조직 섬유증은 만성 염증 이나 노화에 대 한 응답으로 시간이 지남에 실패 하는 장기 주요 방법. 그리고 사실, 나는 당신이 전염성 에이전트 또는 암으로 정지하지 않는 경우에, 당신이 나이든 기관 섬유증에서 정지할 가능성이 있다는 것을 주장할 것입니다. 불행히도, 인간의 조직 섬유증을 모방하는 훌륭한 마우스 모델이 많지 않습니다.
그래서 우리가 개발한 것은 크론병의 마우스 모형입니다, 그것은 창자의 섬유증을 일으키는 원인이 되고 크게 치료할 수 없는 인간에 있는 질병입니다. 사실, 당신이 그것을 치료할 수 있는 유일한 방법은 섬유 조직의 외과 제거 및 창자의 재 결찰을 통해서입니다. 우리의 모형의 장점은 모든 마우스 긴장에 있는 완전히 침투이고 아주 밀접하게 인간 Crohn의 질병을 모방하고 섬유증은 실제로 강력한 모형인 한 달 이상 지속한다는 것입니다.
이 절차의 가장 어려운 부분은 마우스의 처리, 특히 경구 영역은 많은 연습 특별 인증을 필요로하기 때문에. 이 절차를 처음으로 수행할 때 살모넬라와 함께 작업하려면 적절한 안전 예방 조치와 멸균 기술이 필요하다는 것을 알아야합니다. 폐기물과 박테리아의 처리는 모두 실험 전에 계획되어야합니다.
이 절차의 시각적 데모는 특별한 안전 예방 조치뿐만 아니라 적절한 멸균 기술이 필요한 살모넬라의 처리를 포함하기 때문에 매우 중요합니다. 이 절차를 시작하려면, 밀리리터 당 100 마이크로 그램의 농도에 연쇄 상 미신을 포함하는 LB 천접시를 설정합니다. 멸균 접종 루프를 사용하여 S typhimurium 델타 화살표의 냉동 글리세롤 스톡으로 접시를 줄입니다.
섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 줄무늬 플레이트는 최대 1주일 동안 섭씨 4도에 보관할 수 있습니다. 감염 되기 하루 전에, 항생제를 준비 하기 위해 물 2.5 밀리 리터에 연쇄 상 균의 0.5 그램을 용해.
필터는 연쇄상 구균 용액을 살균합니다. 그런 다음, 전구 팁 22 게이지 게이지 바늘을 1밀리리터 주사기를 사용하여 연쇄상 구균용액의 100 마이크로리터로 마우스를 구두로 게이버링한다. 다음으로, 배양 튜브에 밀리리터당 50 마이크로그램의 농도로 연쇄상 구균을 함유한 LB 국물의 3밀리리터를 첨가한다.
접종 루프를 사용하여 단일 콜로니로 LB 국물을 접종합니다. 200 rpm에서 흔들어와 37 섭씨에서 하룻밤 문화를 배양. 감염 당일, 멸균 PBS를 사용하여 하룻밤 살모넬라 배양의 2회 연속 1~10희석을 수행하여 최종 감염량을 준비한다.
이것은 대략 3백만개의 식민지 형성 단위를 포함하는 100 마이크로리터 접종귀광 귀착됩니다. 그 후, 밀리리터 주사기를 장착한 전구 팁 22 게이지 게이지 바늘을 사용하여 각 마우스에 준비된 살모넬라의 100 마이크로리터를 가지고 게이브한다. 먼저, 2밀리리터 세이프 록 라운드 하단 마이크로튜브를 설정하고, 멸균 PBS 1밀리리터와 각 튜브에 오토클레이브 스테인리스 스틸 비드를 추가합니다.
조직 수집 전에 튜브를 미리 계량합니다. 쥐를 안락사 한 후, 그들의 cecal 및 비장 조직을 절제, 별도 튜브에 개별 동물에서 조직을 수집 하는 확인. 각 튜브의 무게를 측정하여 조직 가중치를 결정합니다.
믹서 밀 장치를 사용하여 조직을 30 헤르츠에서 15 분 동안 균질화하십시오. 그런 다음 96웰 2 밀리리터 메가 블록의 각 웰에 PBS의 900 마이크로 리터를 전송합니다. 파이펫 100 마이크로리터의 조직균질은 첫 번째 우물로 균질화하고 잘 섞습니다.
후속 유정에 100 마이크로리터를 추가하여 음극희석을 10대까지 첨가하여 직렬 희석을 수행한다. 각 희석제의 10 마이크로리터를 트립에 트리플리케이션하여 연쇄상 구균을 함유한 LB 한고에 접시를 매는다. 그런 다음, 평균 식민지 형성 단위를 계산하고 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 조직의 그램당 콜로니 형성 단위를 결정한다.
오픈 피지, 오픈 소스 이미징 소프트웨어이며, 드래그 및 도구 표시 줄에 티프 이미지 파일을 드롭. 메뉴 표시줄에서 이미지, 유형, RGB 스택을 선택하여 이미지를 빨간색, 녹색 및 파란색 채널로 분할합니다. 패널 하단의 가로 막대를 밀어 채널을 녹색으로 설정합니다.
이미지 열기, 조정, 임계값 도구입니다. 최소 및 최대 제한을 조정하여 배경 신호를 제거합니다. 원하는 임계값이 설정되면 임계값 도구를 닫고 분석, 측정 설정, 영역 분획, 임계값 제한 및 표시 레이블로 이동합니다.
프리핸드 선택 또는 다각형 선택 도구로 조직 선택을 얻고 분석, 측정을 클릭하여 콜라겐에 대한 양수 영역을 측정합니다. 이어서, 조직 부위에 콜라겐 염색에 대한 절대 영역 양성을 정상화한다. 연쇄상 구균 처리는 S typhimurium 델타 화살표를 가진 경구 감염에 선행하여 강력한 장 염증 및 섬유증, 특히 cecum에서 이끌어 냅니다.
1억~10억 개의 식민지 형성 단위의 전형적인 병원균 부담은 감염된 동물로부터 1그램당 회수될 수 있으며, 10,000개의 식민지 성형 유닛은 전형적으로 비장 1그램당 회수될 수 있다. picrosirius 빨간 얼룩진 cecal 단면도에 있는 섬유증의 평가는 감염 후에 피크 섬유증 21 일을 나타내고, 병리학의 대부분은 42 일 후에 감염에 의해 해결됩니다. 이 실험을 하려면 며칠이 필요하므로 재료의 철저한 준비는 필수적입니다.
LB 플레이트와 살모넬라 및 연쇄 절제술의 준비는 모두 무균적으로 이루어져야 합니다. 실험에 앞서 실험자가 동물 프로토콜과 안전 위험에 대해 잘 알고 있는지 확인합니다. 콜라겐 부담을 평가할 때, 실험자는 세포사포진 프로파일을 평가하기 위해 유전자 발현 프로파일 또는 유동 세포측정을 평가하기 위해 RNA 시퀀싱과 같은 다른 생물학적 분석방법을 수행하도록 선택할 수 있다.
그래서 우리의 모형은 당신이 창자의 섬유증을 얻는 크론병에게 불린 인간적인 질병을 모방에 특히 좋습니다, 이는 크게 치료할 수 있고 그것을 취급할 수 있는 유일한 쪽은 창자의 단면도를 제거하고 그것을 다시 꿰매는 것이고 다시 돌아오지 않기를 희망하는 것입니다. 우리의 모형의 아주 견고하고 우리는 이미 선천적인 림프구 세포를 표적으로 하는 것이 3, 원시 알파에게 불린 전사 인자, 또는 인터류키 17이 질병을 개량하고 섬유증을 방지한다는 것을 보여주었습니다. 우리의 모형은 크론병과 창자 섬유증의 병자 에서 재생하는 요인을 확인하는 데 특히 능숙하고 우리는 선동적인 장 질병을 완화하기 위하여 치료적으로 취급될 수 있는 표적의 수를 확인하기 위하여 도로에 이미 있습니다.
우리의 모형은 이미 동일한 ILC3 또는 알파 NIL17 접근이 그밖 섬유성 질병에서 놀이에 있을 수 있고 이들은 건선, 다발성 경화증, 특발성 폐 섬유증 같이 것을 포함할 수 있습니다 입력했습니다. 따라서 이러한 동일한 요인을 대상으로 하면 이러한 질병에 있는 섬유증도 완화될 수 있습니다. 돌연변이 살모넬라 스트림은 악성되지 않지만, 시설에서 제공하는 표준 생체 위험 안전 프로토콜을 따르는 것이 중요합니다.
또한 포름알데히드 증기는 발암성으로 알려져 있기 때문에 고정 단계에서 연기 후드 뒤에서 작업하는 것이 중요합니다.
