미스터 덴마크 암 협회 (R146-A9394-16-S2)에서 친목에 의해 투자 되었다. MFB와 시가 AUFF 노바 (AUFF-E-2015-FLS-9-8)에 의해 투자 되었다. 미스터와 MFB 공동 대학원, 건강, AU에 의해 투자 되었다. E.F.W. 실험실은 경제 (SAF2015-70857, ERDF-유럽 연합에 의해 공동 투자)와 그랜트 (741888-과학 수사 대-재미) 고급 한 ERC의 스페인 정부에서 교부 금에 의해 지원 됩니다.
Liliana Fajardo Mellor (유전자, 개발 및 질병; 감사 하겠습니다. 국립 암 연구 센터) 원고의 중요 한 독서에 대 한.

이 프로토콜에는 실험실 쥐에서 수술을 포함 한다. 모든 동물 실험을 개별적으로 검토 하 고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 될 해야 합니다. 동물 복구 및 생존에 접근을 기반으로, 모든 시간에 적절 한 마 취, 통증 관리, 무 균 수술 환경 확인 합니다. 가 열 패드를 사용 하 여 수술 및 마 취에서 회복까지 저체온증을 방지 하기 위해.
1. 시작 시 고려 사항
<ol><li>사용 하는 바이러스에 따라 다른 titer 요구 사항이 적용 될 수 있습니다; 바이러스를 따라 희석. 참고:이 예제에서는 PBS에 희석 한 Adeno 관련 바이러스 titer 1 x 1012 IU/mL에 주입 됩니다. 바이러스 serotype 9 있으며 가이드 RNA Pten 를 유비퀴틴 promotor (그림 1) 아래 Cre 단백질의 표현을 포함 합니다. Pten 의 손실 증가 pAKT 전립선 상피13의 확산.</li>
	<li>수술의 때에 8 주의 나이에 남성 마우스를 사용 하 여 적절 한 전립선 개발 되도록. 참고:이 실험에서 쥐 Rosa26-LSL-Cas9-EGFP 쫓 고 마우스 C57BL/6J 배경12 (그림 1)에 있습니다.</li>
	<li>갓 전신 믹스를 준비 하 고 가능 하면 멸 균 유지. 참고: 복구를 위해 더 나은 동물 수술 후, 마 취 해독 제는 좋습니다.<ol>
<li>5 mL 마 취의 전체 볼륨, 혼합 준비 0.15 mL medetomidine 염 산 염 (1mg/mL), 0.4 mL midazolam (5 mg/mL), 및 0.25 mL butorphanol (10mg/mL) 4.2 mL와 멸 균 식 염 수 물 한다. 참고: 흡입 가능 isoflurane 등 대체 마 취 방법, 기관 동물 관리 지침에 따라 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>Medetomidine 염 수술 후의 효과를, 믹스 0.1 mL atipamezole (5 mg/mL) 4.9 mL와 멸 균 식 염 수 물.</li>
	</ol>
</li>
	<li>적절 한 소독과 멸 균으로 무 균 수술 환경을 준비 합니다. 압력솥 사용 하기 전에 수술 악기입니다.</li>
</ol>2. 바이러스-배달 Murine 전립선에
<ol><li>살 균 1 mL 주사기와 바늘 27G x ½"복 주사 동물을 anesthetize. 0.01 mL/g 몸 무게의 마 취 복용량을 사용 합니다. 절차는 30 분 이상 지속, 유지 마 취 주입 하 여 1/3는 시작 복용량은 매 30 분.</li>
	<li>근육 이완, 페달 철수, 및 종을 반사를 평가 하 여 마 취 깊이 검사 합니다. 반사의 손실, 관찰 하는 경우는 동물의 아랫 면도.</li>
	<li>조심 스럽게 멸 균 면봉을 사용 하 여 각 막 반사의 부족으로 인해 실명을 방지 하기 위해 수의 안과 연 고와 동물의 눈을 커버.</li>
	<li>70% 에탄올과 10 %povidone 요오드 소독 외과 영역을 면도 복 부를 닦아. 주변으로 외과 영역의 중앙에서 외과 영역을 문질러.</li>
	<li>무 균 수술가 위를 사용 하 여 약 1 ㎝의 낮은 복 부 중간에 수직 피부 절 개를 수행 합니다.</li>
	<li>리프트 아래 누워 장기 손상을 방지 하기 위해 좋은 포인트 집게를 사용 하 여 복 막. 신중 하 게 < 8 m m 절 개 통해 복 막 수술가 위를 사용 하 여 확인 합니다. 참고: 인간, 달리 쥐의 전립선 4 개의 별도 돌출부를 구성. 앞쪽 엽 정액 소포에 첨부 됩니다.</li>
	<li>부드럽게 정액 소포를 밝히기 지방 조직 옆으로 이동 합니다. 조심 스럽게 들어올려 링 집게를 사용 하 여 앞쪽 전립선 될 때까지 정액 소포 식별 (그림 1).</li>
	<li>30G x 8 m m 바늘으로 0.5 mL 인슐린 주사기를 사용 하 여 앞쪽 전립선 상피에서 30 µ L 바이러스 (3 x 1010 바이러스 성 입자) 솔루션의 전체 볼륨을 주입. 누설을 최소화 하 고 액체는 작은 거품을 형성 하는 조직 내에서 흡수 합니다. 복 부 구멍에 다시 정액 소포를 놓습니다.</li>
	<li>2-3 13 m m, 3/8 원와 테이퍼 포인트 바늘 6-0 흡수 봉합을 사용 하 여 간단한 중단된 바늘으로 복을 봉합.</li>
	<li>3 살 균 4.8 x 6.5 m m 클립 복 막의 손상을 방지 하려면 집게와 함께 피부 리프팅 피부를 주식.</li>
	<li>더 나은 복구에 대 한 살 균 1 mL 주사기와 바늘 27G x ½ "를 사용 하 여 복 주입 하 여 0.01 mL/g 몸 무게의 복용량에서 마 취 해독 제를 적용 합니다. 신중 하 게 그것의 감 금에 있는 동물 뒤 장소.</li>
</ol>3. 수술 후 절차
<ol><li>1 시간에 대 한 난방 패드에 완전히 복구 될 때까지 저체온증을 방지 하기 위해 수술 후 수술 마우스 케이지를 유지. 해독 제를 적용 하는 경우 동물 이어야 한다 깨어 주사 후 몇 분입니다.</li>
	<li>매일 적절 한 상처 치유와 통증 표시에 대 한 동물을 모니터링 합니다. 필요한 경우, 기관 동물 관리 지침에 따라 추가 진통제를 관리 합니다.</li>
	<li>4-5 일 후, 상처를 닫으면 피부 클립을 제거 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+incidence+and+mortality+worldwide:+sources,+methods+and+major+patterns+in+GLOBOCAN+2012.">Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012.</a> Int J Cancer. 136, E359-E386 (2015).</li><li>Gerlinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing.">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N Engl J Med. 366, 883-892 (2012).</li><li>Robinson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+Clinical+Genomics+of+Advanced+Prostate+Cancer.">Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer.</a> Cell. 162, 454 (2015).</li><li>Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+transgenesis:+an+overview.">Animal transgenesis: an overview.</a> Brain Struct Funct. 214, 91-109 (2010).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+prostate+epithelial+cell-specific+Cre+transgenic+mouse+model+for+tissue-specific+gene+ablation.">Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation.</a> Mech Dev. 101, 61-69 (2001).</li><li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+biallelic+inactivation+of+Pten+in+the+mouse+prostate+leads+to+prostate+cancer+accompanied+by+increased+epithelial+cell+proliferation+but+not+by+reduced+apoptosis.">Targeted biallelic inactivation of Pten in the mouse prostate leads to prostate cancer accompanied by increased epithelial cell proliferation but not by reduced apoptosis.</a> Cancer Res. 65, 5730-5739 (2005).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+p53-dependent+cellular+senescence+in+suppression+of+Pten-deficient+tumorigenesis.">Crucial role of p53-dependent cellular senescence in suppression of Pten-deficient tumorigenesis.</a> Nature. 436, 725-730 (2005).</li><li>Leow, C. C., Wang, X. D., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+of+generating+prostate-specific+Cre-LoxP+gene+switching+via+intraductal+delivery+of+adenovirus.">Novel method of generating prostate-specific Cre-LoxP gene switching via intraductal delivery of adenovirus.</a> Prostate. 65, 1-9 (2005).</li><li>Thomsen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+JUNB/AP-1+promotes+invasive+prostate+cancer.">Loss of JUNB/AP-1 promotes invasive prostate cancer.</a> Cell Death Differ. 22, 574-582 (2015).</li><li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+novel+GEM+model+for+metastatic+prostate+cancer+analysis+and+therapy,+reveals+myc+as+a+driver+of+Pten-mutant+metastasis.">a novel GEM model for metastatic prostate cancer analysis and therapy, reveals myc as a driver of Pten-mutant metastasis.</a> Cancer Discov. 4, 318-333 (2014).</li><li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+in+vivo+validation+of+candidate+drivers+derived+from+the+PTEN-mutant+prostate+metastasis+genome.">Rapid in vivo validation of candidate drivers derived from the PTEN-mutant prostate metastasis genome.</a> Methods. 77-78, 197-204 (2015).</li><li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling.">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159, 440-455 (2014).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate-specific+deletion+of+the+murine+Pten+tumor+suppressor+gene+leads+to+metastatic+prostate+cancer.">Prostate-specific deletion of the murine Pten tumor suppressor gene leads to metastatic prostate cancer.</a> Cancer Cell. 4, 209-221 (2003).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+analysis+indicates+monoclonal+origin+of+lethal+metastatic+prostate+cancer.">Copy number analysis indicates monoclonal origin of lethal metastatic prostate cancer.</a> Nat Med. 15, 559-565 (2009).</li><li>Haffner, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+clonal+origin+of+lethal+prostate+cancer.">Tracking the clonal origin of lethal prostate cancer.</a> J Clin Invest. 123, 4918-4922 (2013).</li><li>Daya, S., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+using+adeno-associated+virus+vectors.">Gene therapy using adeno-associated virus vectors.</a> Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).</li><li>Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Aspects+of+Development+and+Structure+in+the+Prostate.">Comparative Aspects of Development and Structure in the Prostate.</a> Natl Cancer Inst Monogr. 12, 1-27 (1963).</li><li>McNeal, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+prostate:+an+historical+survey+of+divergent+views.">Anatomy of the prostate: an historical survey of divergent views.</a> Prostate. 1, 3-13 (1980).</li><li>Thomsen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX9+elevation+in+the+prostate+promotes+proliferation+and+cooperates+with+PTEN+loss+to+drive+tumor+formation.">SOX9 elevation in the prostate promotes proliferation and cooperates with PTEN loss to drive tumor formation.</a> Cancer Res. 70, 979-987 (2010).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜에서 바이러스 주입에 의해 murine 전립선의 앞쪽 엽에 유전자 발현을 변경 하는 방법에 설명 하 고 전립선 암 (그림 2)에 대 한 강력한 새로운 마우스 모델을 만드는 우리. 아 데 노 바이러스의 성공적인 관리 Leow 그 외 여러분 20058에 의해 처음으로 설명. 우리는 이전 어떻게 Cre recombinase 단백질에 대 한 코딩 하는 아 데 노비 루스 조직 관련 ?...

검색 및 전립선 암 치료는 지난 10 년간 크게 개선 됩니다. 아직도, 전립선 암 발생률은 증가, 수명에 따라. 약 1.1 백만 새로운 경우 전세계, 그것 남자 1에 암 관련 된 죽음의 일반적인 원인 중 하나입니다. 전립선 암은 그 개발에서 속도가 느린 하지만 암 고급 전이성 상태로 진행, 예 후 불량-제한 된 치료 옵션. 지금까지 몇 가지 유전자만이 암에 일반적인 드라이버 확인 되었습니다 그리고 그것의 및 multifocality 방해 biomarkers 및 대상 질병 드라이버2,3의 탐지.
클래식 기법의 생성 GEMMs는 종종 그들의 복잡성, 적시 비용, 및 비용에 의해 손상 됩니다. 조건부 녹아웃 모델 배아 치 생식4에서 비활성화 하는 경우에 발생 하는 전립선 암 후보 유전자 연구에 널리 사용 되어 왔습니다. 가장 일반적인 모델 수정된 Probasin5 중 하나에 의해 구동 전립선 특정 Cre recombinase 또는 PSA6 발기인 추가 교차 사육으로는 GEMM에 통합을 포함 한다. 이 모델에서 대부분 전립선 상피 세포의 증식을 생성 하는 동물의 요로 기능7저하 될 수 있습니다 전체 기관에 관심사의 유전자를 대상 것입니다.
Murine 전립선의 앞쪽 엽에 주입 하 여 Cre 단백질의 바이러스 배달만 몇 셀8을 대상으로 하 여이 문제를 해결할 수 있습니다. 고려 실험실 기술 필수 구성 요소, 전문성, 그리고 목표, 방법 혜택 가능한 변이의 광범위 한 범위에서. 아 데 노비 루스 JunB 와 Pten9 또는 Lentivirus Pten 및 Trp5310 타겟팅 타겟팅을 활용 하 여 성공적인 접근 다른 표시 되었습니다. 바이러스 성 구조 나는 GEMM transgenes luciferase, 등을 추가 또한 생물 발광 영상11통해 질병 진행의 비-침략 적 모니터링 활성화 됩니다.
게놈 편집 CRISPR/Cas9 기술을 기반으로 새롭고 빠른 기회를 체세포 녹아웃12의 빠른 생성을 통해 암 연구를 보여준다. 단일 가이드 RNAs (sgRNAs)의 바이러스 배달 murine 전립선의 앞쪽 엽 감독 전립선 암의 순수 더 관련 모델을 설정 합니다. 이 방법으로 단일 셀 선택한 돌연변이 나르는 확장 및 침략 수 있는 클론을 형성할 수 있다. 또한, 여러 대상 유전자에 대 한 가이드 RNAs의 사용 다른 유전자에 변경 셀 클론을 생성 합니다. 이 각 유전자 변경 또는 epistatic 메커니즘의 중요성을 계시 할 수 있다 암 진행에 종양이 고 자연 선택의 압력을 허용할 것 이다.
여기 우리는 유전자 발현의 변경 murine 전립선에 바이러스 성 입자를 전달 하는 방법을 제시. 작은 복 부 절 개 하 여 murine 앞쪽 전립선 엽 노출 하 고 바이러스 성 입자는 엽에 주입 됩니다. 5 일 수술 후, 수술 클립은 피부에서 제거 될 수 있습니다 그리고 전립선 암은 8 주 후에서 분석 될 수 있다. 전반적으로, 이것은 마우스를 타협 하지 않고 개발에 더 큰 종양 하는 마우스에 작은 영향을 신속 하 고 비용 효율적인 절차.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>26175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,5 ml U-100 insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>324825</td>
			<td>for virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>300013</td>
			<td>for anesthesia injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G 1/2&#39;&#39; needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>304000</td>
			<td>for anesthesia injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Polysorb Suture</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>GL889</td>
			<td>to close the peritoneum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable sterilized surgery drape</td>
			<td>multiple suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>multiple suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-Iodine Prep Pad</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-669-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimming machine</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>GT415</td>
			<td>to shave the abdomen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey Micro Needle Holder</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12500-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow Pattern Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11106-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound Clip System Handle incl. Clips</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12030-01</td>
			<td>to close the skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound Clip System Remover</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12030-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>different models have been used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antisedan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>obtained from the animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butorphanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>obtained from the animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidinhydrochlorid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>obtained from the animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>obtained from the animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-032-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td>Takeda</td>
			<td>7242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virus (AAV, AV)</td>
			<td>multiple suppliers</td>
			<td></td>
			<td>virus used in this protocol is an in-house production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAKT antibody</td>
			<td>CST</td>
			<td>4060</td>
			<td>used 1:200 dillution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP anitbody</td>
			<td>CST</td>
			<td>2956</td>
			<td>used 1:100 dillution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

virus delivery of crispr guides to the murine prostate for gene alteration

전립선 암의 증가 발생, 새로운 종양 드라이버 또는 변조기의 식별은 결정적 이다. 전립선 암에 대 한 유전자 조작된 마우스 모델 (GEMM) 종양이 성분 및 그것의 복잡 한 microevolution 역학에 의해 방해 된다. 전통적인 전립선 암 마우스 모델을 포함, 다른 사람, 사이 생식 및 조건부 녹아웃, oncogenes, 및이 종이 식 모델의 유전자 변형 식. 이러한 모델에 de novo 돌연변이의 발생은, 시간이 걸리는, 복잡 하 고 비용이 많이 드는. 또한, 전통적인 모델의 대부분 인간의 전립선 암 세포의 작은 하위 집합만 있는 고립 된 이벤트로 진화 하는 잘 알려진 반면 전립선 상피의 대다수를 대상. 귀중 한 모델 전립선 암 개시 뿐만 아니라 고급 질병 진행을 시뮬레이션 해야 합니다.
여기는 바이러스 입자에 의해 전립선 상피 세포를 시험 하 여 몇 가지 셀을 대상 하는 방법에 설명 합니다. Murine 전립선에는 설계 된 바이러스의 배달 전립선 epithelia에 유전자 발현의 변경 수 있습니다. 바이러스 유형 및 수량 이로써 암 개시에 대 한 몇 가지 세포 및 유전자 치료에 대 한 많은 셀 시험에 의해 유전자 변경 대상된 셀 수를 정의 합니다. 앞쪽 엽, 비뇨 기 추적에서 원심에서 수술 기반 주사를 통해이 모델에서 종양 동물의 오 줌 기능을 방해 하지 않고 확장할 수 있습니다. 또한, 전립선 상피 세포의 하위 집합만 대상으로 기술, 종양의 클론 확장을 가능 하 게 하 고 따라서 인간의 종양 개시, 진행, 뿐만 아니라 기저 막 통해 침공을 싫어 하지.
이 새로운 기술은 향상 된 생리 적인 관련성 강력한 전립선 암 모델을 제공합니다. 동물의 고통을 제한, 되며 아무 추가 사육 필수 이기 때문에, 전체 동물 수를 줄일 수 있다. 동시에 새로운 후보 유전자 및 통로의 분석 가속, 차례 차례로 더 비용 효율적입니다.

평가 murine 전립선에 바이러스 배달, 샘플 수술 후 3 개월을 분석 했다. Rosa26-LSL-Cas9-EGFP 쥐12 셀 Cre 단백질은 바이러스에 의해 표현에 노출에 GFP를 표현 한다. 전립선 샘플 GFP 신호 (그림 2A) 영역을 식별 하는 형광 현미경 검사 법으로 시험 되었다. GFP 신호 전립선 상피만 하지 여부 유전자 편집 유도 하고있다 CRISPR 가이드 Cre 활동을 나?...

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Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

이 프로토콜 murine 전립선에 바이러스 배달 하는 새로 설립된 방법을 설명합니다. CRISPR/Cas9 기술, 유전자 overexpression 또는 Cre recombinase 배달 사용 하 여, 기술 유전자 발현의 orthotopic 변경 허용 하 고 전립선 암에 대 한 새로운 마우스 모델을 구현.

CRISPR의 바이러스 배달 Murine 전립선 유전자 변경에 대 한 가이드

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

virus-delivery-crispr-guides-to-murine-prostate-for-gene

Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.6K 조회수.  Aarhus University. 이 프로토콜 murine 전립선에 바이러스 배달 하는 새로 설립된 방법을 설명합니다. CRISPR/Cas9 기술, 유전자 overexpression 또는 Cre recombinase 배달 사용 하 여, 기술 유전자 발현의 orthotopic 변경 허용 하 고 전립선 암에 대 한 새로운 마우스 모델을 구현.

비디오: Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. Here we describe a method using targeted peripheral irradiation to induce fatigue-like behavior in mice. With appropriate shielding, the irradiation targets the lower abdominal/pelvic region of the mouse, sparing the brain, in an effort to model radiation treatment received by individuals with pelvic cancers. We deliver an irradiation dose that is sufficient to induce fatigue-like behavior in mice, measured by voluntary wheel-running activity (VWRA), without causing obvious morbidity. Since wheel running is a normal, voluntary behavior in mice, its use should have little confounding effect on other behavioral tests or biological measures. Hence, wheel running can be used as a feasible outcome measure in understanding the behavioral and biological correlates of fatigue. CRF is a complex condition with frequent comorbidities, and likely has causes related both to cancer and its various treatments. The methods described in this paper are useful for investigating radiation-induced changes that contribute to the development of CRF and, more generally, to explore the biological networks that can explain the development and persistence of a peripherally-triggered but centrally-driven behavior like fatigue.

We describe a method using targeted peripheral irradiation to induce fatigue-like behavior in mice. The selected non-lethal irradiation dose leads to a week-long reduction in voluntary wheel-running activity.

주변 방사선 조사에 의해 유도 된 피로의 마우스 모델

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

연구

암 연구학

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Metastatic cancer accounts for 90% of deaths in patients with solid tumors. There is an urgent need to better understand the drivers of cancer metastasis and to identify novel therapeutic targets. To investigate molecular events that drive the progression from primary cancer to metastasis, we have developed a bitransgenic mouse model, RIP-Tag; RIP-tva. In this mouse model, the rat insulin promoter (RIP) drives the expression of the SV40 T antigen (Tag) and the receptor for subgroup A avian leukosis virus (tva) in pancreatic &#946; cells. The mice develop pancreatic neuroendocrine tumors with 100% penetrance through well-defined stages that are similar to human tumorigenesis, with stages including hyperplasia, angiogenesis, adenoma, and invasive carcinoma. Because RIP-Tag; RIP-tva mice do not develop metastatic disease, genetic alterations that promote metastasis can be identified easily. Somatic gene transfer into tva-expressing, proliferating pancreatic &#946; premalignant lesions is achieved through intracardiac injection of avian retroviruses harboring the desired genetic alteration. A titer of &#62;1 x 108 infectious units per ml is considered appropriate for in vivo infection. In addition, avian retroviruses can infect cell lines derived from tumors in RIP-Tag; RIP-tva mice with high efficiency. The cell lines can also be used to characterize the metastatic factors. Here we demonstrate how to utilize this mouse model and cell lines to assess the functions of candidate genes in tumor metastasis.

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

We present a protocol to demonstrate a novel somatic gene transfer system utilizing RIP-Tag; RIP-tva mouse model to study the function of genes in metastasis. The avian retroviruses are delivered intracardiacally to ensure gene transfer into pre-malignant, noninvasive lesions of pancreatic &#946; cells in adult mice.

식별 및 태그-소설 RIP;으로 유전자 이동에 의해 전이성 요인의 특성 RIP-tva Murine 모델

Metastatic cancer accounts for 90% of deaths in patients with solid tumors. There is an urgent need to better understand the drivers of cancer metastasis ...

Generation of Prostate Cancer Cell Models of Resistance to the Anti-mitotic Agent Docetaxel

Microtubule targeting agents (MTAs) are a mainstay in the treatment of a wide range of tumors. However, acquired resistance to chemotherapeutic drugs is a common mechanism of disease progression and a prognostic-determinant feature of malignant tumors. In prostate cancer (PC), resistance to MTAs such as the taxane Docetaxel dictates treatment failure as well as progression towards lethal stages of disease that are defined by a poor prognosis and high mortality rates. Though studied for decades, the array of mechanisms contributing to acquired resistance are not completely understood, and thus pose a significant limitation to the development of new therapeutic strategies that could benefit patients in these advanced stages of disease. In this protocol, we describe the generation of Docetaxel-resistant prostate cancer cell lines that mimic lethal features of late-stage prostate cancer, and therefore can be used to study the mechanisms by which acquired chemoresistance arises. Despite potential limitations intrinsic to a cell based model, such as the loss of resistance properties over time, the Docetaxel-resistant cell lines produced by this method have been successfully used in recent studies and offer&#160;the opportunity to advance our molecular understanding of acquired chemoresistance in lethal prostate cancer.

Resistance to cancer therapies contributes to disease progression and death. Determining the mechanistic underpinnings of resistance is crucial for improving therapeutic response. This manuscript details the protocol to generate taxane-resistant cell models of prostate cancer (PC) to help dissecting the pathways involved in progression to Docetaxel resistance in PC patients.

반대로 mitotic 에이전트 Docetaxel에 전립선 암 세포 모델의 생성

Microtubule targeting agents (MTAs) are a mainstay in the treatment of a wide range of tumors. However, acquired resistance to chemotherapeutic drugs is a ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to generate RNA-guided nucleases, such as CRISPR-associated (Cas) 9 for site-specific eukaryotic genome editing. Genome engineering by Cas9 is used to efficiently, easily and robustly modify endogenous genes in many biomedically-relevant mammalian cell lines and organisms. Here we show an example of how to utilize the CRISPR/Cas9 methodology to understand the biological function of specific genetic mutations. We model calreticulin (CALR) mutations in murine interleukin-3 (mIL-3) dependent pro-B (Ba/F3) cells by delivery of single guide RNAs (sgRNAs) targeting the endogenous Calr locus in the specific region where insertion and/or deletion (indel) CALR mutations occur in patients with myeloproliferative neoplasms (MPN), a type of blood cancer. The sgRNAs create double strand breaks (DSBs) in the targeted region that are repaired by non-homologous end joining (NHEJ) to give indels of various sizes. We then employ the standard Ba/F3 cellular transformation assay to understand the effect of physiological level expression of Calr mutations on hematopoietic cellular transformation. This approach can be applied to other genes to study their biological function in various mammalian cell lines.

Targeted gene editing using CRISPR/Cas9 has greatly facilitated the understanding of the biological functions of genes. Here, we utilize the CRISPR/Cas9 methodology to model calreticulin mutations in cytokine-dependent hematopoietic cells in order to study their oncogenic activity.

CRISPR/Cas9를 사용 하 여 유전자 돌연변이 Calreticulin Cytokine 종속 조 혈 모 세포에서의 종양 활동을 조사 하기 위해 편집

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce decellularized tongue extracellular matrix (TEM) which provides functional scaffolds for TSCC construction. TEM provides an in vitro niche for cell growth, differentiation, and cell migration. The microstructures of native extracellular matrix (ECM) and biochemical compositions retained in the decellularized matrix provide tissue-specific niches for anchoring cells. The fabrication of TEM can be realized by deoxyribonuclease (DNase) digestion accompanied with a serious of organic or inorganic pretreatment. This protocol is easy to operate and ensures high efficiency for the decellularization. The TEM showed favorable cytocompatibility for TSCC cells under static or stirred culture conditions, which enables the construction of the TSCC model. A self-made bioreactor was also used for the persistent stirred condition for cell culture. Reconstructed TSCC using TEM showed the characteristics and properties resembling clinical TSCC histopathology, suggesting the potential in TSCC research.

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

A method is shown here for the preparation of the tongue extracellular matrix (TEM) with efficient decellularization. The TEM can be used as functional scaffolds for the reconstruction of a tongue squamous cell carcinoma (TSCC) model under static or stirred culture conditions.

혀 기질과 혀 편평 세포 암 종에서 생체 외에서 의 재구성의 제조

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and transgenic genetically engineered mouse models. Unlike subcutaneous tumors, orthotopic tumors contain more clinically accurate vasculature, tumor microenvironment, and responses to multiple therapies. In contrast to genetically engineered mouse models, orthotopic models can be performed with lower cost and in less time, involve the use of highly complex and heterogeneous mouse or human cancer cell lines, rather that single genetic alterations, and these cell lines can be genetically modified, such as to express imaging agents. Here, we present a protocol to surgically injecting a luciferase- and mCherry-expressing murine prostate cancer cell line into the anterior prostate lobe of mice. These mice developed orthotopic tumors that were non-invasively monitored in vivo and further analyzed for tumor volume, weight, mouse survival, and immune infiltration. Further, orthotopic tumor-bearing mice were surgically castrated, leading to immediate tumor regression and subsequent recurrence, representing castration-resistant prostate cancer. Although technical skill is required to carry out this procedure, this syngeneic orthotopic model of both androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer is of great use to all investigators in the field.

The goal of this protocol is to demonstrate the intra-prostatic injection of prostate cancer cells, with subsequent castration. Orthotopic pre-clinical models of androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer are critical to study the disease in the context of a clinically relevant tumor microenvironment and an immunocompetent host.

발광 및 형광 Orthotopic Syngeneic Murine 모델 Androgen 종속 및 거세 내성 전립선 암

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction pathways and is tightly regulated by kinases and phosphatases. Therefore, characterizing the phosphoproteome may provide insights into identifying novel targets and biomarkers for oncologic therapy. Mass spectrometry provides a way to globally detect and quantify thousands of unique phosphorylation events. However, phosphopeptides are much less abundant than non-phosphopeptides, making biochemical analysis more challenging. To overcome this limitation, methods to enrich phosphopeptides prior to the mass spectrometry analysis are required. We describe a procedure to extract and digest proteins from tissue to yield peptides, followed by an enrichment for phosphotyrosine (pY) and phosphoserine/threonine (pST) peptides using an antibody-based and/or titanium dioxide (TiO2)-based enrichment method. After the sample preparation and mass spectrometry, we subsequently identify and quantify phosphopeptides using liquid chromatography-mass spectrometry and analysis software.

This protocol describes a procedure to extract and enrich phosphopeptides from prostate cancer cell lines or tissues for an analysis of the phosphoproteome via mass spectrometry-based proteomics.

전립선 암에 있는 Phosphoproteome를 조사 하기 위해 양적 라벨 무료 질량 분석으로 결합 된 Phosphopeptide 농축

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, and intrinsic capability in intercellular delivery of various biomolecules. This work establishes an isolation protocol to achieve high yield and high purity of exosomes for siRNA delivery. Human Embryonic Kidney cells (HEK-293 cells) are cultured in bioreactor flasks and the culture supernatant (hereon referred to as conditioned medium) is harvested on a weekly basis to allow for enrichment of HEK-293 exosomes. The conditioned medium (CM) is pre-cleared of dead cells and cellular debris by differential centrifugation and is subjected to ultracentrifugation onto a sucrose cushion followed by a washing step, to collect the exosomes. Isolated HEK-293 exosomes are characterized for yield, morphology and exosomal marker expression by nanoparticle tracking analysis, protein quantification, electron microscopy and flow cytometry, respectively. Small interfering RNA (siRNA), fluorescently labeled with Atto655, is loaded into exosomes by electroporation and excess siRNA is removed by gel filtration. Cell uptake in PANC-1 cancer cells, after 24 h incubation at 37 &#176;C, is confirmed by flow cytometry. HEK-293 exosomes are 107.0 &#177; 8.2 nm in diameter. The exosome yield and particle-to-protein ratio (P:P) ratio are 6.99 &#177; 0.22 &#215; 1012 particle/mL and 8.3 &#177; 1.7 &#215; 1010 particle/&#181;g, respectively. The encapsulation efficiency of siRNA in exosomes is ~ 10-20%. Forty percent of the cells show positive signals for Atto655 at 24 h post-incubation. In conclusion, exosome isolation by ultracentrifugation onto sucrose cushion offers a combination of good yield and purity. siRNA could be successfully loaded into exosomes by electroporation and subsequently delivered into cancer cells in vitro. This protocol offers a standard procedure for developing siRNA-loaded exosomes for efficient delivery to cancer cells.

An exosome is a new generation of drug delivery carriers. We established an exosome isolation protocol with high yield and purity for siRNA delivery. We also encapsulated fluorescently labelled non-specific siRNA into exosomes and investigated the cellular uptake of siRNA-loaded exosomes in cancer cells.

SiRNA 암 세포에 배달에 대 한 Exosomes의 준비

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with diagnostic or prognostic difficulties. OS comprises genotypically and phenotypically heterogeneous cancer cells. Bone microenvironment elements are proved to account for tumor heterogeneity and disease progression. Bone extracellular matrix (BEM) retains the microstructural matrices and biochemical components of native extracellular matrix. This tissue-specific niche provides a favorable and long-term scaffold for OS cell seeding and proliferation. This article provides a protocol for the preparation of BEM model and its further experimental application. OS cells can grow and differentiate into multiple phenotypes consistent with the histopathological complexity of OS clinical specimens. The model also allows visualization of diverse morphologies and their association with genetic alterations and underlying regulatory mechanisms. As homologous to human OS, this BEM-OS model can be developed and applied to the pathology and clinical research of OS.

The bone extracellular matrix (BEM) model for osteosarcoma (OS) is well established and shown here. It can be used as a suitable scaffold for mimicking primary tumor growth in vitro and providing an ideal model for studying the histologic and cytogenic heterogeneity of OS.

다리에 대 한 3 차원 뼈 세포 외 매트릭스 모델

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation capacity of mouse prostate basal and luminal cells during development, tissue-regeneration and transformation. However, evaluating cell-intrinsic and extrinsic regulators of prostate epithelial differentiation capacity using a lineage tracing approach often requires extensive breeding and can be cost-prohibitive. In the prostate organoid assay, basal and luminal cells generate prostatic epithelium ex vivo. Importantly, primary epithelial cells can be isolated from mice of any genetic background or mice treated with any number of small molecules prior to, or after, plating into three-dimensional (3D) culture. Sufficient material for evaluation of differentiation capacity is generated after 7-10 days. Collection of basal-derived and luminal-derived organoids for (1) protein analysis by Western blot and (2) immunohistochemical analysis of intact organoids by whole-mount confocal microscopy enables researchers to evaluate the ex vivo differentiation capacity of prostate epithelial cells. When used in combination, these two approaches provide complementary information about the differentiation capacity of prostate basal and luminal cells in response to genetic or pharmacological manipulation.

Mouse prostate organoids represent a promising context to evaluate mechanisms that regulate differentiation. This paper describes an improved approach to establish prostate organoids, and introduces methods to (1) collect protein lysate from organoids, and (2) fix and stain organoids for whole-mount confocal microscopy.

유기체 배양을 사용하여 마우스 전립선 상피 세포의 분화 능력 평가

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...