리슈만 편모충 감염에서 식균 작용과 관련된 메커니즘은 아직 잘 이해되지 않았습니다. 여기에서는 숙주 세포에 대한 리슈만편모충 상호작용 동안 경화의 초기 상태를 평가하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 Leishmania 식균 작용의 다른 상태와 여러 단백질의 참여를 연구하는 주요 이점으로 제시됩니다.
이 기술은 박테리아, 효모에 의한 감염 또는 다른 유형의 세포에 의한 삼킴을 포함하여 다른 유형의 연구로도 확장 될 수 있다는 점은 주목할 가치가 있습니다. 이 기술을 시도하는 사람들은 뉴클레오펙터 용액에 대한 세포의 노출 시간을 관리해야 합니다. 또한 최대 2개의 플라스미드를 사용하여 형질감염 테스트를 시작하는 것이 좋습니다.
절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 박사 과정 학생 인 Amanda Reboucas가 될 것입니다. 우선, 0.2 백만 THP-1 세포 또는 인간 단핵구 유래 대 식세포를 13mm 유리 커버 슬립이있는 24 웰 플레이트에 웰 당 500 마이크로 리터 RPMI로 시드합니다. 5% 이산화탄소의 밑에 섭씨 37도에 24 시간 동안 인큐베이션하고, 0.9% 식염수로 세포를 두 번 세척하고, 완전한 RPMI 매체에서 세포를 인큐베이션합니다.
고정상 리슈만편모충 종을 10개의 기생충으로 세포에 첨가하여 숙주 세포 비율로 한 다음, 섭씨 4도에서 10분 동안 720회 g으로 원심분리한다. 세포를 섭씨 4도에서 5분 동안 배양한 후 0.9% 식염수로 세포를 두 번 세척하여 내재화되지 않은 프로마스티고테를 제거합니다. 세포를 섭씨 37도의 보충된 RPMI 배지에서 1시간 동안 배양한 다음, 세포를 4%PFA로 15분 동안 고정합니다.
그런 다음 선호하는 장착 미디어를 사용하여 커버슬립을 장착합니다. 그런 다음 형광 현미경으로 무작위 필드에서 최소 400개의 세포를 계수합니다. 리슈만편모충 유도 PV 생물발생을 조사하려면 밀리리터 PMA당 100나노그램이 보충된 10밀리리터의 Complete RPMI 배지가 포함된 75제곱센티미터 조직 배양 플라스크에 1,500만 개의 THP-1 세포를 시딩하여 THP-1 세포를 플라스미드로 형질감염을 시작하고 48시간 동안 메르캅토에탄올에 50마이크로몰을 투여합니다.
그런 다음 0.9% 식염수에서 세포를 한 번 세척하고 비효소 세포 해리 용액을 사용하여 세포를 분리합니다. 이어서, 실온에서 5분 동안 250회 g으로 원심분리한다. 다음으로, THP-1 세포를 1밀리리터의 RPMI 배지에 재현탁시키고 노이바우어 챔버에서 계수를 수행한다.
세포를 다시 250회 g에서 실온에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 버린다. 100 마이크로 리터의 Nucleofector 용액에 2 백만 개의 세포를 재현탁하고 형광 단백질로 태그 된 관심 단백질에 대해 0.5 마이크로 그램의 플라스미드 코팅으로 배양합니다. THP-1 세포 및 핵산을 함유하는 현탁액을 뉴클레오펙터 큐벳으로 옮긴다.
이어서, 뉴클레펙터 프로그램 Y를 사용하여 세포를 형질감염시킨다. 형질감염된 세포를 회수하고 13mm 유리 커버슬립이 있는 24웰 플레이트의 500마이크로리터의 RPMI 배지에 시드합니다. 세포를 배양하고 RPMI 배지를 섭씨 37도에서 0.5, 2, 4, 6, 12 및 24시간 동안 배양합니다.
13mm 유리 커버슬립을 실온에 두고 획득 최소 30분 전에 빛으로부터 보호하십시오. 흡수성 티슈로 커버 슬립을 청소하십시오. 그런 다음 대물렌즈에 침지 오일 한 방울을 추가한 다음 슬라이드를 추가합니다.
오일이 슬라이드에 닿을 때까지 대물렌즈를 위로 이동합니다. 현미경의 초점을 관찰 및 조정하고 오일이 포함된 옵션 63x 대물렌즈를 선택합니다. LIQA 프로그램을 열고 488, 552 및 405 파장의 레이저를 조정합니다.
이미지 해상도를 1024 x 1024로 선택합니다. 라이브 버튼을 클릭 한 후 Z 스택을 설정하고 시작 옵션을 누릅니다. 이미지 획득을 기다린 다음 도구에서 최대 투영 옵션을 선택합니다.
실험을 저장하고 TIFF 형식 이미지를 컴퓨터로 내보냅니다. 결과는 Leishmania Braziliensis LCL 및 Leishmania Braziliensis DL이 대식세포에 유사하게 결합하는 것으로 나타났습니다. 또한, 숙주 세포에 의한 리슈만편모충 브라질리엔시스 LCL 및 리슈만편모충 브라질리엔시스 DL 식균작용에 대해서는 차이가 관찰되지 않았다.
리슈만편모충 브라질리엔시스 LCL 또는 리슈만편모충 브라질리엔시스 DL에 의해 유도된 기생 액포 또는 PV에 LC3의 모집을 감염된 세포에서 비교했습니다. 감염 4시간 후, 리슈만편모충 브라질리엔시스 LCL 및 리슈만편모충 브라질리엔시스 DL에 감염된 대식세포에서 유사한 비율의 LC3-장식 PV가 관찰되었다. 따라서, 결과는 리슈만편모충 브라질리엔시스 LCL 및 리슈만편모충 브라질리엔시스 DL이 LC3 모집과 관련하여 PV의 결합, 식균작용 및 생물발생 동안 대식세포와 유사하게 상호작용한다는 것을 보여주었다.
대표적인 현미경 이미지는 THP-1 세포를 PLC-GFP, Rab5-GFP, Rab7-GFP 플라스미드로 효율적으로 형질감염시키는 것을 입증했습니다. 이 프로토콜을 시도하는 사람들은 온도 배양에주의를 기울여야하며 모든 유형의 빛으로부터 현미경 샘플을 보호해야합니다. 리슈만편모충 식작용을 촉진하는 확인된 단백질의 발현을 조절하는 것은 리슈만편모충 감염 결과에서 이러한 단백질의 중요성을 입증할 것입니다.
우리는이 기술을 치료 전략 개발을위한 기생충 설정 및 표적 식별과 관련된 다양한 유형의 병리학 연구 및 메커니즘으로 확장 할 수 있습니다.
