3D 오르가노이드 시스템은 2D assays보다 생리적으로 더 관련이 있는 것으로 간주되며, 그렇지 않으면 취득하기가 어려울 생물학에 대한 귀중한 정보를 제공할 수 있습니다. 이것은 우리가 생체 내 접근을 사용하는 것보다 더 적은 시간과 상당히 낮은 비용으로 약리학 및 유전 조작을 시험할 수 있는 적응형 시스템입니다. 매트릭스 평가판은 실온에 도달하면 고체화되기 때문에 처리하기가 매우 까다롭습니다.
그것은 액체일 때만 파이펫을 통해 그릴 수 있으며 얼음 위에 유지해야합니다. 링의 무결성을 유지하는 것이 중요합니다. 구조가 중단되면 오르가노이드 성장에 부정적인 영향을 미칠 수 있으며 미디어를 변경할 때 재료를 쉽게 잃을 수 있습니다.
텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 마우스 기저 및 발광 전립선 상피 세포의 준비와 함께이 절차를 시작합니다. 마우스 오르가노이드 미디어의 500 마이크로리터에서 세포 펠릿을 세척한 다음 마이크로리터 당 1, 000 세포의 세포 밀도로 펠릿을 다시 중단합니다. 마스터 믹스를 준비하려면 마우스 오르가노이드 미디어에 매달려 있는 상피 세포를 매트릭스 젤과 혼합하여 25%의 세포와 75%의 매트릭스 젤을 포함하는 최종 혼합물을 생성합니다.
다운스트림 적용에 따라, 기저 세포는 전형적으로 80 마이크로리터 당 100 에서 2, 000 세포의 농도로 도금되는 반면, 발광 세포는 80 마이크로리터 당 2, 000 에서 10, 000 세포의 농도로 도금됩니다. 각 세포 혼합물에 대해, 24웰 플레이트의 웰 당 매트릭스 젤의 80 마이크로리터를 추가합니다. 파이펫은 폴리 헤마 코팅과의 직접적인 접촉을 피하면서 우물 벽의 하반부에 액적.
매트릭스 젤을 추가한 후, 매트릭스 젤 세포 혼합물이 우물의 테두리 주위에 링을 형성할 수 있도록 플레이트를 소용돌이시다. 24웰 플레이트를 섭씨 37도, 5%C02 인큐베이터 오른쪽에 10분 동안 올려 매트릭스 젤이 부분적으로 경화되도록 합니다. 10분 동안 배양한 후 24웰 플레이트를 거꾸로 뒤집어 50분 간 추가로 배양하여 매트릭스 젤이 완전히 굳어지게 합니다.
그런 다음, 미리 따뜻워진 마우스 오르가노이드 미디어 드롭 와이즈의 350 마이크로리터를 각 웰의 중앙에 첨가합니다. 미디어를 추가한 후 24웰 플레이트를 인큐베이터에 반환합니다. 마우스 오르가노이드 매체를 보충하려면 24웰 플레이트를 45도 각도로 기울이고 매트릭스 젤 링을 피하면서 P1000 파이펫을 사용하여 각 웰의 중심에서 기존 미디어를 부드럽게 제거합니다.
이전과 같이 미리 따뜻해지는 마우스 오르가노이드 미디어 350 마이크로리터를 추가합니다. 주요 영양소와 성장 인자의 급속한 고갈을 방지하기 위해 5 일 이상 배양 된 오르가노이드에 더 많은 양의 미디어를 추가하는 것이 좋습니다. 이전과 마찬가지로 각 미디어에서 미디어를 제거합니다.
오르가노이드를 수집하려면, 전체 링이 빠질 때까지 미리 따뜻워진 디스파스 함유 매체의 1밀리리터를 매트릭스 젤 링에 직접 피펫팅하여 매트릭스 젤을 반복적으로 폭발시다. 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 빠진 매트릭스 젤 오르가노이드 혼합물을 전달한다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 완전한 소화에 따라 오르가노이드 펠릿에 인산염 완충식식염을 추가하고 부드럽게 플릭하여 다시 중단합니다.
실온에서 5분 동안 800회 G에서 원심분리로 오르가노이드를 펠렛하고 마이크로 파이펫을 사용하여 상퍼를 제거합니다. 포장 된 세포 부피의 10 마이크로 리터 당 단백질 용해 버퍼의 100 마이크로 리터에서 오르가노이드 펠릿을 다시 중단합니다. 다시 일시 중단하는 플릭.
이제 젖은 얼음에 튜브를 잠그고 소닉 비엠블레이터의 끝을 마이크로 원심분리기 튜브 의 바깥쪽에 부드럽게 적용하여 오르가노이드를 초음파 처리합니다. 20킬로헤르츠에서 40초 동안 초음파 처리한 후 확립된 프로토콜로 서부 블로팅으로 진행합니다. 24웰 플레이트에서 전립선 오르가노이드를 수집하려면 전과 마찬가지로 각 에서 미디어를 제거하십시오.
37도, 5%CO2 인큐베이터에서 30분 동안 디스파스 함유 매체 500 마이크로리터를 배양하여 매트릭스 젤을 소화합니다. 마이크로 원심 분리기 튜브에서 소화된 오르가노이드 서스펜션을 수집합니다. 이어서, 실온에서 3분 동안 800회 G에서 원심분리에 의한 오르가노이드를 펠릿하고, 상류체를 제거한다.
전립선 오르가노이드의 전체 마운트 면역 형광 염색을 수행하려면 먼저 PBS에 4 % 파라 포름알데히드의 500 마이크로 리터를 추가하십시오. 부드러운 흔들림으로 실온에서 2 시간 동안 오르가노이드를 배양하십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 펠릿을 세척한 후 차단 용액에 DAPI 얼룩의 밀리리터당 1마이크로그램을 추가하고 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
이 단계에서 인큐베이션 중에 빛으로부터 샘플을 보호합니다. 이전과 같이 오르가노이드의 원심 분리에 따라, 차단 용액에 1 차 항체를 추가하고 부드러운 흔들림과 섭씨 4도에서 하룻밤 을 배양. 오르가노이드를 다시 펠릿으로 만들고, 부드러운 흔들림으로 15분 동안 PBS 1밀리터로 펠릿을 씻습니다.
이 세탁 절차를 두 번 반복하십시오. 그런 다음 차단 용액에 이차 항체를 추가하고 부드러운 흔들림으로 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 인큐베이션에 따라, 골라기를 펠릿, 그리고 추가 두 번 펠릿을 세척.
1%트리톤 X-100을 펠릿 오르가노이드에 1%트리톤 X-100으로 PBS에 30%의 자당 1밀리리터를 넣습니다. 그런 다음 부드러운 흔들림으로 실온에서 2 시간 동안 배양하십시오. 오르가노이드를 다시 펠릿한 후 PBS에 1mm의 45% 자당을 1%트리톤 X-100으로 넣고 실온에서 2시간 동안 부드럽게 흔들어 줍니다.
그런 다음, 1 %트리톤 X-100PBS에서 60 %의 자당 1 밀리리터를 추가하는 것을 제외하고는 절차를 반복하십시오. 실온에서 3분 동안 800회 G에서 원심분리로 오르가노이드를 펠릿하고, 상류체의 95%를 제거합니다. UV 빛 아래의 펠릿을 관찰하여 상퍼를 제거하는 동안 분실되지 않은지 확인합니다.
자당의 농도가 높아짐에 따라 펠릿이 느슨해집니다. 나머지 서스펜션의 10~20마이크로리터를 챔버 커버슬립으로 옮기고 공초점 현미경 검사법을 진행한다. 기저 및 발광 세포는 뚜렷한 형태를 가진 오르가노이드를 형성합니다.
대부분의 기저 유래 오르가노이드는 배양에서 7일 후에 크기가 비슷하지만, 발광 유래 오르가노이드는 상당한 이질성을 나타낸다. 또한, 대부분의 기저 유래 오르가노이드는 다층 상피에 둘러싸인 루멘을 함유하고 있는 반면, 발광 유래 오르가노이드는 단일 층 상피가 있는 중공에서 항중 으로 항성하지 않는 다층 된 세포 로 고체에 이르기까지 형태학에 구역이 있습니다. 서양 얼룩 분석은 기저 및 발광 유래 오르가노이드가 기저 및 발광 1 차 세포와 관련된 특징을 유지한다는 것을 밝혔습니다.
기저 유래 오르가노이드는 기저 마커 사이토케라틴 5의 상부를 표현하는 반면, 발광 유래 오르가노이드는 광막 마커 사이토케라틴 8의 상부를 표현한다. 기저 및 발광 마커 는 대량 인구에서 기저 및 발광 유래 오르가노이드에서 검출되었으며, 아마도 분화의 암시일 수 있습니다. 기저 유래 오르가노이드는 다층 상피를 함유하고 있으며, 외부 층은 기저 마커 p63의 높은 수준을 발현하고, 내층은 검출할 수 없는 수준을 갖는다.
외부 층은 또한 발광 마커 사이토케라틴 8의 적당한 수준을 표현하고, 내부 층은 높은 수준을 가지고 있습니다. 1층 발광 유래 오르가노이드의 모든 세포가 사이토케라틴 8에 대해 긍정적으로 염색되지만, 선택 된 세포만이 핵 p63를 함유했다. 요가노이드 배양으로 세포를 도금하기 전에 경화하지 않도록 매트릭스 젤을 취급할 때주의를 기울여야 합니다.
현미경 검사법에 사용되는 DAPI는 피부 자극을 일으킬 수 있습니다. 자외선도 유해할 수 있습니다. 적절한 개인 보호 장비가 필수적입니다.
우리는 RNA 순서를 수행하기 위해 오르가노이드에서 RNA를 수집 할 수 있으며, 이는 유전자 발현 프로필이 오르가노이드 형성 중 또는 조작에 대한 응답으로 어떻게 변화하는지 에 대해 알려줄 것입니다. 이 모델은 전립선 분야가 상피 생물학의 근본적인 측면을 연구하고 개발 및 차별화에 있는 레귤레이터를 확인하기 위하여 재현가능한 ex vivo 분석이 있는 가능하게 했습니다.
