생물 반응기 플라스크에서 배양된 세포로부터 외성 농축 된 컨디셔닝 배지를 수확하고 자당 쿠션 초원심 분리에 의한 격리는 최소한의 오염 단백질 또는 비 외수성 소포로 높은 수율의 외성 제조를 초래합니다. 중수소 산화물에 제조 된 단일 자당 쿠션을 사용하면 불연속 자당 그라데이션의 힘든 준비를 우회하고 필요한 밀도를 달성하는 데 필요한 자당의 양을 감소시킵니다. 이 프로토콜에서 제조된 엑소좀에서 캡슐화된 siRNA의 효과적인 체외 전달은 췌장암을 위한 차세대 RNA 간섭 기반 치료로서 이 시스템의 잠재력을 강조한다.
시작하려면, 원고에 설명된 바와 같이 정상 배지에서 HEK-293 세포를 배양한다. 세포를 4개의 T75 플라스크로 확장하고 90%의 합류에 도달할 때까지 성장합니다. 생물 반응기 플라스크를 준비하려면, 멤브레인을 적시려면 생물 반응기 플라스크의 중간 저수지에 정상 배지 50~100 밀리리터를 넣습니다.
4개의 T75 플라스크에서 모든 HEK-293 세포를 수집하고 원심분리기 관에서 엑소좀 고갈된 배지의 15밀리리터에서 재보중단한다. 그런 다음 무딘 필 바늘에 연결된 20 밀리리터 주사기를 사용하여 이 세포 현탁액을 생체 반응기 플라스크의 세포 구획에 조심스럽게 추가합니다. 이어서, 생물반응기 플라스크의 중간 저수지를 일반 배지로 최대 500밀리리터로 채우고, 1주일 동안 섭씨 37도, 5%CO2로 배양한다.
인큐베이션 1 주일 후, 그것을 부어 생물 반응기 플라스크의 중간 저수지에서 모든 매체를 제거합니다. 무딘 채우기 바늘에 연결된 20 밀리리터 주사기를 사용하여 셀 컴파트먼트에서 모든 배지를 제거하십시오. 그런 다음, 중간 저수지에 정상 배지의 50~100밀리리터와 무딘 채우기 바늘에 연결된 20밀리리터 주사기를 사용하여 셀 컴파트먼트에 신선한 엑소좀 고갈 된 배지 15 밀리리터를 추가합니다.
그런 다음, 생물 반응기 플라스크의 중간 저수지를 최대 500 밀리리터의 정상 매체로 채웁니다. 섭씨 37도, 또 한 주 동안 5%의 CO2에서 배양합니다. 수집된 조건부 배지를 미리 지우려면 섭씨 4도에서 5분간 500배 g로 원심분리합니다.
상체를 새 튜브로 옮기고 펠릿을 버립니다. 복구 된 상체와 이 원심 분리 단계를 반복 한 후, 다시 상체를 복구하고 펠릿을 폐기. 그런 다음, 15 분 및 섭씨 4도에 대한 2, 000 배 g에서 복구 된 상체를 원심 분리합니다.
상체를 유지하고 펠릿을 버리십시오. 20밀리리터 주사기에 부착된 22마이크로미터 필터를 통해 신선한 원심분리기 튜브에 한 번 상퍼를 걸러냅니다. 한편, 중수소 산화물에서 25% 자당 용액을 준비하기 위해, 보편적 인 튜브에서 자당 1.9 그램의 자당을 정확하게 계량합니다.
그런 다음 무게가 7.6 그램에 도달 할 때까지 중수소 산화물을 추가하십시오. 그런 다음, 22.5 밀리리터의 미리 지워진 조건형 배지로 초원심분리기 튜브를 채웁니다. 튜브에 유리 파이펫을 놓습니다.
파이펫을 통해 3밀리리터의 자당 용액을 추가하여 솔루션이 조건부 배지 아래에 별도의 레이어를 형성합니다. 레이어드 컨디셔닝 된 중간 / 자크로지 용액을 포함하는 튜브를 스윙 아웃 로터의 양동이에 조심스럽게 놓습니다. 버킷을 로터에 고정합니다.
로터를 초원심분리기에 넣고 1.5시간 동안 섭씨 4도에서 100, 000g에서 회전합니다. 튜브에서 자당 층의 두 밀리리터를 수집, P1000 파이펫을 사용하여 한 번에 1 밀리리터, 팁은 10 마이크로 리터 팁에 부착, 세척을위한 여과 된 PBS의 20 밀리리터를 포함하는 초센심 분리병에 추가. 튜브를 고정 각도 로터에 넣고 원심분리기는 섭씨 4도에서 1.5시간 동안 100, 000배g에 원심분리기를 배치합니다.
10 밀리리터 세로지오티피펫을 사용하여 상체를 조심스럽게 제거하십시오. 여과 된 PBS의 400 마이크로 리터로 펠릿을 다시 중단합니다. 전기 포공을 시작하기 전에 30 분 동안 얼음에 전기 기공 큐벳을 미리 식힙니다.
마이크로 센드심분리기 튜브에 33 마이크로그램의 siRNA와 외종의 7마이크로그램을 섞는다. 구연산 버퍼를 추가하여 150 마이크로리터의 부피를 달성합니다. 플라스틱 파이펫을 사용하여 전기 포기큐벳에 엑소솜-siRNA 혼합물을 추가하고 큐벳을 캡.
큐벳을 전자포레이터의 큐벳 홀더에 오른쪽 방향으로 놓고, 전기포레이터의 회전 바퀴를 시계 방향으로 180도 회전시킵니다. 원하는 프로그램을 선택하고 시작 버튼을 눌러 전기포공을 시작합니다. 디스플레이는 성공적인 펄스를 나타냅니다.
그런 다음 휠을 시계 반대 방향으로 180도 돌려 큐벳을 제거합니다. 플라스틱 파이펫을 사용하여 큐벳에서 새로운 미세 원심 분리기 튜브로 샘플을 제거합니다. 즉시 사용하지 않을 경우 추가 처리 전에 튜브를 얼음이나 냉장고에 보관하십시오.
무료 siRNA 제거를 시작하려면, 그것을 평형하기 위해 두 번 크기 배제 크로마토그래피 컬럼을 통해 필터링 된 PBS의 3.5 밀리리터를 전달합니다. 그런 다음, 여과된 PBS의 350 마이크로리터에 150 마이크로리터의 전기폴화 된 샘플을 용해하고 SEC 열로 옮김합니다. 컬럼에서 방출된 첫 번째 500마이크로리터 분수를 마이크로퍼지 튜브로 수집하고 F0으로 표시합니다. 그런 다음 필터링된 PBS 의 500 마이크로리터를 열에 추가합니다.
다음 분획을 수집하고 F1로 표시합니다. PBS를 추가하고 총 10 개의 500 마이크로 리터 분획 또는 최대 F9가 수집 될 때까지 용출 분획을 수집합니다. 마지막으로, 샘플 잔류물을 제거하기 위해, 필터링된 PBS로 컬럼을 적어도 두 번 세척한 다음 원고에 설명된 대로 실험을 계속합니다. 전염 전자 현미경을 이용한 형태학적 분석은 HEK-293 엑소좀이 100나노미터보다 약간 큰 구형 구조였다는 것을 보여주었다.
이 결과는 또한 엑소좀의 크기 분포를 보여 준 나노 입자 추적 분석 측정에서 그것에 동의합니다. 더욱이, 외경 마커 CD81, CD9 및 CD63에 대해 양성반응을 하였다. 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 정제된 엑소좀의 백분율 회수및 siRNA의 백분율 회수는 원고에 설명된 바와 같이 계산하였다.
엑소좀의 정화 후 회수는 siRNA 표준 곡선을 사용하여 75%였으며, 엑소좀에서 siRNA의 캡슐화 효율은 형광 Atto655-siRNA로 로드된 외종의 체외 통풍구의 약 10~20%의 유동 세포질 분석으로 계산되었다-캡슐화된 엑소솜으로 처리된 PANC-1 세포가 형광외신에서 가장 큰 변속을 보였다. 즉, siRNA 캡슐화된 엑소좀으로 처리된 PANC-1 세포가 언로드 된 엑소좀 및 siRNA 혼합물로 처리된 것과 비교하여 Atto655 신호에 대한 인구의 더 높은 비율을 기록했다는 것을 발견함으로써 확인되었습니다. siRNA의 세포 통풍구는 또한 엑소좀-siRNA 혼합물로 처리된 것과 비교하여 siRNA 캡슐화된 엑소좀으로 처리된 PANC-1 세포에서 상당히 높았으며, siRNA 캡슐화된 엑소좀이 PANC-1 세포에 의해 내면화되었고 세포 내 세포내 세포를 효과적으로 전달한다는 것을 확인하였다.
자당 용액을 준비할 때 자당과 중수소 산화물을 매우 정확하게 계량하는 것이 중요하며, 보관 시 밀도 변경을 피하기 위해 항상 갓 준비된 자당 솔루션을 사용하는 것이 중요합니다. 공초점 현미경 검사는 세포로 엑소좀에 캡슐화 된 siRNA의 내재화를 더욱 검증하고 세포 내 인신 매매를 연구하기 위해 수행 될 수있다. 이 프로토콜은 우리가 엑소좀에 의해 전달된 siRNA의 유전자 특정 녹다운을 평가하고 RNA 간섭 기지를 둔 암 치료에 있는 새로운 표적 검증을 위한 공구 역할을 할 수 있습니다.
