JHN는 스위스 국립 재단 (SNSF 310030_146290)에 의해 지원 됩니다.

마우스 사육 되었고 조건 하에서 특정 병원 체 무료 (SPF) 동물 시설에서 의학의 부, 바젤의 대학 (바젤, 스위스)의 유지. 모든 마우스 실험은 스위스 연방 및 Cantonal 규정 (동물 프로토콜 번호 2816 [구획의 바젤-스타트]) 수행 했다.
1입니다. LPS 솔루션의 준비
<ol><li>대장균 살 균 조건 하에서 0111:B4에서 순화 LPS의 주식 열고 5 mg/mL의 농도에 물에 그것을 다시 구성 합니다.</li>
	<li>0.2 µ g / µ L의 작업 집중에 버퍼링 하는 멸 균 인산 염 분 (PBS)와 LPS 재고 희석.</li>
</ol>2. 복 사출 마우스에 LPS의
<ol><li>0.5 mL 주사기에 층 류 기류에 30 G 바늘 솔루션 작업 LPS 발음</li>
	<li>여성 C57Bl/6 마우스의 나이 10 주 (6) 무게와 주입 됩니다 LPS의 양을 계산: 10 µ L (2 µ g) /g 몸 무게. 참고: 예를 들어 마우스 무게 20 g, 다음 20 g x 10 µ L = 200 µ L LPS를 주입 해야 솔루션을 작업.</li>
	<li>부드럽게 하지만 단단히 마우스를 처리 하 고 한 손으로에서 동물을 제 지. 동물 수 일반적으로 호흡을 하지만 하지 트위스트 감 중 설정 인지 확인 합니다.</li>
	<li>마우스 코를 주입에 대 한 복 부를 노출 바닥 쪽으로 약간 기울기. 왼쪽 또는 오른쪽 중간 선에서 낮은 복 부에 복 부와 주입 장소의 중간을 찾습니다. 컨트롤 마우스에 LPS 대신 i.p. PBS를 삽입할.</li>
	<li>자유 재량으로 적절 한 볼륨 (볼륨 단계 2.2에서에서 계산) 주입 작업 솔루션 LPS의. 바늘 입력 했습니다 복 막 구멍으로 그렇지 않으면 복 부 근육 층에 잘못 주사 발생할 수 있는지 확인 합니다. 아직도, 이동 하지 마십시오 너무 깊이 바늘과 그 지역에 있는 내부 장기 부상 방지에 복 막 구멍으로.</li>
	<li>감 금 소 당 최대 5 마우스 케이지를 신중 하 게 동물을 반환 합니다.</li>
</ol>3입니다. 모니터는 쥐
<ol><li>발생과 endotoxemia의 심각도 대 한 8 h에 대 한 주입 후 주입 및 모든 2 h의 시간에 동물을 모니터링 합니다. 따라서, 이전에 게시 원고 24에서 적응 된 점수 시트 (표 1)를 사용 하 여.</li>
	<li>
표 1에 나열 된 다음 매개 변수에 대 한 LPS 주입 된 쥐를 점수
	<ol>
<li>일반적으로 부드러운 모피의 모양을 확인 합니다. 모피 뻗 치고, 칼 날 달린 푹신한 모피 불편 하거나 통증을 나타내는 경우, 1, 2, 또는 3 그들을 점수.</li>
		<li>마우스의 활동에 대 한 확인 합니다. 참고: 마우스 일반적으로 이동 자유롭게 먹고, 마시고, 등반, 전체 케이지 하지만 억제 또는 제한 된 활동 통증의 징조 수 있습니다.</li>
		<li>의식의 수준에 대 한 확인 하십시오. 참고: 마우스는 매우 호기심, 그리고 그들은 일반적으로 주변 조사 케이지 주위에 이동. 부족 또는 감소 운동 통증과 불편을 건의 할 수 있다.</li>
		<li>눈을 확인 하십시오. 참고: 건강 한 쥐에 완전히 열린 눈으로 예상 된다 하지만, 분 비, 가능 하 게 부분적으로 또는 완전 하 게 닫힌된 눈 통증의 표시 될 수 있습니다.</li>
		<li>호흡 속도를 확인 합니다. 참고: 건강 마우스 일반적으로 정상적이 고 급속 한 호흡 속도, 감소 된 호흡 속도 불편의 표시 될 수).</li>
		<li>호흡 품질에 대 한 확인 하십시오. 참고: 함께 또는 없이 헐 떡이 고 심한 흔적이 호흡 고통의 표시 이다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 조직 샘플링 Ribonucleic 산 (RNA) 추출 및 균질 화
<ol><li>컬렉션/균질 튜브 준비: 추가 1 mL 단일 단계 RNA 격리 시 약 2 mL 튜브에 prefilled 1.4 m m 세라믹 분야와 함께.</li>
	<li>적절 한 시간에 ((0 h) 전에 2 h, 4 h와 LPS 주입 후 8 h) exsanguination 뒤 마 취 과다 복용 (isoflurane)와 마우스를 안락사와 해 부와 함께 진행.</li>
	<li>피부와 내부 장기와 복 부 구멍이 함께 노출 근육 레이어 컷.</li>
	<li>조심 스럽게 비장, 간, 그리고 결 장 해 부, 지방에서 장기를 청소 하 고 얼음에 PBS에서 그들을 유지.</li>
	<li>가 위 또는 메스를 사용 하 여 각 기관에서 작은 조각 (약 0.5 cm 긴) 그만. 참고: 그것은 항상 각 마우스 (간, 근 위 또는 원심 부분의 결 같은 엽)에 오르간의 대략 동일한 부분에서 조각을 하는 것이 중요.</li>
	<li>곧 건조 한 종이 티슈의 조각에 조직 및 RNA 격리 시에 완전히 몰입 확인 하 고 컬렉션/균질 튜브에.</li>
	<li>고속 벤치탑 균질 화기에 조직 균질 비장, 간, 그리고 콜론 균질의 1 개 주기에서 사용 속도 6.00 30 같은 부드러운 조직에 대 한 s.</li>
	<li>실 온에서 5 분에 대 한 샘플을 품 어.</li>
	<li>신중 하 게 장소를 액체 질소에 튜브 동결 조직 lysate. RNA 분리까지 lysate-80 ° C에서 냉동 스냅을 저장 합니다.</li>
</ol>5. 조직에서 RNA 추출
참고: RNA 격리 시 약, 클로 프롬, 및 알콜 유해 물질로 간주 됩니다. RNA 추출 화학 후드 수행 합니다. RNase 없는 환경을 유지 하기 위해 인증 RNase 무료 시 약 및 장비를 사용 합니다.
<ol><li>
상 분리
	<ol>
<li>냉동된 조직 lysate 얼음에 녹여</li>
		<li>1000 x g 남아 있을 수 있습니다 남아 있는 조직 입자를 펠 렛을 4 ° C에서 5 분에 샘플 원심</li>
		<li>새로운 nuclease 무료 1.5 mL 튜브에는 상쾌한을 전송.</li>
		<li>200 µ L 얼음 클로 프롬 / 1 mL RNA 격리 시 약을 추가 하 고 10-15 s 손으로 적극적으로 악수.</li>
		<li>실 온에서 2-3 분 동안 품 어.</li>
		<li>12에서 원심 분리기, 4 ° c.에 15 분 동안 000 x g 참고: 샘플 이제 3 단계 포함 됩니다: 빨간색 페 놀-클로 프롬 위상과 interphase, 상단 무색 수성 단계 낮은. RNA는 위 수성 단계에 존재.</li>
		<li>위 수성 단계 (총 볼륨의 50%)와 전송 새로운 nuclease 무료 1.5 mL 튜브에 수집 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RNA 강 수
	<ol>
<li>1 mL RNA 격리 시 당 0.5 mL 얼음 처럼 차가운 소 프로 파 놀을 추가 하 고 반전 튜브 5-6 번으로 부드럽게 혼합.</li>
		<li>실 온에서 10-15 분 동안 품 어.</li>
		<li>4 ° c.에서 10 분 동안 12000 x g에서 원심 분리기 참고: RNA 펠 릿이이 단계에 표시 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RNA 펠 릿의 세척
	<ol>
<li>완전히 제거는 펠 렛을 방해 하지 않고는 소 프로 파 놀을 포함 하는 상쾌한.</li>
		<li>1 mL RNA 격리 시 약 사용 초기 세포 당 1 mL 차가운 75% 에탄올과 펠 릿을 세척.</li>
		<li>짧게 샘플 소용돌이입니다.</li>
		<li>4 ° c.에서 5 분 동안 원심 분리기 7500 (12000) x g에서 샘플</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RNA를 용 해
	<ol>
<li>완전히는 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한에 에탄올을 제거 합니다.</li>
		<li>3-5 분 실 온에서 RNA 펠 릿 건조 화학 후드 아래 열린된 관 두고 (-건조 하지 마십시오 경우 그것은 RNA를 분해 하기 어려운 것으로).</li>
		<li>신중 하 게 여기저기 pipetting으로 20-50 µ L nuclease 무료 물에 RNA 펠 릿을 디졸브.</li>
		<li>더는 RNA의 솔루션을 개선 하기 위해 10-15 분 55 ° C에서 샘플을 품 어. 참고:이 단계에서 RNA는 추가 분석까지-80 ° C에 저장할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6입니다. 나머지 DNA의 소화
<ol><li>분 광 광도 계는 분 광 광도 계에는 약 수 (2 µ l)를 pipetting으로 RNA 농도 측정 하 고 권장된 농도를 조정 합니다.</li>
	<li>Max DNA 오염의 소화를 시작 합니다. 50 µ L nuclease 무료 물에는 10 µ g RNA</li>
	<li>DNase I 버퍼와 1 µ L rDNase 샘플 및 혼합 pipetting으로 부드럽게 나 고 아래로 x 10의 0.1 볼륨을 추가 합니다.</li>
	<li>20-30 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>소용돌이 DNase 비활성화 시 약 0.1 볼륨 피펫으로와 잘 혼합 하는 샘플을 추가 하 고.</li>
	<li>가끔 손으로 혼합 실 온에서 5 분 동안 품 어.</li>
	<li>1.5 분 동안 10000 x g에서 원심.</li>
	<li>상쾌한 새 nuclease 무료 튜브에 RNA DNA 무료 포함 된 전송 합니다.</li>
	<li>분 광 광도 계에 의해 RNA 농도 품질을 측정 합니다.</li>
</ol>7. 반전 녹음 방송
<ol><li>반전 녹음 방송에 대 한 상용 Deoxyribonucleic acid cDNA 반전 녹음 방송 (RT) 키트를 사용 합니다. 참고: 여기, RNA의 2 µ g까지 되돌릴 수 있습니다 베낀.</li>
	<li>2 µ g RNA를 포함 하는 볼륨을 계산 합니다. 새로운 PCR 튜브에 2 µ g RNA 플라스틱</li>
	<li>10 µ L의 최종 볼륨을 PCR 튜브에 샘플 nuclease 무료 물을 추가 합니다.</li>
	<li>표 2 에 나열 된 다음과 같은 구성 요소를 혼합 하 여 마스터 믹스 2 x 준비
</li>
	<li>20 µ L의 총 볼륨 믹스 마스터 x 1를 10 µ l RNA 마스터 믹스 x 10 µ L 2를 추가 합니다.</li>
	<li>중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 튜브 및 샘플 다운 스핀을 잠시 닫습니다.</li>
	<li>PCR Thermocycler에서 샘플을 놓고 표 3에 나열 된 설정을 설정 합니다.</li>
	<li>추가 분석을 위해-20 ° C에서 생성 된 cDNA를 저장 합니다.</li>
</ol>8. 정량적 PCR (정량)
<ol><li>상용 키트 정량 Pcr 반응을 수행 합니다.</li>
	<li>자체 디자인과 intron 스패닝 뇌관의 템플릿 cDNA의 다른 농도와 사용 하기 전에 테스트. 표준 곡선을 작성 하 여 뇌관의 효능을 분석 하 고 뇌관을 사용 하 여 높은 효능과 올바른 녹는 곡선. 참고:이 실험에 사용 된 뇌관의 시퀀스는 표 2에 나열 됩니다.</li>
	<li>표 4에 설명 된 반응 설치 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 반응 384-잘 접시에서를 준비 합니다.</li>
	<li>모든 솔루션 및 알루미늄 호 일을 사용 하 여 반응 혼합물이 준비 될 때 젖 지 접시를 방지 하기 위해 얼음에 플레이트를 유지.</li>
	<li>Triplicates 모든 반응을 수행 합니다.</li>
	<li>표 5에 나열 된 설정을 사용 하 여 thermocycler에 PCR 반응을 수행 합니다.</li>
	<li>triplicates에서 모든 반응에 대 한 평균 Ct 값을 계산 합니다. Glycerinealdehyde-3-인산 염-효소 식 수준에 모든 대상 유전자를 정상화 (Gapdh) 2^(-ΔCt)를 계산 하 여 내부 관리 유전자. 참고: 모든 대상 유전자 평균 Ct와 > 35 검출 한계에서 것으로 간주 되었다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

이 프로토콜 미생물-파생 제품에 의해 침공 후 발생 하는 면역 프로세스를 모방 합니다. 프로토콜 내에서 중요 한 단계는 마우스 선, 쥐의 위생 상태, LPS, endotoxemia, 발생과 실험 종료의 시간 포인트에 대 한 동물의 모니터링의 복용량의 선택. 가장 중요 한 것은, 마우스 스트레인의 유전 배경 고려 될 수 있다. 다른 마우스 긴장 다른 민감성 LPS에 있다. 예를 들어 C3H/HeJ 및 C57BL/10ScCr 마우스 LPS에 강한 ...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/57610/injections-lipopolysaccharide-into-mice-to-mimic-entrance-microbial">Injections of Lipopolysaccharide into Mice to Mimic Entrance of Microbial-derived Products After Intestinal Barrier Breach</a>
One of the authors&#39; names was corrected from:
Katarina Raduolovic
to:
Katarina Radulovic

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Erratum: Injections of Lipopolysaccharide into Mice to Mimic Entrance of Microbial-derived Products After Intestinal Barrier Breach

인간의 소장 진화 하는 동안 호스트와 상호 유익한 관계를 개발 했다 누가 microbiota을 형성 하는 미생물의 큰 컨소시엄 식민지 이다. 이 관계에서 호스트가 합니다 보안 틈새를 microbiota는 microbiota 비타민, 영양소 소화 및 병원 체에서 보호는 microbiota 있는1호스트를 제공 하는 반면. 호스트와는 microbiota 사이이 유익한 관계를 방해 하는 경우 질병을 개발할 수 있습니다, 선 동적인 장 질병 (IBD). IBD은 두 가지 주요 형태, Crohn의 질병 (CD) 및 궤 양성 대 장 염 (UC)에서 발생 하는 유전과 환경 요인에 의해 발생 하는 장의 multifactorial 만성 염증 성 질병 이다. 두 IBD 형태 사이의 유사성에도 불구 하 고 그들은 위치와 염증 성 수정의 성격에서 특정 차이 특징 이다. CD 동안 UC 비 과거 이며, 콜론으로 소화 관의 어느 부분에 잠재적으로 확장할 수 있는 재발 과거 염증 성 질환 이다. 또한, 돌연변이 뉴클레오티드 바인딩 oligomerization 도메인에 포함 된 단백질 2 (NOD2), 패턴 인식 수용 체 (PRR) muramyl dipeptide (민주당), 가장 그람 양성 및-부정적인 박테리아의 세포 벽의 구성 요소를 인식 하는 CD2와 관련 된. 또한, 대장균 (대장균), Listeria 및 Streptococci 와 그들의 제품 모두 찾아냈다 세포 내 장벽을 위반3후 호스트를 입력 CD 환자에. 박테리아 또는 그들의 제품 CD의 개발 하는 동안 호스트를 입력, 면역 시스템 항균 항 체4순환의 생산에 지도 하는 응답을 개발 한다. 어쩌면, IBD의 병 인에서 microbiota의 역할에 대 한 가장 설득력 있는 증거는 마우스 모델에서 유래한 다. 동물 항생제로 처리 됩니다 또는 마우스 세균 무료 (GF) 조건에서 보관 하는 경우, 질병의 심각도 IL-10-/-생쥐에서 GF 시설5,6대 장 염을 개발 하지 않는 그와 같은 대부분의 대 장 염 모델에서 감소 된다. 또한, 대 장 염도 불균형 구성 특징 이다 고 dysbiosis7라고 하는 부유를 감소 microbiota의 구성을 방해. IBD의 결과 미생물 및 미생물에서 파생 된 제품의 입구는 호스트에 될 수 있는 증가 창 자 침투성을 될 수 있습니다.
동물, 응용 Dextran 황산 나트륨 (DSS)의 상피 장벽은8의 증가 한 침투성을 선도 하는 장 상피 위반을 유도 합니다. 포털 LPS 농도 DSS colitis9동물에서 상승 된. 흥미롭게도, 동물 부족 C 유형 lectin 수용 체 특정 세포내 접착 분자-3 nonintegrin를 잡는 체 관련 1 (로그인-R1)는 보호 DSS colitis 및 LPS 유발 endotoxemia10에서. 호스트에 추가 보급, 세균 이나 박테리아 파생 제품 혈관 장벽11, 크고 작은 창 자 위치는 복 막 구멍, mesenteric 임 파선 또는 간12를 통과 해야 합니다. 이 시스템의 복잡성을 줄이기 위해, 정의 된 박테리아에서 파생 된 화합물이 사용 되었다. LPS, 복 (i.p.) 또는 정 맥 (i.v.) 후 endotoxemia를 주입13 interleukins Il6 표현 및 Ilb cytokine Tnfa LPS에 대 한 응답에서을 공부 하 고 쥐에 주입 했다.
LPS는 병원 체 관련 된 분자 패턴 (PAMP) 지질 A의 구성 된 그람 음성 세균의 세포 벽 구성 요소로 표현 (LPS의 구조에서 주요 PAMP), 코어 올리고 당 및 O를 사이드 체인14. 수용 체 통행세 같이 4 (TLR4) 수지상 세포, 대 식 세포, 상피 세포에 의해 표현 LPS15, 적절 한 바인딩을 위한 공동 수용 체 필요한 인식 합니다. 급성 위상 단백질 LPS-바인딩 단백질 (LBP) 전송 LPS 차별화 14의 클러스터 (CD14), glycosylphosphatidylinositol 고정 막 단백질 복잡 한 형태로 LPS 바인딩합니다. CD14 더 LPS 림프 구 항 원 96 또는 라고도 MD 2 셔틀 TLR4의 세포 외 도메인 관련 됩니다. MD-2 LPS의 바인딩 TLR4/MD-2의 세포내 어댑터 분자는 하류 신호 통로14, 골수성 차별화 기본 포함 활성화를 모집 하는 구조적 변화를 유도 이합체 화를 용이 하 게 응답 유전자 88 (MyD88)-종속 통로는 사격 포함 하는 도메인 어댑터 유도 인터페론-β (TRIF)-종속 통로16. LPS TLR4에 의해의 인식 다음 NF κB 통로 활성화 하 고 TNFα, 일리노이-6와 일 1β17proinflammatory cytokines의 표정을 유도 한다.
특히, LPS는 동물, 동물, 주어진 LPS의 농도에 주입 하는 경우는 동물 및 다이어트의 유전 배경 간주 있다. 부패 시키는 충격, 저 혈압 및 다 수 기관 실패, 특징 이끌어 낸다 LPS의 높은 농도 그리고 마지막으로 죽음18. 마우스는 덜 민감한 LPS 인간에 비해 2-4 ng/kg 체중 (BW) 사이 LPS 농도 cytokine 폭풍19유도 수 있습니다. 마우스, 치 사 량 (LD50) 쥐 에서부터 사용 마우스 스트레인에 따라 10-25 mg/kg BW20 의 죽음을 유도 일반적으로 사용 되 마우스 긴장, C57Bl/6와 BALB/c에 대 한 치 사 량 50% (LD50)은 10 mg/kg BW. 반면, C3H/HeJ 및 C57BL/10ScCr 긴장 하 Tlr421돌연변이 유도 LPS endotoxemia에서 보호 됩니다. 따라서, Tlr4 불충분 한 쥐 hyporesponsive LPS22에 주사 하는. PARP1/마우스23 같은 다른 유전자 변형된 마우스 라인은 LPS 유발 독성 쇼크에 저항 한다.
마우스 모델 설명 여기 모방 신체의 표면의 장벽 위반 후 LPS 보급의 결과를 체계적으로 관리 하는 LPS의 sublethal 복용량을 사용 합니다. C56Bl/6 생쥐에서 사망 하지만 프로 염증 성 cytokines의 유도 방출을 선택한 LPS 농도 (2 mg/kg BW) 유도 하지 않았다.

<table><tbody><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2x)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit,</td><td>Applied Biosystems, Foster City, CA, USA</td><td>4368813</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Free DNase Set,</td><td>Qiagen, Hilden, Germany</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>LPS Escherichia coli O111:B4</td><td>Invivogen, San Diego, CA, USA.</td><td>tlrl-eblps</td><td></td></tr><tr><td>Omnican 50 Single-use insulin syringe</td><td>B. Braun Melsungen, Melsungen, Germany</td><td>9151125</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent Technologie, Santa Clara, USA</td><td>not applicable</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5430</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>not applicable</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Mikro 220R</td><td>Hettich, Kirchlengern, Germany</td><td>not applicable</td><td></td></tr><tr><td>Dissection tools</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Germany</td><td>not applicable</td><td></td></tr><tr><td>Fast-Prep-24 5G Sample Preparation System</td><td>M.P. Biomedicals, Santa Ana, CA, USA</td><td>not applicable</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000</td><td>NanoDrop Products, Wilmington, DE, USA</td><td>not applicable</td><td></td></tr><tr><td>TRI Reagent</td><td>Zymo Research, Irvine, CA, USA</td><td>R2050-1</td><td></td></tr></tbody></table>

injections of lipopolysaccharide into mice to mimic entrance of microbial-derived products after intestinal barrier breach

장 상피 방 벽에서 일반적으로 용납 되거나 무시 되는 microbiota 호스트를 구분 합니다. 이 방 벽의 위반 호스트, 호스트 순환 및 통제 염증으로 선 동적인 장 질병 (IBD), 환자에서 관찰 선도 하는 내부 장기로 세균 이나 박테리아 파생 제품의 입구에 발생 하는 증가 창 자 상피 침투성에 의해 특징.
호스트에 박테리아에서 파생 된 화합물의 입구를 모방 하는 endotoxemia 모델 어떤 lipopolysaccharide (LPS), 그램 음성 박테리아의 외부 세포 벽의 구성 요소에서에서 채택 되어, 쥐로 주입 했다. 이 연구에서 LPS의 sublethal 복용량 intraperitoneally 주사 하 고 쥐 8 h 질병의 점수를 사용 하 여 연속적으로 감시 되었다. 또한, 염증 성 cytokines Il6, Il1b, 및 Tnfa 의 수준을 다른 시간 지점에서 정량 하 여 비장, 간 및 콜론에 분석 되었다 식 LPS 주입 게시. 이 모델은 미생물 또는 신체 표면의 장벽 위반으로 인 한 세균성 파생 제품의 침공 후 면역 반응의 조사를 포함 하는 연구에 대 한 유용할 수 있었다.

장 장벽 위반 후 발생 하는 세균 이나 박테리아 파생 제품의 입구 후 호스트에 대 한 결과 모방, LPS는 C57Bl/6 마우스 sublethal 복용량 (2 µ g/g 몸 무게)에 주입 했다. 모든 단일 마우스 모니터링 되었고, 쥐의 모양, 동물, 눈의 상태와 호흡 속도 및 품질 (표 1)의 활동을 포함 하는 점수 시트에 나열 된 매개 변수를 endotoxemia의 발생에 대 한 득점 . 동물은 LPS의 주입 후 6...

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Injections of Lipopolysaccharide into Mice to Mimic Entrance of Microbial-derived Products After Intestinal Barrier Breach

여기 장 장벽 위반 후 박테리아에서 파생 된 화합물의 입구를 모방 하는 프로토콜 제공 됩니다. Lipopolysaccharide sublethal 저용량 24 h 후 주입에 대 한 모니터링 했다 생쥐에 체계적으로 주입 했다. 프로 염증 성 cytokines의 표정은 비장, 간, 그리고 콜론에서 여러 시간 지점에서 결정 되었다.

장 방 벽 위반 후 미생물 파생 제품의 입구를 모방 하는 쥐로 Lipopolysaccharide의 주사

The intestinal epithelial barrier separates the host from the microbiota that is normally tolerated or ignored. The breach of this barrier results in the ...

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19.3K 조회수.  University of Basel. 여기 장 장벽 위반 후 박테리아에서 파생 된 화합물의 입구를 모방 하는 프로토콜 제공 됩니다. Lipopolysaccharide sublethal 저용량 24 h 후 주입에 대 한 모니터링 했다 생쥐에 체계적으로 주입 했다. 프로 염증 성 cytokines의 표정은 비장, 간, 그리고 콜론에서 여러 시간 지점에서 결정 되었다.

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Intraductal Injection of LPS as a Mouse Model of Mastitis: Signaling Visualized via an NF-&kappa;B Reporter Transgenic

Animal models of human disease are necessary in order to rigorously study stages of disease progression and associated mechanisms, and ultimately, as pre-clinical models to test interventions. In these methods, we describe a technique in which lipopolysaccharide (LPS) is injected into the lactating mouse mammary gland via the nipple, effectively modeling mastitis, or inflammation, of the gland. This simulated infection results in increased nuclear factor kappa B (NF-&kappa;B) signaling, as visualized through bioluminescent imaging of an NF-&kappa;B luciferase reporter mouse1.
Our ultimate goal in developing these methods was to study the inflammation associated with mastitis in the lactating gland, which often includes redness, swelling, and immune cell infiltration2,3. Therefore, we were keenly aware that incision or any type of wounding of the skin, the nipple, or the gland in order to introduce the LPS could not be utilized in our methods since the approach would likely confound the read-out of inflammation. We also desired a straight-forward method that did not require specially made hand-drawn pipettes or the use of micromanipulators to hold these specialized tools in place. Thus, we determined to use a commercially available insulin syringe and to inject the agent into the mammary duct of an intact nipple. This method was successful and allowed us to study the inflammation associated with LPS injection without any additional effects overlaid by the process of injection. In addition, this method also utilized an NF-&kappa;B luciferase reporter transgenic mouse and bioluminescent imaging technology to visually and quantitatively show increased NF-&kappa;B signaling within the LPS-injected gland4.
These methods are of interest to researchers of many disciplines who wish to model disease within the lactating mammary gland, as ultimately, the technique described here could be utilized for injection of a number of substances, and is not limited to only LPS.

Described here is a technique in which lipopolysaccharide is injected into the lactating mouse mammary gland via the nipple to simulate mastitis, a condition commonly caused by bacterial infection. Lipopolysaccharide injection results in increased nuclear factor kappa B (NF-&kappa;B) signaling, visualized through bioluminescent imaging of an NF-&kappa;B luciferase reporter mouse.

유선염의 마우스 모델로 LPS의 Intraductal 주입 : 신호는 NF-κB 리포터 트렌스 제닉을 통해 시각화

Animal models of human disease are necessary in order to rigorously study stages of disease progression and associated mechanisms, and ultimately, as ...

연구

의학

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are extremely high, no direct treatment or organ-related mechanism has been examined in detail in real time. The liver is the key organ that manages toxins and infections in the human body. Herein, we aimed to perform intravital imaging of mouse liver after induction of endotoxemia in order to track the motility of immune cells, such as neutrophils and liver capsular macrophages (LCMs). Accordingly, we designed a novel surgical method for exposure of the liver with minimally invasive surgery. Mice were intraperitoneally injected with lipopolysaccharide (LPS), a common endotoxin. Using our novel surgical approach for exposure and intravital imaging of the mouse liver, we found that neutrophil recruitment in LPS-treated LysM-green fluorescent protein (GFP) mouse liver was increased compared with that in phosphate-buffered saline-treated liver. After LPS treatment, the number of neutrophils increased significantly with time. Additionally, using CX3Cr1-GFP mice, we successfully visualized liver resident macrophages called LCMs. Therefore, to investigate the efficacy of new reagents to control immune mobility in vivo, determining the motility and morphology of neutrophils and LCMs in the liver may allow us to identify therapeutic effect in organ failure and tissue damage caused by leukocytes activation in sepsis.

We established a novel surgical protocol for two-photon imaging of live mice liver with minimal invasion. With this technique, we identified the detailed structure of the liver during lipopolysaccharide-induced endotoxemia. We anticipate that this method may be utilized to determine the effectiveness of various reagents treatment to hepatic leukocyte migration.

Lipopolysaccharide 취급 마우스 간에 면역 반응 동안 백혈구의 2 광자 Intravital 이미징

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...

면역학 및 감염병학

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence rates of S. aureus infection climbing annually, there is a demand for additional research in its&#160;pathogenicity. Animal models of infectious disease advance our understanding of the host-pathogen response and lead to the development of effective therapeutics. Neutrophils play a primary role in the innate immune response that controls S. aureus infections by forming an abscess to wall off the infection and facilitate bacterial clearance; the number of neutrophils that infiltrate an S. aureus skin infection often correlates with disease outcome. LysM-EGFP mice, which possess the enhanced green fluorescent protein (EGFP) inserted in the Lysozyme M (LysM) promoter region (expressed primarily by neutrophils), when used in conjunction with in vivo whole animal fluorescence imaging (FLI) provide&#160;a means of quantifying neutrophil emigration noninvasively and longitudinally into wounded skin. When combined with a bioluminescent S. aureus strain and sequential in vivo whole animal bioluminescent imaging (BLI), it is possible to longitudinally monitor both the neutrophil recruitment dynamics and in vivo bacterial burden at the site of infection in anesthetized mice from onset of infection to resolution or death. Mice are more resistant to a number of virulence factors produced by S. aureus that facilitate effective colonization and infection in humans. Immunodeficient mice provide a more sensitive animal model to examine persistent S. aureus infections and the ability of therapeutics to boost innate immune responses. Herein, we characterize responses in LysM-EGFP mice that have been bred to MyD88-deficient mice (LysM-EGFP&#215;MyD88-/- mice) along with wild-type LysM-EGFP mice to investigate S. aureus skin wound infection. Multispectral simultaneous detection enabled study of neutrophil recruitment dynamics by using in vivo FLI, bacterial burden by using in vivo BLI, and wound healing longitudinally and noninvasively over time.

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

An approach is described for real-time detection of the innate immune response to cutaneous wounding and Staphylococcus aureus infection of mice. By comparing LysM-EGFP mice (which possess fluorescent neutrophils) with a LysM-EGFP crossbred immunodeficient mouse strain, we advance our understanding of infection and the development of approaches to combat infection.

마우스 모델을 평가 타고 난 면역 반응 포도 상 구 균 감염

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...

Chronic Salmonella Infection Induced Intestinal Fibrosis

Tissue fibrosis characterized by the pathological accumulation of extracellular matrix such as collagen is the outcome of persistent inflammation and dysregulated repair. In inflammatory bowel disease (IBD), fibrosis leads to recurrent stricture formations for which there is no effective therapy other than surgical resection. Due to its late onset, the processes that drive fibrosis is less studied and largely unknown. Therefore, fibrotic complications represent a major challenge in IBD. In this protocol, a robust in vivo model of intestinal fibrosis is described where streptomycin pre-treatment of C57Bl/6 mice followed by oral gavage with vaccine grade Salmonella Typhimurium &#916;AroA mutant leads to persistent pathogen colonization and fibrosis of the cecum. Methodologies for preparing S. Typhimurium &#916;AroA for inoculation, quantifying pathogen loads in the cecum and spleen, and evaluating collagen deposition in intestinal tissues are explained. This experimental disease model is useful for examining host factors that either enhance or exacerbate CD-like intestinal fibrosis.

This protocol describes a mouse model of Salmonella driven intestinal fibrosis that resembles key pathological hallmarks of Crohn&#8217;s disease including transmural inflammation and fibrosis. This method can be used to evaluate host factors that alter fibrotic outcomes using mutant mice maintained on a C57Bl/6 genetic background.

만성 살모넬라 감염 유도 장 섬유증

Tissue fibrosis characterized by the pathological accumulation of extracellular matrix such as collagen is the outcome of persistent inflammation and ...

Sub-acute Cerebral Microhemorrhages Induced by Lipopolysaccharide Injection in Rats

Cerebral microhemorrhages (CMHs) are common in aged patients and are correlated to various neuropsychiatric disorders. The etiology of CMHs is complex, and neuroinflammation is often observed as a co-occurrence. Here, we describe a sub-acute CMHs rat model induced by lipopolysaccharide (LPS) injection, as well as a method for detecting CMHs. Systemic LPS injection is relatively simple, economical, and cost-effective. One major advantage of LPS injection is its stability to induce inflammation. CMHs caused by LPS injection could be detected by gross observation, hematoxylin and eosin (HE) staining, Perl&#39;s Prussian staining, Evans blue (EB) double-labeling, and magnetic resonance imaging-susceptibility weighted imaging (MRI-SWI) technology. Finally, other methods of developing CMHs animal models, including their advantages and/or disadvantages, are also discussed in this report.

We present a protocol to induce and detect CMHs caused by LPS injection in Sprague-Dawley rats, which may be utilized in future research investigations on the pathogenesis of CMHs.

아 급성 대뇌 Microhemorrhages 쥐에서 Lipopolysaccharide 주입에 의해 유도 된

Cerebral microhemorrhages (CMHs) are common in aged patients and are correlated to various neuropsychiatric disorders. The etiology of CMHs is complex, ...

신경과학

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water while preventing passage of luminal bacteria and exogenous substances. A breach of this layer results in increased permeability to luminal contents and recruitment of immune cells, both of which are hallmarks of pathologic states in the gut including inflammatory bowel disease (IBD). 
Mechanisms regulating epithelial barrier function and transepithelial migration (TEpM) of polymorphonuclear neutrophils (PMN) are incompletely understood due to the lack of experimental in vivo methods allowing quantitative analyses. Here, we describe a robust murine experimental model that employs an exteriorized intestinal segment of either ileum or proximal colon. The exteriorized intestinal loop (iLoop) is fully vascularized and offers physiological advantages over ex vivo chamber-based approaches commonly used to study permeability and PMN migration across epithelial cell monolayers.
We demonstrate two applications of this model in detail: (1) quantitative measurement of intestinal permeability through detection of fluorescence-labeled dextrans in serum after intraluminal injection, (2) quantitative assessment of migrated PMN across the intestinal epithelium into the gut lumen after intraluminal introduction of chemoattractants. We demonstrate feasibility of this model and provide results utilizing the iLoop in mice lacking the epithelial tight junction-associated protein JAM-A compared to controls. JAM-A has been shown to regulate epithelial barrier function as well as PMN TEpM during inflammatory responses. Our results using the iLoop confirm previous studies and highlight the importance of JAM-A in regulation of intestinal permeability and PMN TEpM in vivo during homeostasis and disease. 
The iLoop model provides a highly standardized method for reproducible in vivo studies of intestinal homeostasis and inflammation and will significantly enhance understanding of intestinal barrier function and mucosal inflammation in diseases such as IBD.

Dysregulated intestinal epithelial barrier function and immune responses are hallmarks of inflammatory bowel disease that remain poorly investigated due to a lack of physiological models. Here, we describe a mouse intestinal loop model that employs a well-vascularized and exteriorized bowel segment to study mucosal permeability and leukocyte recruitment in vivo.

표준화된 장 루프 모델을 사용하여 마우스에서 장 투과성 및 호중구 환전 이동의 기능 평가

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. Various approaches have been described, such as the inhalation of aerosolized LPS as well as nasal or intratracheal instillation. The presented protocol describes a detailed step-by-step procedure to induce ALI in mice by direct intratracheal LPS instillation and perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage (BAL) fluid, and lung tissue. After intraperitoneal sedation, the trachea is exposed and LPS is administered via a 22 G venous catheter. A robust and reproducible inflammatory reaction with leukocyte invasion, upregulation of proinflammatory cytokines, and disruption of the alveolo-capillary barrier is induced within hours to days, depending on the LPS dosage used. Collection of blood samples, BAL fluid, and lung harvesting, as well as the processing for FACS analysis, are described in detail in the protocol. Although the use of the sterile LPS is not suitable to study pharmacologic interventions in infectious diseases, the described approach offers minimal invasiveness, simple handling, and good reproducibility to answer mechanistic immunological questions. Furthermore, dose titration as well as the use of alternative LPS preparations or mouse strains allow modulation of the clinical effects, which can exhibit different degrees of ALI severity or early vs. late onset of disease symptoms.

Presented here is a step-by-step procedure to induce acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation and to perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage fluid, and lung tissue. Minimal invasiveness, simple handling, good reproducibility, and titration of disease severity are advantages of this approach.

직접 경포당증 주입에 의해 마우스에 있는 심각한 폐 상해를 유도하는

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing enterocolitis (NEC). However, a mechanistic link between these two conditions remains yet to be discovered. We have adopted a murine model of chorioamnionitis involving lipopolysaccharide (LPS)-induced fetal exposure to maternal inflammation (FEMI). This model of FEMI induces a sterile maternal, placental, and fetal inflammatory cascade, which is also present in many cases of clinical chorioamnionitis. Although models exist that utilize live bacteria and more accurately mimic the pathophysiology of an ascending infection resulting in chorioamnionitis, these methods may cause indirect effects on development of the immature intestinal tract and the associated developing microbiome. Using this protocol, we have demonstrated that LPS-induced FEMI results in a dose-dependent increase in pregnancy loss and preterm birth, as well as disruption of normal intestinal development in offspring. Further, we have demonstrated that FEMI significantly increases intestinal injury and serum cytokines in offspring, while simultaneously decreasing goblet and Paneth cells, both of which provide a first line of innate immunity against intestinal inflammation. Although a similar model of LPS-induced FEMI has been used to model the association between chorioamnionitis and subsequent abnormalities of the central nervous system, to our knowledge, this protocol is the first to attempt to elucidate a mechanistic link between chorioamnionitis and later perturbations in intestinal development as a potential link between chorioamnionitis and NEC.

We developed a model of chorioamnionitis to simulate fetal exposure to maternal inflammation (FEMI) without complications of live organisms to examine the effects of FEMI on development of the offspring&#8217;s intestinal tract. This allows for study of mechanistic causes for development of intestinal injury following chorioamnionitis.

신생아 장 발달에 급성 chorioamnionitis의 효력을 연구하기 위하여 모성 염증에 태아 노출의 Murine 모형

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing ...

Noninvasive Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation in Mice

The acute lung injury (ALI) mouse model induced by lipopolysaccharide (LPS) or endotoxin is still among the most commonly used models in animal studies of acute lung injury or acute inflammation. The current most commonly used methods in acute lung injury mouse models are an intraperitoneal injection of LPS and tracheostomy for the tracheal infusion of LPS. However, the former method lacks lung targeting and damages other organs, and the latter method induces operative trauma, infection risk, and a low survival rate. Here, we recommend a noninvasive oropharyngeal endotracheal intubation method for LPS instillation in mice. In this method, LPS is noninvasively introduced into the trachea through the oropharyngeal cavity to be instilled into the lung with the help of an apparatus for endotracheal intubation. This method not only assures lung targeting but also avoids damage and the risk of death in the animals. We expect that this approach will become widely used in the field of acute lung injury.

Here, we propose a protocol for intratracheal lipopolysaccharide (LPS) delivery via noninvasive oropharyngeal endotracheal intubation. This method minimizes the trauma of the surgical procedure for the animal and accurately delivers LPS to the trachea and then to the lungs.

The acute lung injury (ALI) mouse model induced by lipopolysaccharide (LPS) or endotoxin is still among the most commonly used models in animal studies of ...

생물학

Subcutaneous Injection of Bacterial Antigen to Induce Systemic Inflammation in a Murine Model

Source: John, S. et al., <a href="https://app.jove.com/v/62925">Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) as a Model for Post-Infectious Uveitis.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2021)
This video demonstrates the induction of systemic inflammation in an anesthetized mouse. The injection of mycobacterial antigen-adjuvant depots triggers cytokine release and localized inflammation. Lymphatic vessels open, enabling immune cell entry into lymph nodes and activation of T cells, which release pro-inflammatory cytokines, leading to widespread inflammation.

쥐 모델에서 전신 염증을 유발하기 위한 박테리아 항원의 피하 주사

Source: John, S. et al., Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) as a Model for Post-Infectious Uveitis.&#160;J. Vis. Exp. (2021)
This video demonstrates the ...