5 일 미디어를 변경 합니다.</li>
</ol>3. 콜라겐 코팅 2D 전송
참고: 별도로 지정 하지 않는 한 무 균 조직 문화 후드에 모든 절차를 수행 합니다. 콜라겐은 단층을 3D organoids를 전송 하기 전에 24 시간 코팅을 시작 합니다. 얼음에 쥐 꼬리 콜라겐을 유지 하 고 빛 으로부터 차폐 된. 콜라겐 코팅 접시는 최대 2 주에 대 한 좋은. 코팅된 접시를 즉시 사용 하지, 경우 랩 parafilm 및 필요한 때까지 4 ° C에서 저장소 접시.
<ol><li>쥐 꼬리 콜라겐 20 m m 초 산을 사용 하 여 50 µ g/mL로 희석.</li>
	<li>충분히 희석된 콜라겐과 우물의 표면 커버. 표준 12-잘 접시에 한 잘, 콜라겐의 약 1 mL와 함께 코트. 살 균 후드에 실 온에서 하룻밤 둡니다.</li>
	<li>캘리포니아2 +/Mg2 +1 mL로 두 번 세척-DPBS 잘 당 고 떠나 살 균 후드에 실 온에서 2 h에 대 한 발견.</li>
</ol>4. 지하실 멤브레인 매트릭스 코팅 2D 전송
참고: 별도로 지정 하지 않는 한 무 균 조직 문화 후드에 모든 절차를 수행 합니다. 지하실 막 매트릭스 2 h는 단층을 3D organoids를 전송 하기 전에 코팅을 시작 합니다. 얼음에 지하실 멤브레인 매트릭스를 유지. 코팅된 판 즉시 사용할 수 있으며 시간의 오랜된 기간 동안 저장할 수 없습니다.
<ol><li>지하실 막 매트릭스 셀 문화 학년 물 15 mL 원뿔 튜브에 1:10 희석 비율. 얼음에 희석.</li>
	<li>표준 12-잘 접시의 각 잘 희석된 지하실 멤브레인 매트릭스의 100 µ L를 추가할는 피 펫을 사용 하 여. 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 균등 하 게도 코트 잘 걸쳐 희석된 지하실 멤브레인 매트릭스를 배포 합니다.</li>
	<li>1 시간 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>피 펫을 사용 하 여 잔여 물을 제거 하 고 3D organoids를 전송 하기 전에 1 시간 실 온에서 건조.</li>
</ol>5. 2D 위 상피 세포 Monolayers 3D m/hFGOs의 전송
<ol><li>후 3D 마우스-또는 인간-파생 된 FGOs에 6-7 일에 대 한 교양 있다, 2D 단층을 3D organoids의 전송을 시작 합니다. 참고: 필요한 단층의 각 잘이 좋습니다 300 그대로 organoids 또는 300 organoids에서 파생 된 단일 셀을 사용 하 여. 강력한 문화에서 그것 약 150 organoid/잘 12 잘 문화 배지 내의 얻을 예정 이다.</li>
	<li>접시는 전송 하기 전에 코팅 해야 합니다. 그러나 참고: 지하실 멤브레인 매트릭스 코팅 접시 반투명 젤 레이어,, 콜라겐 코팅 판 코팅의 어떤 명백한 표시 없는 것입니다.</li>
	<li>직접 pipetting 1 mL 균 캘리포니아2 +/Mg2 +여 접시에서 3D 지하실 멤브레인 매트릭스 거품을 꺼내-거품의 중심에 DBPS 무료.</li>
	<li>피 펫을 사용 하 여, 셀 문화 테스트 튜브로 지하실 멤브레인 매트릭스, organoid 혼합물을 수집 합니다. 튜브 당 2 지하실 멤브레인 매트릭스 거품의 비율로 수집 합니다. 40 x g와 4 ° C에서 5 분 동안 원심 분리기</li>
	<li>진공 시스템을 사용 하 여 제거는 상쾌한 그리고 최대한 많은 지하실 멤브레인 매트릭스. 캘리포니아2 +/Mg2 +4 ml에서 resuspend-무료 DBPS, 상쾌한를 제거 하 고 2-3 회 반복. 전체 organoid 전송 프로토콜에 대 한 5.10 단계로 진행 합니다. 5.7 단일 셀 서 스 펜 션 프로토콜에 대 한 단계를 계속 합니다.</li>
	<li>37 ° C에 세포 분리 솔루션을 미리 따뜻한 고 각 시험관에 1 mL를 추가 합니다. 부드럽게 튜브를 반전 하거나 한 피 펫으로 아래로 pipetting으로 혼합. 37 ° c.에서 10 분 동안 품 어</li>
	<li>캘리포니아2 +/Mg2 +의 2 개 mL를 추가-각 테스트 튜브에 직접 DBPS 무료.</li>
	<li>26 G 바늘을 사용 하 고 주사기는 혼합 2-3 번. 시각적으로 하나의 셀에 대 한 확인 합니다. Organoids 또는 셀의 클러스터는 여전히 1-2 번 더 주사기.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분 동안 40 x g에서 원심 분리기 2D FGO 미디어에 펠 릿을 resuspend (2D 마우스 FGO 성장 매체: 고급 Dulbecco의 수정된이 글 매체/F12 매체 보충 2 m L-글루타민, 10mm 페니실린/스, 10% 태아 종 아리 혈 청, 10 mM HEPES 버퍼, 1 x N2, 1 x B27, 10 nM gastrin, 50 ng/mL 표 피 성장 인자, 1 µ M TGF-β 억제제와 10 µ M Y-27632 바위 억제제 보충. 2D 인간의 FGO 성장 매체: 고급 Dulbecco의 수정된이 글 매체/F12 매체 보충 2 mM L-글루타민, 1% 페니실린/스, 10 mM HEPES 버퍼, 10% 태아 종 아리 혈 청, 10mm 니코틴, 1 x N2, 1 x B27, 50 mg/mL 대, 50 ng/mL 상피 성장으로 보충 요인, 그리고 10 µ M Y-27632 바위 억제제, 1 µ M TGF-β 억제제).</li>
	<li>코팅된 판에 물의 resuspension 플레이트입니다. 37 ° c.에 번호판을 품 어 교체 미디어 매 4 일 또는 이전 미디어 노란색. 단층 형태로 약 4 일이 필요합니다.</li>
</ol>6. 스크래치 상처 분석 결과 2D 위 상피 세포 Monolayers를 사용 하 여
<ol><li>문화에는 100 %confluency 도달 했습니다 때 면도날을 사용 하는 단층 스크래치.</li>
	<li>실 온에서 15 분 동안 3.7% 포름알데히드를 사용 하 여 monolayers를 수정 합니다. 실 온에서 20 분 동안 0.5% 비 이온 세제/PBS와 permeabilize.</li>
	<li>다음 실 온에서 1 h에 대 한 혈 청 2% 당나귀와 monolayers를 차단 하 고 H+, K+의 1:1000 희석을 품 어-ATPase 1 차적인 항 체 하룻밤 4 ° C에서 0.1% 비 이온 세제/PBS로 세척 및 당나귀의 1: 100 희석으로 품 어 반대로 마우스 488 이차 항 체 및 10μg/mL Hoechst 세포 핵의 실 온에서 1 시간을 위한 얼룩.</li>
	<li>2D 인간 파생 위 단층 문화에 표면 점액 핏 셀을 확인 하려면 셀 20 μ g /mL Ulex europaeus (UEAI) FITC 켤레의 얼룩. 이미지는 confocal 현미경에 monolayers.</li>
	<li>상처 마다 몇 h. 스크래치 것입니다 다시는 단층의 품질에 따라 24-48 h와 환자 사이 사이 epithelialize의 이미지를 가져가 라.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nagy, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+regulates+cellular+migration+and+apoptosis+by+activation+of+phosphatidylinositol+3-kinase+signaling.">Helicobacter pylori regulates cellular migration and apoptosis by activation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling.</a> J Infect Dis. 199 (5), 641-651 (2009).</li><li>Mnich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Helicobacter+pylori+on+the+healing+process+of+the+gastric+barrier.">Impact of Helicobacter pylori on the healing process of the gastric barrier.</a> World J Gastroenterol. 22 (33), 7536-7558 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bm-TFF2,+a+toad+trefoil+factor,+promotes+cell+migration,+survival+and+wound+healing.">Bm-TFF2, a toad trefoil factor, promotes cell migration, survival and wound healing.</a> Biochem Biophys Res Commun. 398 (3), 559-564 (2010).</li><li>Crabtree, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cytokines+in+pathogenesis+of+Helicobacter+pylori-induced+mucosal+damage.">Role of cytokines in pathogenesis of Helicobacter pylori-induced mucosal damage.</a> Dig Dis Sci. 43 (Supplement), 46S-53S (1998).</li><li>Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. 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저자는 공개 없다.

현재 프로토콜 세부 인간 및 마우스 파생 된 위 상피 monolayers 스크래치 상처 분석 실험을 위해 사용 될 수 있는 설립. 프로토콜 주민 줄기 세포 주 인간 (또는 마우스)에서 절연 조직의 개념에 의존 하 고는 수정 된 프로토콜 처음 발행 Schlaermann 외7. 특히, 우리는 합칠 확립 여기 프로토콜을 최적화 하 고 어떤 표현 주요 세포 계보 vivo에서위 상피 내에서 찾을 수 있는 ?...

처음 상처 분석 실험의 사용 수리 및 재생1,2,,34,,56공부에 대 한 인기 있는 방법입니다. 특별히 위 중생과 헬리코박터 파일로리 식민지 연구 제안 된 방법론을 사용할 수 있습니다. 과거에는, 위 암 세포 선 헬리코박터 파일로리 (헬리코박터) 감염1,2 를 공부 하는 수단으로 사용 되었습니다 했으며 최근 위 암까지 AGS 셀 등 셀 라인 선호1 ,2,,34. 위 암 세포 배양의 한계가 정리 위 상피의 세포 다양성에 그들의 실패 이다. 이 한계를 해결 하려고 하 시연 설립 및 기본 인간 및 마우스 파생 3 차원 fundic 위 organoids (FGOs)의 이동은 여기 먼저 수정 된 방법에 따라 상처 치유 분석 실험에 대 한 위 상피 단층을 Schlaermann 외에의해 설명. 7 위 상피 monolayers에서 파생 된 전단 3D 위 FGOs 또는 단일 셀 FGO 파생 된 유지 밀접 하 게 위 상피의 나타내는 편광된 세포 구성 시연 vivo에서. 위 암 셀 라인 팬 들은이 기술을 표시 셀 구성의 정보를 입증 하지 않습니다, 그는 현재 프로토콜 대체 스크래치 상처 분석 방법에 비해 장점이 있다. 이 방법론은 해리 organoids에서 단일 세포 현 탁 액 또는 전체 organoids에서 설립 하 고 지하실 멤브레인 매트릭스를 사용 하 여 도금 또는 콜라겐 코팅 monolayers 수 면 최적화 되었습니다. 이 프로토콜의 전반적인 목표는 organoid 파생 된 위 상피 단층 문화 소설 상처 치유 분석 결과 대 한 설정입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced Dulbecco&#39;s modified Eagle/F12 medium (basal media)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (L-glutamine)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B/Gentamicin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R01510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>RO1510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Acetylcystine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP Inhibitor (Noggin)</td>
			<td>Pepro Tech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Pepro Tech</td>
			<td>315-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>Pepro Tech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 ROCK Inhibitor</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946; Inhibitor</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2+/Mg2+ -free DPBS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>21-031CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>FBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTIMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22&#181;M filter</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>099-720-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C Water Bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type 1</td>
			<td>Worthington&#160;</td>
			<td>LS004214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes (tissue paper)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>06-666C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125 mL round bottom flask</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 in (25 mm) stir bar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Septa</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Stand</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Stand Clamps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile petri dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G needles of 1.5 in length</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 G spinal needles of 3.5 in length</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>405182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture treated plate</td>
			<td>Midwest Scientific</td>
			<td>92012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factor Reduced, Phenol Red-free MatrigelTM (Basement membrane matrix)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CB-40230C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Razor Blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-tip tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Hemostatic Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L wide pipette tips</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>02-707-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL cell culture test tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-956-3C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Tank with rubber hosing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 g D-Sorbitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SS-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Tray</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking Table</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Tail Collagen Type 1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10483-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture grade glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A38-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture grade water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-055-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-well chamber slide</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>155380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Transwell (polyester membrane inserts)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase (cell detachment solution)</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>263/8 G syringe</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>309625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L Cells</td>
			<td>L cells, a Wnt3a producing cell line, were received as a gift from Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands).&#160;&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293T Rspondin secreting cells</td>
			<td>A modified HEK-293T R-spondin secreting cell line was obtained from Dr. Jeff Whitsett (Section of Neonatology, Perinatal and Pulmonary Biology, Cincinnati Children&#39;s Hospital Medical Centre and The University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, USA&#160;).&#160;&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HK-ATPase Primary Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>SC-374094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-Cadherinn</td>
			<td>SantaCruz</td>
			<td>sc-59778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UEA1</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L9006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexafluor 488 secondary antibody (Donkey anti-mouse 488 secondary antibody)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R37114</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse- and human-derived primary gastric epithelial monolayer culture for the study of regeneration

위 상처 복구의 생체 외에서 연구는 일반적으로 세포질 확산 및 마이그레이션의 스크래치 상처 분석 결과에서 위 암 세포 라인의 사용을 포함 한다. 그러나 이러한 분석의 한 가지 중요 한 한계는, 그들의 균질 성 다양 한 세포 종류입니다. 복구는 여러 종류의 세포 상호 작용을 요구 하는 복잡 한 프로세스입니다. 따라서, 세포 하위, 없는 문화 공부를 우리가 복구 프로세스를 이해 하 고 있다면 극복 되어야 하는 관심사 이다. 위 organoid 모델에 의하여 세포 유형의 이기종 컬렉션 밀접 하 게 위 상피 또는 다른 기본 조직 비보의 반영이 문제를 완화 수 있습니다. 여기는 소설, 스크래치 상처 시험 생체 외에서 인간에서 파생 된 증명 또는 마우스 3 차원 organoids 다음으로 옮겨질 수 위 상피 단층 중 그대로 organoids 또는의 단일 세포 현 탁 액으로는 해리 organoids입니다. 프로토콜의 목적은 organoid 파생 된 위 상피 monolayers 위 재생 연구 소설 스크래치 상처 분석 결과 시스템에서 사용할 수 있는 설정입니다.

Organoids는 인간의 코 퍼스/본문 또는 마우스 위 조직 (그림 1A)의 저에서 파생 되었다. 콜라 또는 인간 또는 마우스 파생 된 위장 조직의 EDTA 소화 후 각각 샘 지하실 멤브레인 매트릭스에 포함 되며 6-7 일 (그림 1A)에 대 한 교양. 그림 1B 인간 파생 위 organoids (huFGOs) 다음 위 상피 단층 (huGEM)로 지하실 멤브레인 ...

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Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

여기는 설정 하 고 2 차원 단층을 3D organoids의 전송에 대 한 인간 및 마우스 파생 된 3 차원 (3D) 위 organoids, 그리고 방법을 경작 하는 프로토콜에 설명 합니다. 재생 연구에 대 한 분석 결과 처음 상처를 소설로 위 상피 단층의 사용은 또한 기술 된다.

중생의 연구에 대 한 기본 위 상피 단층 문화 마우스 및 인간의 파생

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

mouse-human-derived-primary-gastric-epithelial-monolayer-culture-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.3K 조회수.  University of Cincinnati. 여기는 설정 하 고 2 차원 단층을 3D organoids의 전송에 대 한 인간 및 마우스 파생 된 3 차원 (3D) 위 organoids, 그리고 방법을 경작 하는 프로토콜에 설명 합니다. 재생 연구에 대 한 분석 결과 처음 상처를 소설로 위 상피 단층의 사용은 또한 기술 된다.

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Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

마우스의 응용은 M 세포에 의해 박테리아 이해를 평가하는 Peyer의 패치 장 루프 분석 출혈도 잡았

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

연구

면역학 및 감염병학

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent reactivation events that ensure transmission and contribute to clinical disease. Current antivirals do not impact the latent reservoir and there are no vaccines. While the molecular details of lytic replication are well-characterized, mechanisms controlling latency in neurons remain elusive. Our present understanding of latency is derived from in vivo studies using small animal models, which have been indispensable for defining viral gene requirements and the role of immune responses. However, it is impossible to distinguish specific effects on the virus-neuron relationship from more general consequences of infection mediated by immune or non-neuronal support cells in live animals. In addition, animal experimentation is costly, time-consuming, and limited in terms of available options for manipulating host processes. To overcome these limitations, a neuron-only system is desperately needed that reproduces the in vivo characteristics of latency and reactivation but offers the benefits of tissue culture in terms of homogeneity and accessibility.
Here we present an in vitro model utilizing cultured primary sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG) (Figure 1) to study HSV-1 latency and reactivation that fits most if not all of the desired criteria. After eliminating non-neuronal cells, near-homogeneous TrkA+ neuron cultures are infected with HSV-1 in the presence of acyclovir (ACV) to suppress lytic replication. Following ACV removal, non-productive HSV-1 infections that faithfully exhibit accepted hallmarks of latency are efficiently established. Notably, lytic mRNAs, proteins, and infectious virus become undetectable, even in the absence of selection, but latency-associated transcript (LAT) expression persists in neuronal nuclei. Viral genomes are maintained at an average copy number of 25 per neuron and can be induced to productively replicate by interfering with PI3-Kinase / Akt signaling or the simple withdrawal of nerve growth factor1. A recombinant HSV-1 encoding EGFP fused to the viral lytic protein Us11 provides a functional, real-time marker for replication resulting from reactivation that is readily quantified. In addition to chemical treatments, genetic methodologies such as RNA-interference or gene delivery via lentiviral vectors can be successfully applied to the system permitting mechanistic studies that are very difficult, if not impossible, in animals. In summary, the SCG-based HSV-1 latency / reactivation system provides a powerful, necessary tool to unravel the molecular mechanisms controlling HSV1 latency and reactivation in neurons, a long standing puzzle in virology whose solution may offer fresh insights into developing new therapies that target the latent herpesvirus reservoir.

The protocol describes an efficient and reproducible model system to study herpes simplex virus type 1 (HSV-1) latency and reactivation. The assay employs homogenous sympathetic neuron cultures and allows for the molecular dissection of virus-neuron interactions using a variety of tools including RNA interference and expression of recombinant proteins.

헤르페스의 연구를위한 예비 신경 세포 문화 시스템은 바이러스 지연 및 재가입을 단순

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

기능 및 분자 연구 기본 손쥐 유형 II 폐포 상피 세포의 흐름 Cytometric 절연

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

양극화 인간기도 액체 덮인 문화를 구축 호흡기 병원균에 대한 숙주 세포 응답을 공부하는 상피 Calu-3 전지<em&gt; 체외에서</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Printing Thermoresponsive Reverse Molds for the Creation of Patterned Two-component Hydrogels for 3D Cell Culture

Bioprinting is an emerging technology that has its origins in the rapid prototyping industry. The different printing processes can be divided into contact bioprinting1-4 (extrusion, dip pen and soft lithography), contactless bioprinting5-7 (laser forward transfer, ink-jet deposition) and laser based techniques such as two photon photopolymerization8. It can be used for many applications such as tissue engineering9-13, biosensor microfabrication14-16 and as a tool to answer basic biological questions such as influences of co-culturing of different cell types17. Unlike common photolithographic or soft-lithographic methods, extrusion bioprinting has the advantage that it does not require a separate mask or stamp. Using CAD software, the design of the structure can quickly be changed and adjusted according to the requirements of the operator. This makes bioprinting more flexible than lithography-based approaches.
Here we demonstrate the printing of a sacrificial mold to create a multi-material 3D structure using an array of pillars within a hydrogel as an example. These pillars could represent hollow structures for a vascular network or the tubes within a nerve guide conduit. The material chosen for the sacrificial mold was poloxamer 407, a thermoresponsive polymer with excellent printing properties which is liquid at 4 &deg;C and a solid above its gelation temperature ~20 &deg;C for 24.5% w/v solutions18. This property allows the poloxamer-based sacrificial mold to be eluted on demand and has advantages over the slow dissolution of a solid material especially for narrow geometries. Poloxamer was printed on microscope glass slides to create the sacrificial mold. Agarose was pipetted into the mold and cooled until gelation. After elution of the poloxamer in ice cold water, the voids in the agarose mold were filled with alginate methacrylate spiked with FITC labeled fibrinogen. The filled voids were then cross-linked with UV and the construct was imaged with an epi-fluorescence microscope.

A bioprinter was used to create patterned hydrogels based on a sacrificial mold. The poloxamer mold was backfilled with a second hydrogel and then eluted, leaving voids which were filled with a third hydrogel. This method uses fast elution and good printability of poloxamer to generate complex architectures from biopolymers.

모방의 창조 3D 세포 배양을위한 두 구성 요소 히드로 겔에 대한 Thermoresponsive 역 금형 인쇄

Bioprinting is an emerging technology that has its origins in the rapid prototyping industry. The different printing processes can be divided into contact ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is initiated by interaction of the pathogen with intestinal epithelial cells. This interaction leads to disruption of intercellular structures such as tight junctions (TJ). TJ ensure sealing of the epithelial layer to separate host tissue from gut lumen. Recent studies provide evidence that disruption of TJ by the parasitic protein EhCPADH112 is a prerequisite for E. histolytica invasion that is accompanied by epithelial barrier dysfunction. Thus, the analysis of molecular mechanisms involved in TJ disassembly during E. histolytica invasion is of paramount importance to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis. This article presents an easy model that allows the assessment of initial host-pathogen interactions and the parasite invasion potential. Parameters to be analyzed include transepithelial electrical resistance, interaction of EhCPADH112 with epithelial surface receptors, changes in expression and localization of epithelial junctional markers and localization of parasite molecules within epithelial cells.

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Human infection by Entamoeba histolytica leads to amoebiasis, a major cause of diarrhea in tropical countries. Infection is initiated by pathogen interactions with intestinal epithelial cells, provoking the opening of cell-cell contacts and consequently diarrhea, sometimes followed by liver infection. This article provides a model to assess the early host-pathogen interactions to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis.

에 의해 제작 상피 손상의 분석<em&gt; Entamoeba 아메바</em&gt; 감염

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express Fc&#947;Rs (e.g., Fc&#947;RI, Fc&#947;RIIA, Fc&#947;RIIB, and Fc&#947;RIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of Fc&#947;R-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate Fc&#947;Rs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out Fc&#947;R-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo Fc&#947;R-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of Fc&#947;R-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis.

단핵구 단층 분석의 사용은 Fcγ 수용체 - 매개 식균 작용을 평가하기

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in humans. Several mouse models of gastric Helicobacter infection have been developed to study the molecular and cellular mechanisms whereby H. pylori bacteria colonize the stomach of human hosts and cause disease. Herein, we describe protocols to: 1) prepare bacterial suspensions for the in vivo infection of mice via intragastric gavage; 2) determine bacterial colonization levels in mouse gastric tissues, by polymerase chain reaction (PCR) and viable counting; and 3) assess pathological changes, by histology. To establish Helicobacter infection in mice, specific pathogen-free (SPF) animals are first inoculated with suspensions (containing &#8805;105 colony-forming units, CFUs) of mouse-colonizing strains of either Helicobacter pylori or other gastric Helicobacter spp. from animals, such as Helicobacter felis. At the appropriate time-points post-infection, stomachs are excised and dissected sagittally into two equal tissue fragments, each comprising the antrum and body regions. One of these fragments is then used for either viable counting or DNA extraction, while the other is subjected to histological processing. Bacterial colonization and histopathological changes in the stomach may be assessed routinely in gastric tissue sections stained with Warthin-Starry, Giemsa or Haematoxylin and Eosin (H&#38;E) stains, as appropriate. Additional immunological analyses may also be undertaken by immunohistochemistry or immunofluorescence on mouse gastric tissue sections. The protocols described below are specifically designed to enable the assessment in mice of gastric pathologies resembling those in human-related H. pylori diseases, including inflammation, gland atrophy and lymphoid follicle formation. The inoculum preparation and intragastric gavage protocols may also be adapted to study the pathogenesis of other enteric human pathogens that colonize mice, such as Salmonella Typhimurium or Citrobacter rodentium.

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Mice represent an invaluable in vivo model to study infection and diseases caused by gastrointestinal microorganisms. Here, we describe the methods used to study bacterial colonization and histopathological changes in mouse models of Helicobacter pylori-related disease.

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

Bursal 전염병 바이러스 병 인을 공부 하는 Ex Vivo 닭 기본 Bursal 세포 배양 모델

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate balance of mucosal homeostasis. These 3D, multi-cellular systems offer a reductionist model for addressing multi-factorial diseases and resolving technical difficulties that arise when studying rare cell types such as tissue-resident innate lymphoid cells (ILCs). This article describes a murine system that combines small intestine organoids and small intestine lamina propria derived helper-like type-1 ILCs (ILC1s), which can be readily extended to other ILC or immune populations. ILCs are a tissue-resident population that is particularly enriched in the mucosa, where they promote homeostasis and rapidly respond to damage or infection. Organoid co-cultures with ILCs have already begun shedding light on new epithelial-immune signaling modules in the gut, revealing how different ILC subsets impact intestinal epithelial barrier integrity and regeneration. This protocol will enable further investigations into reciprocal interactions between epithelial and immune cells, which hold the potential to provide new insights into the mechanisms of mucosal homeostasis and inflammation.

This protocol offers detailed instructions for establishing murine small intestine organoids, isolating type-1 innate lymphoid cells from the murine small intestine lamina propria, and establishing 3-dimensional (3D) co-cultures between both cell types to study bi-directional interactions between intestinal epithelial cells and type-1 innate lymphoid cells.

뮤린 소장 상피 오가노이드와 선천적 림프성 세포의 공동 배양

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate ...