이 프로토콜은 키탄 감염에 척추 동물 호스트의 전신 보기를 제공하기 때문에, Leishmania 독성을 공부에 적합합니다. 이 프로토콜을 채택의 주요 장점은 연구원이 호스트 염증 반응 및 기생충 복제를 동시에 평가할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 구색 leishmaniasis 통제에 새로운 통찰력을 가져올 수 있는 독성과 관련있는 몇몇 표적 및 처리를 특성화하기 위하여 이용될 수 있습니다.
그것은 또한 다른 마우스 긴장 및 자 간 leishmaniasis를 일으키는 원인이 되는 Leishmania 종에 적용될 수 있습니다. 이 분석에는 쥐와 함께 편안하게 작업하고 전염성 물질에 우발적 인 노출을 피하기 위해 하위 플라터 주사를 수행 한 경험이있는 숙련 된 인력을 요구하는 것과 같은 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 기술자 인 리카르도 잠피에리 박사가 될 것입니다.
25센티미터 제곱 세포 배양 플라스크에서 L.amazonensis promastigotes를 성장시켜 시작하여 섭씨 25도에서 3일 동안 10밀리리터의 프로 배지를 함유하고 있습니다. 인큐베이션 후, 새로운 플라스크로 로그산스 성장 단계 무도회 배양의 파이펫 5 밀리리터. 플라스크에 아마 배지 5밀리리터를 넣고 34°C에서 34도에서 3~4일 동안 배양합니다.
새로운 플라스크에서 신선한 아마 매체로 1~3의 비율로 희석하여 문화를 분할합니다. 그런 다음 3 ~5 일 동안 다시 배양하십시오. PBS에서 희석된 축암절액의 알리쿼트를 노이바우어 챔버로 옮기고 비기각기생충을 계산한다.
이어서, 원하는 접종량 및 의도된 접종자의 수에 따라 PBS에서 현탁액을 희석한다. 준비된 기생충 서스펜션으로 27 게이지 바늘로 결핵 주사기를 적재합니다. 마우스가 발가락 핀치로 완전히 마취되고 왼쪽 뒷뒤 풋패드의 하위 판단 조직에 서스펜션의 50 마이크로리터를 접종하십시오.
캘리퍼를 사용하여 감염및 비감염된 풋패드의 두께를 측정하여 일주일에 한 번 병변의 진행을 기록하고, 병변 진행을 평가하기 위해 두 풋패드 간의 두께 차이를 계산한다. 병변 당 유리 조직 분쇄기 튜브에 프로 배지의 1 밀리리터를 추가하고 튜브의 무게. 소독을 위해 발판에 70%에탄올을 뿌리고 동물의 발을 발뒤꿈치에 제거하여 감염된 발판을 추출합니다.
가위와 집게가 70%에탄올에 담그도록 하여 멸균되도록 하십시오. 풋패드를 멸균 페트리 접시에 놓고 집게와 메스로 해부합니다. 모든 연조직을 수집하고 뼈를 폐기하십시오.
수집된 조직을 유리 조직 분쇄기 튜브로 옮기고 튜브를 다시 계량하여 병변 무게를 결정합니다. 조직을 분쇄기로 10번 균질화하여 완전한 조직 중단을 위해 혼합물이 정착되도록 합니다. 20 마이크로리터의 상체를 수집하고 원고 의 지시에 따라 준비된 96 웰 플레이트의 첫 번째 기둥과 첫 번째 차선에 적재합니다.
다음 세 차선이 각 동물에 대한 결과를 네 배로 증가시키려면 이 단계를 반복합니다. 멀티채널 파이펫을 사용하여 각 우물을 10회 균질화하고 희석된 시료의 20마이크로리터를 첫 번째 컬럼에서 두 번째 컬럼으로 이송합니다. 마지막 열에 도달할 때까지 직렬 희석을 계속하고 희석된 샘플의 최종 20 마이크로리터를 폐기합니다.
필름으로 접시를 밀봉하고 습한 챔버에서 7 일 동안 섭씨 25도에서 배양하십시오. 인큐베이션 후, 반전된 현미경하에서 플레이트를 분석하여 각 차선에 대해 잘 함유된 마지막 기생충을 결정한다. Leishmania 원생동물 기생충은 무척추 동물과 척추 동물 호스트에서 그들의 생활 주기 도중 2개의 발달 양식에 존재합니다: 무두질및 amastigotes.
악센 조건은 기생충 형태와 생존력을 유지하면서 시험관 내의 다양한 호스트 환경을 시뮬레이션할 수 있습니다. amastigotes에 대 한 악센 조건 산 성 환경 및 척추 동물 호스트의 증가 된 온도 모방. 무도회는 이러한 조건하에서 아마스티고로 구별됩니다.
중립 pH로 옮겨지고 섭씨 25도에서 배양하면 축아절 아마스티고스가 다시 무도회로 변합니다. 야생 유형과 리슈마니아 철 레귤레이터 1 녹아웃 균주의 독성 차이는 감염된 마우스 풋 패드에서 관찰되었다. LIR1은 리슈마니아의 세포 내 철 수준을 조절하고 철 수출을 중재하고 세포 내 축적을 독성 수준으로 방지합니다.
팽윤과 병변 진행의 차이를 포함하는 감염 분석은 LIR1이 생체 내 L.amazonensis에 필수적이라는 것을 밝혔습니다. 기생충 부하는 감염된 병변으로부터 의 한제한 희석 분석법을 수행함으로써 결정되었다. LIR1 녹아웃 감염된 마우스의 병변은 야생 형 Leishmania 감염된 마우스의 기생충보다 6 배 적은 기생충을 10에 포함하고, LIR1의 부재는 amastigotes의 세포내 복제를 방지한다는 것을 밝혔다.
이 절차를 수행 할 때 기억해야 할 가장 중요한 것 중 하나는 기생충 독성의 손실을 피하기 위해 10 번 미만 체외에서 통과 된 Leishmania 문화를 사용하는 것입니다. 이 절차 이외에, 시험관 내 감염 소서를 사용할 수 있습니다. 그러나, 이것은 제한된 방법이다, 호스트 기생충 상호 작용의 전신 생리적 개요를 제공하지 않기 때문에.
이 생체 내 방법은 추가 면역학적 연구를 위한 회수된 숙주 조직에서 혈청 바이오마커를 정량화하는 것과 같은 칼산 리슈만광증에 대한 전신 반응을 평가하는 최선의 접근법이다.
