이 작품을 리 나 A. Shehadeh 다음 교부 금에 의해 지원 되었다:는 건강의 국립 연구소 (R56HL132209 및 1R01HL140468)와 마이애미 심장 연구소.

모든 실험 동물 관련 기관 동물 관리 및 사용 위원회 마이애미 대학에서 NIH 지침 준수에 의해 승인 되었다.
1. 플레이트 코팅 및 시 약의 준비
<ol><li>콜라겐 코팅을 준비:<ol>
<li>콜라겐의 35 μ 추가 나 단일 60 mm 페 트리 접시에 미리 필터링 된 20 m m 초 산 솔루션의 2 mL. 1 시간에 대 한 실 온에서 품 어, 건조 하 고 자외선에 노출.</li>
		<li>워시 코팅 어떤 산 성 잔류물을 제거 하 고 37 ° C CO2저장에 PBS 가진 3 배-무료 셀 문화 인큐베이터 셀 시드를 위한 준비가 될 때까지. 콜라겐 코팅의 최종 농도 5 μ g/c m2입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>관류 버퍼 준비: 30 ml PBS의 페니실린-스 (P/S)의 300 μ를 추가 하 고는 격리 시작 될 때까지 37 ° C 물 욕조에 혼합 따뜻한.</li>
	<li>소화 버퍼 준비: 3.9 mg PBS의 30 mL에 콜라 타입 2의 분해, 0.2 μ m 병 상위 필터를 통해 솔루션을 필터링 및 격리 시작 될 때까지 37 ° C에서 물 욕조에 따뜻한 그것.</li>
	<li>세포 배양 준비:<ol>
<li>실내 온도에 보충 교재를가지고. 여과 없이 추가 보충 (0.05 mL 태아 송아지 혈 청, 표 피 성장 인자, 인슐린, 피 네 프 린, 날린, 올려진다의 5 μ g/mL 및 triiodo-L-thyronine의 4 pg/mL의 36 ng/mL의 0.5 μ g/mL의 5 μ g/mL의 10 ng/mL)의 신장 500 mL를 상피 세포 성장 기저 미디어 2입니다.</li>
		<li>37 ° C 물 목욕 사용 준비가 될 때까지 미디어를 따뜻한.</li>
	</ol>
</li>
	<li>혼합물 준비: 50mm FCCP 준비, 10 m m로 테 논, 10mm oligomycin, 10 m m antimycin A, 50 m L-carnitine, m 및 50 mM etomoxir, DMSO, aliquot에서 모든 솔루션을 재고 하 고-20 ° c.에 화합물을 저장</li>
	<li>2.5 m m 나트륨 물 150 m m NaCl 솔루션의 220 mL에서 준비 하 고는 물 완전히 해산 때까지 75 ° C 물 욕조에 솔루션을 따뜻하게.</li>
	<li>소 혈 청 알 부 민 (BSA) 준비: 0.34 m m 지방 없는 BSA 150 mM NaCl의 250 mL에서 준비. 제어 BSA 다음 단계 1.8에 의해 준비 될 수 있는 팜 BSA 솔루션에 대 한 부정적인 컨트롤 역할을 합니다.</li>
	<li>켤레 BSA (팜-BSA)에 물:<ol>
<li>추가 물 솔루션 점차적으로 BSA 솔루션에는 여전히는 뜨겁다 동안. 그런 다음 pH 7.4 조정 하 고 완료를 활용 하려면 적어도 1 시간 동안 37 ° C에서 그들을 믹스.</li>
		<li>활용이 완료 되 면 솔루션에 150 mM NaCl의 또 다른 150 mL을 추가, 잘, 그것을 혼합 및-20 ° c.에 aliquots 저장 최종 솔루션 BSA는 물 및 0.17 m m 1 m m 나트륨을 포함 하 고 셀 세포 외 유출 지방산 기반 분석 결과에 대 한 지방산 기판으로 사용 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포 외 유출 분석 결과 기저 미디어 준비:<ol>
<li>압력가 dH2O의 1 l DMEM 분말 1 봉지와 200 mm L-글루타민 (마지막 4 m m) 20 mL를 추가 하 고 부드럽게 그들을 믹스.</li>
		<li>생체 실험의 날, 포도 당 또는 지방산 기반된 호흡 분석 결과에서 사용 될 세포 외 유출 분석 결과 미디어의 후속 준비를 위한 준비 기저 미디어를 100 µ M 나트륨 pyruvate를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>포도 당 기반 미디어 준비:<ol>
<li>분해를 통해 세포 호흡 능력을 측정 하기 위해 기저 미디어 단계 1.9에서에서 위에서 설명한 17.5 m m 포도 당 분말, 100 µ M 제어 BSA (에 설명 된 대로 단계 1.7), 및 (지방산 산화를 억제)를 20 µ M etomoxir을 추가 합니다.</li>
		<li>37 ° C에서 미디어를 warm, pH 7.4 조정 하 고 그것은 세포 외 유출 분석 결과에서 사용 될 때까지 37 ° C 물 욕조에 그것을 유지.</li>
	</ol>
</li>
	<li>지방산에 기초를 둔 미디어 준비:<ol>
<li>지방산 산화를 통해 세포 호흡 능력을 측정, 추가 10 mM 2D 포도 당 분말 (포도 당 분해를 억제 하기 위해 아날로그), 100 µ M L-carnitine 기저 미디어 단계 1.9에서에서 위에서 설명한 팜-BSA (에서 설명한 단계와 1.8), 및 100 µ M.</li>
		<li>37 ° C에서 미디어를 warm, pH 7.4를 조정 하 고 그것은 세포 외 유출 분석 결과에서 사용 될 때까지 37 ° C 물 욕조에 그것을 유지.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 관류, 소화와 쥐에서 신장 수확
<ol><li>Anesthetize isoflurane 흐름 마우스 및 부정사 위치에 수정. 고립만 동물의 righting 반사 손실 후에 마 취 깊이 핀치 평가 전과 절차22중 atraumatic 집게를 사용 하 여 모니터링 시작 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>모피, 그것의 복 부 영역에 마우스의 가슴에서 depilatory 크림을 사용 하 여 제거, 요오드, 소독 하 고 요오드 잔여물을 닦아.</li>
	<li>절 개 가슴에, 전체 복 부 영역을 열고 하는 피부를 잘라 만들고 심장 및 신장 노출.</li>
	<li>32 mL/min에서 관류 펌프 고에 튜브는 관류를 시작 하기 전에 모든 거품을 제거 합니다.</li>
	<li>버퍼는 마음을 채우고 자 마자 심장 꼭대기를 통해 좌 심 실에 27 G 바늘을 삽입 하 고 찌를 관류 버퍼 심장 펌프도 순환 하 고 결국 오른쪽 아 트리 움 출구에서 제거 되 면 출구를 만들려고 오른쪽 아 트리 움.</li>
	<li>재 관류 후 30 mL/min 소화 펌프 속도 전환.</li>
	<li>소화의 20 mL 후 버퍼 꼭대기 통해 끼얹는다는, 둘 다 신장 관 세포 격리에 대 한 제거.</li>
</ol>3. 조직 처리 및 기본 관 세포 격리
<ol><li>신장 캡슐과 수 질을 제거 하 고 작은 조각으로 모두 신장 말하다 부드러운 회전 5 분 동안 37 ° C 오븐에서 소화 버퍼의 10 ml에서 그들을 품 어.</li>
	<li>70 μ m 필터를 통해 버퍼를 전달 하 여 어떤 소화 되지 않은 신장 조직을 제거 합니다. 소화를 막으려고 문화 미디어의 10 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>관 세포를 수집, 필터링 된 셀 서 스 펜 션 5 분 첫 번째 펠 릿 수집 50 x g에서 원심. 새로운 튜브에는 상쾌한을 전송 하 고 배양 기, 원심 분리기 관의 모든 셀을 보장 하기 위해 5 분 동안 50 x g에서 두 번째 펠 릿으로 수집의 5 mL을 추가. 원심 분리는 주로 작은 무거운 tubules를 낮은 속도로. 나중에, 세포는 고립에서 복구, 후 순수 관 문화는 높은 속도에서 하위 문화 중 centrifuged.</li>
	<li>문화 미디어의 20 ml에서 첫 펠 릿을 resuspend 하 고 수집 3 펠 릿을 5 분 동안 50 x g에서 원심.</li>
	<li>문화 미디어의 1 mL에 두 번째 및 세 번째 펠 릿을 resuspend. Trypan 파랑의 10 µ L로 세포 현 탁 액의 혼합 10 µ L A 세 슬라이드와 기록 자동에서 세포 생존 세포 카운터 ( 재료의 표참조)의 챔버로 혼합물을 로드 합니다.</li>
	<li>씨앗 107 셀 (이종 인구) 한 60 mm 접시에까지 미리 콜라겐으로 코팅 하 고 하룻밤 연결 관 세포.</li>
</ol>4. 주 관 세포 하위 문화 및 특성화
<ol><li>분리 후 1 일 문화 미디어를 수집 하 고 어떤 부동 tubules를 펠 렛을 5 분 동안 50 x g에서 원심. 상쾌한을 제거 하 고 신선한 문화 미디어와 같은 문화 접시에 다시 접시의 4 mL에 셀 펠 릿 resuspend.</li>
	<li>하루에 4 분리 하 여 후, 오래 된 문화 미디어를 제거 하 고 신선한 미디어 추가.</li>
	<li>격리 후 7 일에 0.25 %trypsin-EDTA 반응을 중지 하 고 5 분 동안 250 x g에서 원심 분리 하 여 세포를 수집 문화 미디어의 5 분 추가 3 ml 2 mL에 37 ° C에서 배양 하 여 세포를 분리 합니다.</li>
	<li>하위 문화 및 p1 P0에서 셀 특성, 24-잘 접시에 잘 당 씨 5000 셀 코팅 콜라겐과 내가 위에서 설명한 대로.</li>
	<li>단계 4.4 후 24 h 4% p 1에서 셀을 수정 10 분, PFA 0.2% 그들을 permeabilize Triton X-100 3 분, 실 온에서 1 h에 대 한 10% 당나귀 혈 청 (DS)와 그들을 차단.</li>
	<li>희석, 1: 100에 10%를 각각 다음 단백질의 DS: 인접 관 마커 angiotensinogen (AGT)와 aquaporin 1 (AQP1); 원심 관 마커 E-cadherin; mesangial 마커 CD90/Thy1; 그리고 대 식 세포 마커 EGF 같은 모듈 포함 하 mucin 같이 호르몬 수용 체-1 (f 4/80) 및 차별화 68의 클러스터 (CD68), 그리고 같은 4 ° c.에 하룻밤 세포와 그들을 품 어</li>
	<li>다음날, 검출 어떤 얼룩을 사용 하 여 1: 200-토끼, 반대로 마우스, 또는 반대로 쥐 형광 이차 항 체 45 분. 그림 2A와 같이 마커의 식을 확인 하는 confocal 현미경 검사 법에서 이미지를 걸릴.</li>
	<li>3 일, p 1의 하위 문화 후에 단계 4.5에서에서 설명한 관, mesangial, 및 macrophage 마커 얼룩 하위 문화 및 p 2에서 특성화에 대 한 셀 분리 합니다. 그림 2A와 같이 마커의 식을 확인 하는 confocal 현미경 검사 법에서 얼룩 이미지.</li>
	<li>다음날 3 p 2의 하위 문화에 4.5 단계에서 설명한 관, mesangial, 및 macrophage 마커 얼룩 하위 문화와 특성화 P3에 대 한 셀 분리 합니다. 그림 2A와 같이 마커의 식을 확인 하는 confocal 현미경 검사 법에서 얼룩 이미지.</li>
	<li>조직 얼룩 준비:<ol>
<li>냉동된 야생-타입 및 실 온에서 1 h에 대 한 Col4a3-/- 신장 슬라이드 건조 하 고 그들을 수정 4%와 10 분 대 한 PFA Permeabilize 그들 0.2% 트라이 톤 X-100 10 분 동안 실 온에서 1 h에 대 한 10% 당나귀 혈 청 (DS)와 그들을 차단 하 고. 1: 200에서 4.5 단계에서 설명한 마커 단백질에 대 한 항 체를 추가 하 고 4 ° C에서 밤새 그들을 품 어.</li>
		<li>다음 날, 1: 200-토끼, 반대로 마우스, 또는 반대로 쥐 형광 이차 항 체 45 분으로 어떤 얼룩을 감지 합니다. 그림 2B 와 2c마커의 식을 확인 하는 confocal 현미경 이미지를 가져가 라.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 미토 콘 드리 아 생체 분석 결과
<ol><li>20000, 30000, 또는 96-잘 microplate에 문화 미디어의 100 μ에 잘 당 40, 000 셀 씨 P1 관 세포 중 코팅 5 μ g/c m2 콜라겐과 난 세포 외 유출 분석 실험 전날.</li>
	<li>센서 카트리지 수 화에 대 한 센서 카트리지 들어올린 각 채우기 교정 솔루션의 200 μ와 접시의 잘. 신중 하 게 카트리지를 로드 다시 교정 솔루션에 센서를 잠수함. 적어도 사용 전에 h 7에 대 한 CO2 없이 37 ° C 오븐에 카트리지를 넣습니다. 최상의 결과 얻으려면 하룻밤 카트리지 수 화 것이 좋습니다.</li>
	<li>화합물을 준비: 8 µ M oligomycin, 9 µ M FCCP, 그리고 포도 당 (1.10 단계에서 설명)과 지방산 (에서 설명한 단계 1.11) 세포 외 유출 분석 결과 미디어에서 20 µ M로 테 논/antimycin A 혼합 준비.</li>
	<li>미디어 변경: 셀 문화 미디어 발음, 포도 당 또는 지방산 분석 결과 미디어의 175 µ L 추가 (은 화합물에 따라, 근무 중인 단계 참조 5.3), 고 37 ° C 공동2에서 1 시간에 대 한 그들을 품 어-무료 보육.</li>
	<li>다음 화합물의 25 µ L 카트리지 포트 로드: 8 μ M oligomycin 포트 A 1 µ M의 최종 농도 달성 하기 위한 (참고: 각 잘 미디어의 175 µ L 포함 됩니다, 화합물 희석된 8 얻을 것 이다 x), 9 μ M 1의 최종 농도 달성 하기 위해 포트 B FCCP µ M (참고: 화합물 희석된 9를 얻을 것 이다으로 각각 잘 포함 미디어의 175 µ L 플러스 포트 A에서 주입 솔루션의 25 µ L, x), 그리고 20 µ M로 테 논/antimycin A 포트 C (참고 각 화합물에 대 한 2 µ M의 최종 농도 달성 하기에 : 화합물 희석된 10를 얻을 것 이다 미디어의 175 µ L 플러스 50 µ L A와 B 포트에서 주입 하는 솔루션의 각 잘 포함 됩니다, x).</li>
	<li>포트 D에 있는 모든 우물과 배경 웰 스 (셀)의 다른 모든 포트에 물을 추가 합니다. 37 ° C 공동2카트리지를 품 어-10 분 동안 무료 보육.</li>
	<li>세포 외 유출 분석기와 컨트롤러를 켭니다.</li>
	<li>분석기 소프트웨어를 열고 다음 프로토콜을 입력:<ol>
<li>표준 분석 결과선택 합니다. 분석 결과 마법사를 누릅니다. 화합물 탭을 사용 하 여 복합 레이아웃을 할당 하 고 실험적인 그룹을 그룹 및 레이블 탭을 사용 하 여. 배경으로 (셀) 없이 빈 우물을 할당 하도록 하십시오.</li>
		<li>프로토콜 탭에서 표 1에 표시 된 대로 사용할 수 있는 명령을 사용 하 여 다음 믹스 및 측정 주기 설정: 보정, 믹스 2 분, 2 분, 대기 3 분을 위한 측정 (이 사이클을 반복이 2-3 배); 포트 A, 2 분 대 혼합을 주사, 2 분, 3 분에 대 한 측정에 대 한 대기 (이 주기 반복 2-3 배); 포트 B를 주입, 2 분 동안 혼합, 2 분, 3 분에 대 한 측정에 대 한 대기 (이 주기 반복 2-3 배); 포트 C를 주입, 2 분 동안 혼합, 2 분, 3 분에 대 한 측정에 대 한 대기 (이 사이클을 반복 2-3 배). 결국 마법사를 누릅니다. 그것은 또한 나중에 사용할 현재 서식 파일을 저장할 수입니다.</li>
		<li>보정을 시작 하려면 시작 을 누릅니다. 분석기 자동으로 배출 플레이트 홀더 그리고 카트리지 플레이트를 삽입에 대 한 요청.</li>
	</ol>
</li>
	<li>교정 단계 이루어집니다 (일반적으로 20-25 분), 셀 접시에 카트리지 플레이트를 변경 하 고 실행을 계속 하려면 프롬프트 명령을 누릅니다.</li>
	<li>실행이 완료 되 면 데이터를 전송 하 고 96 잘 접시를 제거 합니다. 분석 결과 우물의 각 Hoechst (1:1, 000)를 추가 하 고 37 ° c.에 5 분 동안 그들을 품 어 355 nm 여기와 460 nm 방출에서 읽고 Hoechst 형광의 측정에 의해 세포 수를 OCR 데이터를 정상화.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bielesz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+notch+signaling+regulates+interstitial+fibrosis+development+in+the+kidneys+of+mice+and+humans.">Epithelial notch signaling regulates interstitial fibrosis development in the kidneys of mice and humans.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (11), 4040-4054 (2010).</li><li>Fabian, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog-Gli+pathway+activation+during+kidney+fibrosis.">Hedgehog-Gli pathway activation during kidney fibrosis.</a> American Journal of Pathology. 180 (4), 1441-1453 (2012).</li><li>Forbes, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria-power+players+in+kidney+function.">Mitochondria-power players in kidney function.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 27 (7), 441-442 (2016).</li><li>Suzuki, T., Furusato, M., Takasaki, S., Ishikawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+mitochondria+in+the+epithelial+cells+of+the+proximal+convoluted+tubules+of+diseased+human+kidneys.">Giant mitochondria in the epithelial cells of the proximal convoluted tubules of diseased human kidneys.</a> Laboratory Investigation. 33 (6), 578-590 (1975).</li><li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+accounts+for+aldosterone-induced+epithelial-to-mesenchymal+transition+of+renal+proximal+tubular+epithelial+cells.">Mitochondrial dysfunction accounts for aldosterone-induced epithelial-to-mesenchymal transition of renal proximal tubular epithelial cells.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 53 (1), 30-43 (2012).</li><li>Kang, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+fatty+acid+oxidation+in+renal+tubular+epithelial+cells+has+a+key+role+in+kidney+fibrosis+development.">Defective fatty acid oxidation in renal tubular epithelial cells has a key role in kidney fibrosis development.</a> Nature Medicine. 21 (1), 37-46 (2015).</li><li>Al-Awqati, Q., Oliver, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+the+kidney.">Stem cells in the kidney.</a> Kidney International. 61 (2), 387-395 (2002).</li><li>Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rAAV9+combined+with+renal+vein+injection+is+optimal+for+kidney-targeted+gene+delivery:+conclusion+of+a+comparative+study.">rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: conclusion of a comparative study.</a> Gene Therapy. 21 (6), 618-628 (2014).</li><li>Kamiyama, M., Garner, M. K., Farragut, K. M., Kobori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+establishment+of+a+primary+culture+system+of+proximal+tubule+segments+using+specific+markers+from+normal+mouse+kidneys.">The establishment of a primary culture system of proximal tubule segments using specific markers from normal mouse kidneys.</a> International Journal of Molecular Sciences. 13 (4), 5098-5111 (2012).</li><li>Terryn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primary+culture+of+mouse+proximal+tubular+cells,+established+on+collagen-coated+membranes.">A primary culture of mouse proximal tubular cells, established on collagen-coated membranes.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 293 (2), F476-F485 (2007).</li><li>Tang, M. J., Suresh, K. R., Tannen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbohydrate+metabolism+by+primary+cultures+of+rabbit+proximal+tubules.">Carbohydrate metabolism by primary cultures of rabbit proximal tubules.</a> American Journal of Physiology. 256, C532-C539 (1989).</li><li>Gesek, F. A., Wolff, D. W., Strandhoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+separation+method+for+rat+proximal+and+distal+renal+tubules.">Improved separation method for rat proximal and distal renal tubules.</a> American Journal of Physiology. 253, F358-F365 (1987).</li><li>Vinay, P., Gougoux, A., Lemieux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+pure+suspension+of+rat+proximal+tubules.">Isolation of a pure suspension of rat proximal tubules.</a> American Journal of Physiology. 241 (4), F403-F411 (1981).</li><li>Taub, M., Chuman, L., Saier, M. H., Sato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Madin-Darby+canine+kidney+epithelial+cell+(MDCK)+line+in+hormone-supplemented,+serum-free+medium.">Growth of Madin-Darby canine kidney epithelial cell (MDCK) line in hormone-supplemented, serum-free medium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (7), 3338-3342 (1979).</li><li>Chung, S. D., Alavi, N., Livingston, D., Hiller, S., Taub, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primary+rabbit+kidney+cultures+that+express+proximal+tubule+functions+in+a+hormonally+defined+medium.">Characterization of primary rabbit kidney cultures that express proximal tubule functions in a hormonally defined medium.</a> Journal of Cell Biology. 95 (1), 118-126 (1982).</li><li>Rubera, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloride+currents+in+primary+cultures+of+rabbit+proximal+and+distal+convoluted+tubules.">Chloride currents in primary cultures of rabbit proximal and distal convoluted tubules.</a> American Journal of Physiology. 275, F651-F663 (1998).</li><li>Inoue, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+cultured+tubular+cells+isolated+from+human+urine+for+investigation+of+renal+transporter.">Use of cultured tubular cells isolated from human urine for investigation of renal transporter.</a> Clinical Nephrology. 53 (2), 90-98 (2000).</li><li>Van der Hauwaert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+a+primary+proximal+tubular+epithelial+cell+model+from+human+kidney+by+CD10/CD13+double+labeling.">Isolation and characterization of a primary proximal tubular epithelial cell model from human kidney by CD10/CD13 double labeling.</a> PLoS One. 8 (6), e66750 (2013).</li><li>Helbert, M. J., Dauwe, S. E., Van der Biest, I., Nouwen, E. J., De Broe, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodissection+of+the+human+proximal+nephron:+flow+sorting+of+S1S2S3,+S1S2+and+S3+proximal+tubular+cells.">Immunodissection of the human proximal nephron: flow sorting of S1S2S3, S1S2 and S3 proximal tubular cells.</a> Kidney International. 52 (2), 414-428 (1997).</li><li>Wen Ding, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteopontin+deficiency+ameliorates+Alport+pathology+by+preventing+tubular+metabolic+deficits.">Osteopontin deficiency ameliorates Alport pathology by preventing tubular metabolic deficits.</a> JCI Insight. 3 (6), (2018).</li><li>Quadri, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoride-associated+ultrastructural+changes+and+apoptosis+in+human+renal+tubule:+a+pilot+study.">Fluoride-associated ultrastructural changes and apoptosis in human renal tubule: a pilot study.</a> Human &amp; Experimental Toxicology. , (2018).</li><li>Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+three+types+of+mixed+anesthetic+agents+alternate+to+ketamine+in+mice.">Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice.</a> Experimental Animals. 60 (5), 481-487 (2011).</li><li>Condorelli, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+fluid+shear+stress+on+tubular+kidney+epithelial+cell+structure.">Effect of fluid shear stress on tubular kidney epithelial cell structure.</a> World Congress on Medical Physics and Biomedical Engineering. 25 (10), 50-52 (2009).</li><li>Aschauer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delineation+of+the+key+aspects+in+the+regulation+of+epithelial+monolayer+formation.">Delineation of the key aspects in the regulation of epithelial monolayer formation.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (13), 2535-2550 (2013).</li><li>George, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+use+of+autologous+renal+cells+from+diseased+kidneys+for+the+treatment+of+renal+failure.">Potential use of autologous renal cells from diseased kidneys for the treatment of renal failure.</a> PLoS One. 11 (10), e0164997 (2016).</li><li>Elberg, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MKL1+mediates+TGF-beta1-induced+alpha-smooth+muscle+actin+expression+in+human+renal+epithelial+cells.">MKL1 mediates TGF-beta1-induced alpha-smooth muscle actin expression in human renal epithelial cells.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 294 (5), F1116-F1128 (2008).</li><li>Elberg, G., Guruswamy, S., Logan, C. J., Chen, L., Turman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+epithelial+cells+derived+from+human+normal+and+ADPKD+kidneys+in+primary+cultures.">Plasticity of epithelial cells derived from human normal and ADPKD kidneys in primary cultures.</a> Cell and Tissue Research. 331 (2), 495-508 (2008).</li><li>Cai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+of+acetaminophen,+salicylic+acid,+and+caffeine+for+first-passage+rat+renal+inner+medullary+collecting+duct+cells.">Toxicity of acetaminophen, salicylic acid, and caffeine for first-passage rat renal inner medullary collecting duct cells.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 306 (1), 35-42 (2003).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+epithelial+co-culture+of+mouse+renal+peritubular+endothelial+cells.">Isolation and epithelial co-culture of mouse renal peritubular endothelial cells.</a> BMC Cell Biology. 15, 40 (2014).</li><li>Barros, M. H., Hauck, F., Dreyer, J. H., Kempkes, B., Niedobitek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+polarisation:+An+immunohistochemical+approach+for+identifying+M1+and+M2+macrophages.">Macrophage polarisation: An immunohistochemical approach for identifying M1 and M2 macrophages.</a> PLoS One. 8 (11), e80908 (2013).</li><li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+Alport+kidney+disease+in+Col4a3+knock+out+mice+is+independent+of+sex+or+macrophage+depletion+by+clodronate+treatment.">Progression of Alport kidney disease in Col4a3 knock out mice is independent of sex or macrophage depletion by clodronate treatment.</a> PLoS One. 10 (11), e0141231 (2015).</li><li>Linnett, P. E., Beechey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+the+ATP+synthethase+system.">Inhibitors of the ATP synthethase system.</a> Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).</li><li>Bockenhauer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+phenotype+in+Lowe+Syndrome:+a+selective+proximal+tubular+dysfunction.">Renal phenotype in Lowe Syndrome: a selective proximal tubular dysfunction.</a> Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 3 (5), 1430-1436 (2008).</li><li>Ranawaka, R., Dayasiri, K., Gamage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+child+with+distal+(type+1)+renal+tubular+acidosis+presenting+with+progressive+gross+motor+developmental+regression+and+acute+paralysis.">A child with distal (type 1) renal tubular acidosis presenting with progressive gross motor developmental regression and acute paralysis.</a> BMC Research Notes. 10 (1), 618 (2017).</li></ol>

저자는 선언할 수 없다.

우리 마우스 신장 관 상피 세포 (TECs)의 효율적인 절연을 허용 하는 프로토콜을 최적화 하 고 그 셀 하위 존재 지방산-미토 콘 드리 아 호흡을 평가 하는 세포 외 유출 분석에 대 한 교양 있을 수 있습니다 보였다 또는 포도 당-기반 기판입니다. 이 프로토콜 인접 및 원심 관 세포에 초점을 맞추고 연구 설계 및 TEC 병리학 관련 신장 질병의 이해에 대 한 더 복잡 한 실험을 구축 하는 프레임 워크 역할. 이전에 게시 프로토콜9,,1019에 비해,이 필요 하지 않습니다 긴 원심 분리 시간 또는 충분 한 항 체 사용 그라데이션 분판을 정렬 방법과, 따라서, 더 많은 제공 합니다. 신장 관 대사 분야에서 일 하는 연구원에 대 한 효율적이 고 최적화 된 가이드. 소화, 다시 컬렉션 및 도금 밀도 세포 외 유출 분석 결과 대 한 복합 최적화를 포함 하 여이 프로토콜에 몇 가지 중요 한 단계가 있다.
콜라와 최적 농도의 올바른 유형을 선택 신장 조직에서 성공적인 소화 관 세포의 분리에 열쇠 이다. Collagenases의 다른 종류에 비해, 2 형 콜라 효소 활동, 소형 신장 구조를 해리의 능력의 상대적으로 높은 수준을 포함 합니다. 장기 관류와 소화 시간 오염 가능성을 최소화 하려면 0.013 %2 형 콜라는 30 mL/min에 끼얹는다. 신장 캡슐 두 신장 동물에서 수확 하 고 멸 균된 셀 문화 후드로 전송 했다 후에 제거 되었다. 신장 작은 조각으로 다진 했다 고 소화 버퍼를 완전 한 소화 관 세포의 최대한 출시에 대 한 또 다른 5 분의 10 mL와 함께 그들의 부 화를 계속 했다.
하지만, 소화, 후 조직 정지는 매우 큰 조직 조각을 제거를 70 µ m 필터를 통해 전달 됩니다, 아직 소화 되지 않은 tubules 필터를 통과 하 고 세포 현 탁 액 내 문화 접시에 도금을 얻이 있을 것입니다. 그것은 이러한 tubules를 관 세포를 문화 접시를 단단히 연결에 대 한 정상 보다 더 긴 시간이 걸립니다. 따라서, 세포 현 탁 액을 수집 하 여 작은 첨부 되지 않은 tubules 및 셀 셀 도금 후 두 번째 날을 원심 오히려 중요 하다. 이 저속 원심 분리 단계는 더 관 세포 보다는 다른 세포 유형 제거 하 고 첨부 되지 않은 tubules 및 관 세포 정착.
적절 한 셀 밀도의 식별 성공적인 세포 외 유출 분석 결과 대 한 첫 번째 주요 단계입니다. 결과 XF96 microplate에 잘 당 40, 000 셀 기본 관 셀 지방산과 포도 당 기반 호흡 분석 결과 (그림 3C)에 대 한 이상적입니다 나타났다. 이 프로토콜에서 격리 된 관 세포 구절 1과 2에서 세포 외 유출 분석 결과 대 한 사용 되었다. 하위 3, 비록 그들이 유지 관 표식 (그림 2)와 (그림 3A), 생체 분석 실험에서 괜찮은 성능을 표현의 통로 2에 비해 감소 기저 호흡 수준을 보여주었다 통로를 경작 하는 세포 ( 그림 3C를 그림 3A 의 오른쪽 패널에서 OCR을 비교 하 여 표시). 이 감소는 (예를 들어 젊은 야생-타입 마우스에서 고립 된 사람) 실질적으로 건강 한 관 세포에 영향을 미치지 않을 수 있습니다. 그러나, 이미 저하 미토 콘 드리 아 호흡 CKD 마우스 모델에서 격리 하는 셀에 대 한 연구, 대 한 세포의 높은 구절 기저 호흡 세포 외 유출 분석 결과의 결과 영향을 미칠 것 이라고 더 감소를 발생할 수 있습니다. 연구에서 통로 1 및 보여준 높은 통로 2 기저 호흡 수준에서 세포, 실시. 따라서,이 프로토콜에 따라 모두 건강 하 고 병에 걸린 동물에서 분리 된 세포와 미토 콘 드리 아 호흡 연구에 대 한 이러한 두 초기 구절을 사용 하 여 것이 좋습니다. 통로 2에서 셀 통로 1 하위 문화 플럭스 분석 결과 대 한 충분 한 세포를 생성 하지 않습니다 경우 고려 사항으로가지고 아직도 한다. 생체 연구 뿐만 아니라 우리의 이전 연구 통로 3에 기본 TECs 단백질 및 RNA 연구 (데이터 표시 되지 않음) 화합물과 치료에 대 한 매우 유용한 수 있습니다 보여줍니다. 그 말했다 하 고, 좋습니다 조사 관 세포를 분리 하는이 프로토콜을 사용 하 여 다른 연구 응용 프로그램에 대 한 최적의 통로 선택 신중 하 게 해야 한다.
세포 외 유출 분석의 작동 원리 삽입 된 화합물과 호흡 사슬 복합물 및는 uncoupler의 효과 사이의 상호 작용을 기반으로 합니다. Oligomycin 복잡 한 V (ATP synthase)의 억제제 이며 ATP 연결 산소 소비와 미토 콘 드리 아 내 막32에 걸쳐 일반 양성자 누출을 극복 하는 데 필요한 산소 소비를 구별 하는 데 사용 합니다. FCCP 미토 콘 드리 아 막 잠재력을 방해 하 여 ATP 생산에서 산소 소비를 uncouples. 따라서, 그것은 그것은 멤브레인을 통해 양성자 전송 함으로써 ATP synthase에 의해 양성자 이온 경과의 제한 된 용량 circumvents로 최대한 호흡 능력의 측정을 제공 한다. Antimycin-A, 복잡 한 III 억제제, 그리고로 테 논, 복잡 한 내가 차단, 허용은 미토 콘 드리 아 대 사이 감 별 법에 비-미토 콘 드 리아 산소 소비 전체 미토 콘 드리 아 호흡을 조합에서 이용 된다 셀입니다. 이 화합물은 최적의 OCR 곡선을 생성 하는 최적의 농도 결정 하는 세포 외 유출 분석 결과 전에 특정 셀 형식에 대 한 항상 적정 한다. 여기, oligomycin, FCCP의 1 개의 µ M 그리고로 테 논/antimycin A 기본 TECs에 세포 외 유출 분석 결과 대 한의 2 µ M의 1 µ M이 좋습니다.
결론적으로,이 프로토콜에는 신장 주 근 및 원심 관 상피 세포 미토 콘 드리 아 생체 비보 전평가에 사용할 수 있는 격리 하는 간단 하 고 비용 효율적인 방법을 제공 합니다. 이 프로토콜은 신장 관 상피 세포의 생물학 기능을 탐구 하는 분자 생물학 연구의 넓은 범위에서 유용할 수 있습니다, 우리 순수 인접 또는 원심 tubules를 필요로 하는 연구에 적용의 한계 인정 합니다. 예를 들어 로우 증후군, 선택적인 근 관 부전33또는 원심 신장 관 산 성 증, 원심 관 부전34에 대 한 연구에 대 한 연구 필요 더 정교한 프로토콜 셀 격리 및 정화입니다. 그러나, tubules 대 glomeruli, 비교 연구의 대다수 및 연구 관 세포에 잠재적인 미토 콘 드리 아 호흡 레 귤 레이 터를 일반적으로 화면에 가능한 높은 처리량 접근을 프로토콜에 제공 합니다. 따라서,이 프로토콜 광범위 한 응용 프로그램에서 미토 콘 드리 아 역 기능 약물 발견 또는 대상 유효성 검사 목적으로 신장 장애와 관련 된 공부를 할 수 있습니다.

신장 관 상피 세포 (TEC) 기능 신장의 전반적인 건강 상태와 강하게 연결 됩니다. 신장에 병 적인 신호 신장 섬유 증 및 만성 신장 병 (CKD)1,2에서 중요 한 역할을, TECs dedifferentiation을 발생 합니다. 높게 정력적 인 기관으로 신장은 주로 미토 콘 드 리아 산화 인 산화3통해 산소 소비량, 심장에만 두 번째. 전자 현미경 연구는 미토 콘 드 리아 형태학 변화 신장 tubules4병 적인 이벤트의 긍정적인 상관 관계를 밝혀 있다. TECs 미토 콘 드 리아 장애 신장 섬유 증에 엽 상피 전환5 와 불완전 지방산 산화6통해 발생합니다. 섬유 증은 CKD 귀착되는 진보적인 신장 병 리 이다. 따라서, 신장 TECs의 에너지 상태를 이해 CKD의 이상 발견 하는 필요 이다.
성인 신장7> 20 종류 있다. TECs의 기능을 공부, 신장 상피 세포의 기본 문화 화학 치료 및 유전자 조작 등 분자 생물학 응용 프로그램을 위한 플랫폼으로 필요 하다. 중요 한 것은, 유전자 조작은 vivo에서 쥐 transgenesis 또는 고립 된 주 세포 유전자 조작 이미 것 있도록 AAV 유전자 전달 기법8 을 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 마우스9,10, 쥐11,,1213,14개, 토끼15,16및 인간17에서 기본 신장 관 세포의 고립 ,18 순수 근 관 세포를 정화 단계와 보고 되었습니다. 이 이전에 게시 프로토콜 인접 관 세포의 고립에 초점을, 그라데이션 원심 분리 및 실험 정렬 정화 목적으로19수행 했다. 이러한 프로토콜 인접 tubules 공부에 대 한 귀중 한 동안, 그들은 충분 하지 않습니다 인접 및 원심 tubules 공부 하는 데 필요한 때. 예를 들어 Alport 증후군에 대 한 우리의 연구는 인접 및 원심 신장 tubules20질병 진행 중요 한 역할을 따라서 신장 tubules의 두 종류 문화 조사 한다 밝혔다. 신장 불 화물 독성에 대 한 최근 연구는 또한 병리학 변화 모두는 근 위 및 원심 tubules21에서 개최 했다 다는 것을 보여주었다. 따라서,이 격리 프로토콜 설계 및 시 약 및 간단한 절차의 최소한의 비용으로 마우스 신장에서 인접 하 고 원심 관 세포에 대 한 최적화. 또는 수 사관 수 여전히 프로토콜 단계 3.1까지 따라 하 고 순수한 근 관 세포의 고립에 대 한이 시점에서 정화 단계9 를 추가.
고립 된 세포 높은 에너지 레벨을 제시 하 고 4 구절에 하위 문화 후 신장 상피 특성을 유지. 높은 처리량 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여, 우리 셀 밀도 최적화로 더 통찰력에 이르게는 96 잘 접시에서 격리 TECs에서 직접 미토 콘 드리 아 호흡을 평가 합니다. 이러한 관찰이이 프로토콜 신장 TECs의 일관 된, 잘 표준화 된 생산 신장 관 ex vivo 연구에 적용할 수 있는 것이 좋습니다. 이 프로토콜의 추가 의미 신장 근 위 및 원심 관 세포에서 미토 콘 드리 아 생체 ex vivo 특성에 대 한 높은 처리량 도구로 그것의 가능한 사용 이다. 따라서, 그것은 약물 발견 또는 신장 질환의 약물 특성화 목적을 위한 플랫폼으로 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Collagen I Rat Protein, Tail</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1048301</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid</td><td>J.T.Baker</td><td>9508</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type II</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Renal Epithelial Cell Growth Medium 2 Kit</td><td>PromoCell</td><td>C-26130</td><td></td></tr><tr><td>2-Deoxy glucose</td><td>Sigma</td><td>D6134</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>L-Carnitine</td><td>Sigma</td><td>C0283</td><td></td></tr><tr><td>Etomoxir</td><td>Sigma</td><td>E-1905</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycin</td><td>Sigma</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Antimycin-A</td><td>Sigma</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Sodium palmitate</td><td>Sigma</td><td>P9767</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Sigma</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 200mM solution</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>DMEM powder</td><td>Sigma</td><td>D5030-1L</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>LifeTechnologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Staining (0.4%)</td><td>LifeTechnologies</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Counting Slides</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissecting Forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-5101</td><td></td></tr><tr><td>TC10 automated cell counter</td><td>Bio-Rad</td><td>506BR2119</td><td></td></tr><tr><td>MINIPULS 3 Peristaltic Pump</td><td>Gilson Inc.</td><td>GM3P</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 Analyzer</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>S7800A</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPack (includes sensor cartridges, microplates, and calibrant)</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>10260-100</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation, characterization, and high throughput extracellular flux analysis of mouse primary renal tubular epithelial cells

신장 관 상피 세포 (TECs)에서 미토 콘 드 리아 기능 장애는 신장 섬유 증, 만성 신장 병 (CKD)의 주요 원인으로 이어질 수 있습니다. 따라서, 기본 TECs 미토 콘 드 리아 기능 평가 CKD의 이상에 대 한 통찰력을 제공 하는 셀의 bioenergetic 상태에 귀중 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 분리와 다른 종에 인접 tubules의 정화 하는 데 사용할 수 있는 복잡 한 프로토콜 수 있지만, 필드 정화에 대 한 필요 없이 관 세포 격리에 대 한 최적화 된 비용 효율적인 방법을 결여 된다. 여기, 우리는 두 주에 초점을 맞추고 연구 인접 하 고 원심 신장 TECs 마우스에 대 한 수 있는 격리 프로토콜을 제공 합니다. 비용 효과적인 시 약 및이 프로토콜에 필요한 최소한의 동물 절차, 고립 된 세포 격리 후 높은 에너지 레벨을 유지 하 고 하위 4 구절, 지속적인 연구에 대 한 허용 최대 경작 될 수 있다. 또한, 우리는 우리 세포 밀도 및 화합물 농도의 최적화에 대 한 권장 사항을 제공 96 잘 접시에 격리 TECs에서 직접 미토 콘 드리 아 호흡을 평가 높은 처리량 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여. 이러한 관측 신장 TECs의 일관 된, 잘 표준화 된 생산 신장 관 ex vivo 연구이 프로토콜을 사용할 수 있는 것이 좋습니다. 이 프로토콜은 광범위 한 미래의 응용 프로그램에서 약물 발견 또는 마약 특성화 목적에 대 한 신장 장애와 관련 된 미토 콘 드 리아 기능 장애 연구 할 수 있습니다.

신장 관류 및 소화 얻을 매우 가능한 관 상피 세포: 마우스 신장 관 상피 세포 격리 프로토콜 위에서 설명한 섹션 1-3에에서 설명 된 단계를 따라 했다.
소화, 후 신장 세포, 불완전 하 게 소화 tubules 및 70 µ m 보다 작은 다른 조직 파편의 이종 인구 격리 당일 문화 접시에 도금 했다. 변경 0 1 일 후 격리 보통 셀 첨부 파일에만 아니라 세포 성장에 볼 것으로 예상 됩니다. 부동 이기종 인구 통해 찾고 몇 관 셀만 하루 1 (그림 1A)에 붙어 있었다. 하루 1 셀, 원심 분리, 그리고 다시 도금의 다시 컬렉션 가벼운 파편을 제거 하 고 관 셀 릴리스에 대 한 작은 관 조각 정착을 도움. 3 일에 1 일에서 더 나은 셀 첨부 파일 뿐만 아니라 (그림 1A) 1 일에 비해 3 배 세포 밀도와 관찰 되었다 눈에 띄게 향상 된 세포 성장 율에 변화가 예상 했다. 초기 성장 단계에서 셀 여러 식민지를 형성 하 고 식민지 주위 채워집니다. 이 시점에서 앞으로, 격리 된 세포 완 치 했다 고 건강 한 확산을 표시. 일별 5 셀 셀 셀 및 식민지 식민지 사이의 일부 공백을 60 mm 페 트리 접시에 80-90 %confluency (그림 1A) 했다.
하위 문화와 격리 된 관 세포의 특성: 격리 된 신장 관 상피 세포 하위 특성 다음 단계는 위에서 설명한 프로토콜의 섹션 4에에서 명시 된에 대 한 교양 했다.
5 일에서 셀 완전히 고립에서 발견 하 고 적극적으로 확산 하기 시작 했다. 1 주일 후 격리, 셀 60 mm 페 트리 접시에 confluency 되었다. 1 주일 후 통로 0에 문화에서 셀 통로 1 하 고, 그 후, 2 더 많은 구절을 하위 경작 될 준비 했다. 비슷한 성장 패턴 1 통로 및 통로 2에서 관찰 되었다. 일반적으로, 그것은 1과 2 추가 하위 문화 (그림 1B)에 대 한 confluency 성장에 통로에 셀에 대 한 1 주일 미만 걸립니다. Confluent 셀 통로 0에서 통로 2는 광범위 한 돔 형성23,24 (그림 1B), 고립 된 세포를 건강 한 유지 하는 것을 건의 했다 상태로 어디 그들은 비슷한 액체를 배설의 지속적인 문화 하는 비보에 상태. 이 접시에서 리프트 하지만 꽉 연결을 통해 연결 상태를 유지 하는 세포의 단층을 발생 합니다.
문화에 있는 세포의 특성, 우리는 immunofluorescent 얼룩이 지는 제어 셀 라인-인간 근 신장 상피 홍콩-2 셀에 뿐만 아니라 통로 4를 통해 통행 1에서에서 경작된 한 세포에 수행 합니다. 근 관 마커, aquaporin 1 (AQP1)25 및 angiotensinogen (AGT)9, 원심 관 마커 E cadherin25, 상피 마커 부드러운 근육 걸 (SMA)26,27,28, 대 식 세포 마커 F4/8029 와 CD6830, 그리고 mesangial 마커 thymocyte 차별화 항 1 (Thy1/CD90)9 특성 연구를 위해 사용 되었다. 두 근 관 단백질 AQP1 및 AGT 일관 되 게 높은 긍정적인 제어 홍콩 2 근 상피 세포 (그림 2A)에서 통로 4도 1 통로에서 격리 된 관 세포에 표현 되었다. 원심 관 단백질 E cadherin 통로 4 통해 격리 된 관 세포에 표현 하 고 또한 홍콩-2 셀 (그림 2A)에서 관찰 되었다. SMA는 제어 홍콩-2 셀, 게시 된 보고서26,27일치에 격리 된 관 세포에 풍부 하 게 표현 했다. 다른 한편으로, mesangial 단백질 Thy1 및 대 식 세포 단백질 F4/80 결 석 했다 고립 된 관 세포에 제어 홍콩-2 셀 (그림 2A). CD68 홍콩-2 셀에는 최소한의 식 그리고 통로 1 및 통로 2, 그리고 그 표현에서 고립 된 관 세포에서 3 통과 통로 4 (그림 2A)에서 탐지 되었다. 결과이 프로토콜에 따라 고립 된 세포는 인접 하 고 원심 관 세포의 혼합 것이 좋습니다. 이러한 마커 단백질에서 생체 내에의 식을 비교 하려면 우리 냉동된 신장 조직에 얼룩 수행. 관 마커, 높은 표현 야생-타입 건강 한 마우스 (그림 2B)에서 수확 하는 신장에 발견 되었다 AQP1, AGT, 및 E-cadherin mesangial 단백질 Thy1를 포함 하 여. F4/80 및 CD68의 낮은 표현 야생-타입 신장에서 관찰 하지만 신장 신장 실패는 대 식 세포 침투20,31 ( 를 개발 Col4a3-/- 마우스에서 수확에 광범위 하 게 표현 그림 2C).
고립 된 주 관 세포에서 미토 콘 드리 아 생체 분석 결과: 미토 콘 드리 아 호흡 시험 단계는 위에서 설명한 프로토콜의 섹션 5에에서 설명 되어 있습니다.
고립 된 주 관 세포의 미토 콘 드리 아 호흡 산소 소비 속도 (OCR) 다른 도금 밀도에 한 세포 외 유출 분석에 의해 측정 됩니다. 도금 밀도 적정에 20000, 30000, 40000 기본 TECs 잘 당 했다 시드 96 잘 XF96 microplate에 하루 전에 (약 20 전에 h) 세포 외 유출 분석 결과 (그림 3A). 세포 외 유출 분석에 따라 OCR 측정 했다 다음 셀 카운트에 Hoechst 얼룩의 정량화에 의해 정규화 됩니다. 도금 TECs에 20000, 30000, 또는 40, 000 셀/잘 결과 25, 45, 또는 50 pmol/min의 평균 기저 OCR에 각각 (그림 3A). 또한, 도금된 세포의 현미경 이미지 공개 40, 000 셀/잘 적용 (그림 3B) 다른 도금 밀도 보다 더 미 판 우물의 바닥의 전체 표면. 최대한 OCR 30000 세포의 밀도에 비해 40, 000 셀을 사용 하 여 증가 하지 않았다, 비록 셀/잘 셀과 화합물 사이의 최적의 상호 작용을 위해 약 40, 000의 세포 밀도 권장 합니다.
또한, 우리의 실험에서 억제/uncoupler 화합물의 최적 농도 1 µ M oligomycin, 1 µ M FCCP와 2 µ M로 테 논/antimycin-A (세포 외 유출 분석 결과 및 포트 주사의 프로토콜 표 1에에서 나열 된 것으로 표시 했다 ; 최적화 실험 표시 되지 않습니다). 그러나,이 좋습니다 이상적으로 낮은 하 고 게시 된 값 보다 더 높은이 화합물의 다양 한 농도와 예비 테스트를 실행 하는 모든 사용자에 대 한 최상의 결과 보증 하기 위하여.
세포 외 유출 분석 결과 신장 TECs의 생체를 평가 하기 위한 중요 한 매개 변수를 생성 합니다. 예를 들어, 지방산 산화 특히 TECs에 결함이 있는 것 같이 지방산 기판 (물)의 분해 (2 DG) 억제제와 함께 포함 된 미디어의 사용으로 사용할 수 있습니다 직접 TECs에서 지방산 산화를 평가 하는 유용한 도구 구절 들 1, 2 (그림 3C)에서 신장 섬유 증의 경우 셀의 전반적인 호흡 용량 포도 당 기반 미디어 수 있습니다 어떤 차이 공개 하지도 건강 한 신장 보다 낮은 될 것으로 예상 된다.
함께 찍은, 세포 외 유출 분석 결과, 특히 지방산 산화 용량을 평가 하기 위해 이용 될 수 있다 신장 TECs 생체 프로 파일 재생에 영향을 미치는 어떤 병 적인 변화에의 에너지 상태를 평가 하는 유익한 수단으로는 주요 역할 신장 섬유 증과 신부전을 진행.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
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<td>단계</td>
			<td>시간 (분)</td>
		</tr>
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<td>보정</td>
			<td></td>
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<td>Equilibrate:</td>
			<td>00시 12분: 00</td>
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<td>측정 1</td>
			<td>3 루프</td>
		</tr>
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<td>믹스</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
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<td>대기</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
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<td>측정</td>
			<td>00시 03분: 00</td>
		</tr>
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<td>믹스</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
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<td>대기</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>측정</td>
			<td>00시 03분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>믹스</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
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<td>대기</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
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<td>측정</td>
			<td>00시 03분: 00</td>
		</tr>
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<td>주사 (1 μ M Oligomycin) 포트</td>
			<td>2 루프</td>
		</tr>
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<td>믹스</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
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<td>대기</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
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<td>측정</td>
			<td>00시 03분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>믹스</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>대기</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>측정</td>
			<td>00시 03분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>포트 B (1 μ M FCCP) 주사</td>
			<td>2 루프</td>
		</tr>
<tr>
<td>믹스</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>대기</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>측정</td>
			<td>00시 03분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>믹스</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>대기</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
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<td>측정</td>
			<td>00시 03분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>포트 C (2 μ M Rotenon/Antimycin)을 주사</td>
			<td>2 루프</td>
		</tr>
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<td>믹스</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>대기</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>측정</td>
			<td>00시 03분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>믹스</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
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<td>대기</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
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<td>측정</td>
			<td>00시 03분: 00</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1입니다. 기본 관 세포에 최적의 OCR 측정에 대 한 프로토콜을 실행 하는 세포 외 유출 분석 표준화.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57718/57718fig1.jpg"> 그림 1입니다. 세포 격리 된 기본 관 세포의 배양. (A) 격리 기본 관 셀 일찍 하루 1에서 연결 및 견고 하 게 3 일에서 5 일 성장. 10 X 20 X 목적과 이미지에서 가져옵니다. (B)이이 패널 통로 3에 통로 0에서 격리 된 기본 관 세포의 하위 문화를 보여줍니다. 10 배, 20 X 목표 셀 돔 및 형태학 상 변화는 구절을 통해의 비전에 대 한 40 X 목표 아래 비전에 대 한 이미지에서 가져옵니다. scalebar = 100 µ m. <a href="/files/ftp_upload/57718/57718fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57718/57718fig2.jpg"> 그림 2입니다. 고립 된 주 관 세포의 특성. (A) Immunostaining (AQP1, AGT) 근 관 단백질, 원심 관 단백질 (E-cadherin), 상피 단백질 (SMA), mesangial 단백질 (Thy1), 및 대 식 세포 단백질 (F4/80, CD68)에 대 한 항 체와 격리 된 주 쇼 관 세포 및 이후의 하위 문화는 순수 인접 하 고 원심 관 세포 이다. (B)이이 패널 긍정적인 제어 및 아니 기본 부정적인 제어로 근 관, 원심 관, 및 건강 한 야생-타입 마우스에서 신장 조직에서 mesangial 단백질의 얼룩을 보여줍니다. (C)이이 패널 긍정적인 컨트롤로 Col4a3-/- 마우스에서 수집 하는 신장 조직에서 대 식 세포 단백질 F4/80 및 CD68의 얼룩을 보여줍니다. Scalebar = 20 µ m. DAPI에서 파란색으로 표시 됩니다. 마커 단백질은 녹색으로 표시 됩니다. <a href="/files/ftp_upload/57718/57718fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57718/57718fig3.jpg"> 그림 3입니다. 다른 도금 밀도에 고립 된 주 관 세포 분석 결과 세포 외 유출. (A) 증가 세포 밀도 도금 향상 기본 관 세포에서 기저 호흡 레벨 통로 3에서 테스트. (B)이이 패널이 보여줍니다 현미경 기본 관 세포의 경작 20000, 30000, 40000 셀/잘 밀도에서 시드 XF96 microplate에. Scalebar = 100 µ m. (C)이이 패널 구절 2와 1에서 기본 관 세포에서 지방산 또는 포도 당-기반 세포 외 유출 분석 결과 보여줍니다. 데이터는 평균 ± SEM. <a href="/files/ftp_upload/57718/57718fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

마우스 기본 신장 관 상피 세포의 고립, 특성, 및 높은 처리량 세포 외 유출 분석

이 프로토콜에는 분리 하 고 마우스 기본 신장 관 세포 이후에 하위 신장 생물학 기능 비보 전, 미토 콘 드리 아 생체를 포함 하 여 평가 양식 수 있는 특성화 하는 비용 효율적인 접근 방식을 제공 합니다.

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

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Research

JoVE Journal

Biology

17.2K 조회수.  University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine. 이 프로토콜에는 분리 하 고 마우스 기본 신장 관 세포 이후에 하위 신장 생물학 기능 비보 전, 미토 콘 드리 아 생체를 포함 하 여 평가 양식 수 있는 특성화 하는 비용 효율적인 접근 방식을 제공 합니다.

비디오: Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and podocytes with their slit diaphragms. The delicate structure of the glomerular filter, especially the slit diaphragm, relies on the interplay of diverse cell surface proteins. Studying these cell surface proteins has so far been limited to in vitro studies or histologic analysis. Here, we present a murine in vivo biotinylation labeling method, which enables the study of glomerular cell surface proteins under physiologic and pathophysiologic conditions. This protocol contains information on how to perfuse mouse kidneys, isolate glomeruli, and perform endogenous immunoprecipitation of a protein of interest. Semi-quantitation of glomerular cell surface abundance is readily available with this novel method, and all proteins accessible to biotin perfusion and immunoprecipitation can be studied. In addition, isolation of glomeruli with or without biotinylation enables further analysis of glomerular RNA and protein as well as primary glomerular cell culture (i.e., primary podocyte cell culture).

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Here we present a protocol for murine in vivo labeling of glomerular cell surface proteins with biotin. This protocol contains information on how to perfuse mouse kidneys, isolate glomeruli, and perform endogenous immunoprecipitation of the protein of interest.

절연 Glomeruli와 비보에 사 세포 표면 단백질의 라벨

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

연구

생화학

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model substrates for organ-scale tissue development. Sprague Dawley rat kidneys are cannulated by inserting a catheter into the renal artery and perfused with a series of low-concentration detergents (Triton X-100 and sodium dodecyl sulfate (SDS)) over 26 hr to derive intact, whole-kidney scaffolds with intact perfusable vasculature, glomeruli, and renal tubules. Following decellularization, the renal scaffold is placed inside a custom-designed perfusion bioreactor vessel, and the catheterized renal artery is connected to a perfusion circuit consisting of: a peristaltic pump; tubing; and optional probes for pH, dissolved oxygen, and pressure. After sterilizing the scaffold with peracetic acid and ethanol, and balancing the pH (7.4), the kidney scaffold is prepared for seeding via perfusion of culture medium within a large-capacity incubator maintained at 37 &#176;C and 5% CO2. Forty million renal cortical tubular epithelial (RCTE) cells are injected through the renal artery, and rapidly perfused through the scaffold under high flow (25 ml/min) and pressure (~230 mmHg) for 15 min before reducing the flow to a physiological rate (4 ml/min). RCTE cells primarily populate the tubular ECM niche within the renal cortex, proliferate, and form tubular epithelial structures over seven days of perfusion culture. A 44 &#181;M resazurin solution in culture medium is perfused through the kidney for 1 hr during medium exchanges to provide a fluorometric, redox-based metabolic assessment of cell viability and proliferation during tubulogenesis. The kidney perfusion bioreactor permits non-invasive sampling of medium for biochemical assessment, and multiple inlet ports allow alternative retrograde seeding through the renal vein or ureter. These protocols can be used to recellularize kidney scaffolds with a variety of cell types, including vascular endothelial, tubular epithelial, and stromal fibroblasts, for rapid evaluation within this system.

This protocol describes decellularization of Sprague Dawley rat kidneys by antegrade perfusion of detergents through the vasculature, producing acellular renal extracellular matrices that serve as templates for repopulation with human renal epithelial cells. Recellularization and use of the resazurin perfusion assay to monitor growth is performed within specially-designed perfusion bioreactors.

상피 세포 다시 채우기 및 신장 조직 개발을위한 설치류 세포 외 기질 비계의 준비

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

생체공학

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and to gain understanding of the origins of congenital kidney disease. More recently, the possibility of steering na&iuml;ve embryonic stem cells toward nephrogenic fates has been explored in the emerging field of regenerative medicine. Genetic studies in the mouse have identified several pathways required for kidney development, and a global catalog of gene transcription in the organ has recently been generated <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a>, providing numerous candidate regulators of essential developmental functions. Organogenesis of the rodent kidney can be studied in organ culture, and many reports have used this approach to analyze outcomes of either applying candidate proteins or knocking down the expression of candidate genes using siRNA or morpholinos. However, the applicability of organ culture to the study of signaling that regulates stem/progenitor cell differentiation versus renewal in the developing kidney is limited as cultured organs contain a compact extracellular matrix limiting diffusion of macromolecules and virus particles. To study the cell signaling events that influence the stem/progenitor cell niche in the kidney we have developed a primary cell system that establishes the nephrogenic zone or progenitor cell niche of the developing kidney ex vivo in isolation from the epithelial inducer of differentiation. Using limited enzymatic digestion, nephrogenic zone cells can be selectively liberated from developing kidneys at E17.5. Following filtration, these cells can be cultured as an irregular monolayer using optimized conditions. Marker gene analysis demonstrates that these cultures contain a distribution of cell types characteristic of the nephrogenic zone in vivo, and that they maintain appropriate marker gene expression during the culture period. These cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which greatly facilitates the study of candidate stem/progenitor cell regulator effects. Basic cell biological parameters such as proliferation and cell death as well as changes in expression of molecular markers characteristic of nephron stem/progenitor cells in vivo can be successfully used as experimental outcomes. Ongoing work in our laboratory using this novel primary cell technique aims to uncover basic mechanisms governing the regulation of self-renewal versus differentiation in nephron stem/progenitor cells.

In this report we describe a method for the isolation and culture of the progenitor cell niche from the embryonic mouse kidney that can be used to study signaling pathways regulating stem/progenitor cells of the developing kidney. These cultured cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which allows efficient manipulation of candidate pathways.

배아 마우스 신장의 Nephrogenic 지대의 세포의 분리 및 문화

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

생물학

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC regulates mitochondrial function and cellular energy status. Numerous reports demonstrated that the activation of PKC-a and PKC-&epsilon; improves mitochondrial function in the ischemic heart and mediates cardioprotection. In contrast, we have demonstrated that PKC-&alpha; and PKC-&epsilon; are involved in nephrotoxicant-induced mitochondrial dysfunction and cell death in kidney cells. Therefore, the goal of this study was to develop an in vitro model of renal cells maintaining active mitochondrial functions in which PKC isozymes could be selectively activated or inhibited to determine their role in regulation of oxidative phosphorylation and cell survival. Primary cultures of renal proximal tubular cells (RPTC) were cultured in improved conditions resulting in mitochondrial respiration and activity of mitochondrial enzymes similar to those in RPTC in vivo. Because traditional transfection techniques (Lipofectamine, electroporation) are inefficient in primary cultures and have adverse effects on mitochondrial function, PKC-&epsilon; mutant cDNAs were delivered to RPTC through adenoviral vectors. This approach results in transfection of over 90% cultured RPTC.
Here, we present methods for assessing the role of PKC-&epsilon; in: 1. regulation of mitochondrial morphology and functions associated with ATP synthesis, and 2. survival of RPTC in primary culture. PKC-&epsilon; is activated by overexpressing the constitutively active PKC-&epsilon; mutant. PKC-&epsilon; is inhibited by overexpressing the inactive mutant of PKC-&epsilon;. Mitochondrial function is assessed by examining respiration, integrity of the respiratory chain, activities of respiratory complexes and F0F1-ATPase, ATP production rate, and ATP content. Respiration is assessed in digitonin-permeabilized RPTC as state 3 (maximum respiration in the presence of excess substrates and ADP) and uncoupled respirations. Integrity of the respiratory chain is assessed by measuring activities of all four complexes of the respiratory chain in isolated mitochondria. Capacity of oxidative phosphorylation is evaluated by measuring the mitochondrial membrane potential, ATP production rate, and activity of F0F1-ATPase. Energy status of RPTC is assessed by determining the intracellular ATP content. Mitochondrial morphology in live cells is visualized using MitoTracker Red 580, a fluorescent dye that specifically accumulates in mitochondria, and live monolayers are examined under a fluorescent microscope. RPTC viability is assessed using annexin V/propidium iodide staining followed by flow cytometry to determine apoptosis and oncosis.
These methods allow for a selective activation/inhibition of individual PKC isozymes to assess their role in cellular functions in a variety of physiological and pathological conditions that can be reproduced in in vitro.

The effects of activation of protein kinase C (PKC) isozymes on mitochondrial functions associated with respiration and oxidative phosphorylation and on cell viability are described. The approach adapts adenoviral technique to selectively overexpress PKC isozymes in primary cell culture and a variety of assays to determine mitochondrial functions and energy status of the cell.

신장 세포 Overexpressing 단백질 키나제 C Isozymes에 Mitochondrial 기능 및 세포 생존 능력의 평가

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the key steps to investigate TRMs. There are slight variations in lymphocyte isolation protocols for different organs. Kidney is an essential non-lymphoid organ with numerous immune cell infiltration especially after pathogen exposure or autoimmune activation. In recent years, multiple labs including our own have started characterizing kidney resident CD8+ T cells in various physiological and pathological settings in both mouse and human. Due to the abundance of T lymphocytes, kidney represents an attractive model organ to study TRMs in non-mucosal or non-barrier tissues. Here, we will describe a protocol commonly used in TRM-focused labs to isolate CD8+ T cells from mouse kidneys following systemic viral infection. Briefly, using an acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection model in C57BL/6 mice, we demonstrate intravascular CD8+ T cell labeling, enzymatic digestion, and density gradient centrifugation to isolate and enrich lymphocytes from mouse kidneys to make samples ready for the subsequent flow cytometry analysis.

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Following viral infection, kidney harbors a relatively large number of CD8+ T cells and offers an opportunity to study non-mucosal TRM cells. Here, we describe a protocol to isolate mouse kidney lymphocytes for flow cytometry analysis.

유동 세포 분석용 마우스 신장 거주자 CD8+ T 세포의 격리

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...

면역학 및 감염병학

Isolation of Primary Mouse Lung Endothelial Cells

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in medical conditions including diabetes, atherosclerosis, sepsis, and acute lung injury. A reliable and reproducible method to isolate pure endothelial cells from mice is needed to investigate the role of endothelial cells in the pathogenesis of these and other conditions. In this protocol, lung microvascular endothelial cells were prepared from 5-7 day old neonatal mouse pups. Lungs are harvested, minced, and enzymatically digested with collagenase I, and released cells are cultured overnight. Endothelial cells are then selected using anti-PECAM1 (CD-31) IgG conjugated to magnetic beads, and cells again are cultured to confluence. A secondary cell selection then occurs with anti-ICAM2 (CD-102) IgG conjugated to magnetic beads to increase the purity of the endothelial cells, and the cells again are cultured to confluence. The entire process takes approximately 7-10 days before the cells can be used for experimentation. This simple protocol yields highly pure (purity &#62;92%) endothelial cells that can be immediately used for in vitro studies, including the studies focused on endothelial cytokine and chemokine production, leukocyte-endothelial interactions, endothelial coagulation pathways, and endothelial permeability. With many knockouts and transgenic mouse lines available, this procedure also lends itself to understanding the function of specific genes expressed by endothelial cells in healthy and pathologic responses to injury, infection, and inflammation.

In this article, primary lung endothelial cells were isolated and cultured from neonatal mice.

일차 마우스 폐 내피 세포의 분리

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in ...

Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal fluid accumulation and extracellular matrix formation. Activity of ion channels and intracellular calcium signaling are key physiologic parameters which determine functions of tubular epithelium. We developed a method suitable for real-time observation of ion channels activity with patch-clamp technique and registration of intracellular Ca2+ level in epithelial monolayers freshly isolated from renal cysts. PCK rats, a genetic model of autosomal recessive polycystic kidney disease (ARPKD), were used here for ex vivo analysis of ion channels and calcium flux. Described here is a detailed step-by-step procedure designed to isolate cystic monolayers and non-dilated tubules from PCK or normal Sprague Dawley (SD) rats, and monitor single channel activity and intracellular Ca2+ dynamics. This method does not require enzymatic processing and allows analysis in a native setting of freshly isolated epithelial monolayer. Moreover, this technique is very sensitive to intracellular calcium changes and generates high resolution images for precise measurements. Finally, isolated cystic epithelium can be further used for staining with antibodies or dyes, preparation of primary cultures and purification for various biochemical assays.

Ion channels expressed in renal tubular epithelium play a significant role in the pathology of polycystic kidney disease. Here we describe experimental protocols used to perform patch-clamp analysis and intracellular calcium level measurements in cystic epithelium freshly isolated from rodent kidneys.

패치 클램프 및 라이브 형광 현미경을 구현 갓 고립 PKD 상피 세포의 기능적 특성을 모니터링하려면

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal ...

Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of pathways involved in parietal epithelial cell activation could therefore be a tool to attenuate the progression of glomerular diseases. This article describes a method to culture and analyze parietal epithelial cell outgrowth of encapsulated glomeruli isolated from mouse kidney. After dissecting isolated mouse kidneys, the tissue is minced, and glomeruli are isolated by sieving. Encapsulated glomeruli are collected, and single glomeruli are cultured for 6 days to obtain glomerular outgrowth of parietal epithelial cells. During this period, parietal epithelial cell proliferation and migration can be analyzed by determining the cell number or the surface area of outgrowing cells. This assay can therefore be used as a tool to study the effects of an altered gene expression in transgenic- or knockout-mice or the effects of culture conditions on parietal epithelial cell growth characteristics and signaling. Using this method, important pathways involved in the process of parietal epithelial cell activation and consequently in glomerulosclerosis can be studied.

This article describes a method for culturing and analyzing glomerular parietal epithelial cell outgrowths of encapsulated glomeruli isolated from mouse kidney. This method can be used to study pathways involved in parietal epithelial cell proliferation and migration.

정수리 상피 세포 활성화에 관여하는 통로를 분석하는 전 비보 분석으로 구체 아웃스승

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of ...

Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative stress has been suggested as a mechanism resulting in GEC dysfunction in the pathogenesis of some glomerular diseases. Historically the isolation of GECs from in vivo models has been notoriously challenging due to difficulties in isolating pure cultures from glomeruli. GECs have complex growth requirements in vitro and a very limited lifespan. Here, we describe the procedure for isolating and culturing conditionally immortalized GECs with fluorescent mitochondria, enabling the tracking of mitochondrial fission and fusion events. GECs were isolated from the kidneys of a double transgenic mouse expressing the thermolabile SV40 TAg (from the Immortomouse), conditionally promoting proliferation and suppressing cell differentiation, and a photo-convertible fluorescent protein (Dendra2) in all mitochondria (from the photo-activatable mitochondria [PhAMexcised] mouse). The stable cell line generated allows for cell differentiation after inactivation of the immortalizing SV40 TAg gene and photo-activation of a subset of mitochondria causing a switch in fluorescence from green to red. The use of mitoDendra2-GECs allows for live imaging of fluorescent mitochondria&#39;s distribution, fusion, and fission events without staining the cells.

The article describes the method for isolating conditionally immortalized glomerular endothelial cells from the kidneys of transgenic mice expressing the thermolabile simian virus 40 and photo-activatable mitochondria, PhAMexcised. We describe the procedure for glomeruli isolation from whole kidneys using beads, digestion steps, seeding, and culturing of GECs-CD31 positive.

형광 미토콘드리아를 이용한 조건부 불멸화 마우스 사구체 내피 세포의 분리

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative ...

Optimizing Isolation and Purification of Murine Glomerular Mesangial Cells

Mesangial cells (MCs) are stromal cells located in the middle space of the glomerulus, with pivotal functions in glomerular homeostasis. Methods for isolating, purifying, and culturing glomerular MCs have been developed and optimized since the 1980s for use in biomedical research, particularly in the field of nephrology. Mice are the most frequently used experimental animal models in research on renal diseases. In this study, we developed an optimized protocol for murine MCs isolation and ex vivo cell culture. These cells can be passaged multiple times, frozen, revived, and cultured without compromising cell growth or protein expression. This optimized approach significantly reduces the study duration for researchers and enables long-term cell preservation. The necessary equipment for the procedures is easily accessible in a basic biomedical laboratory, and the procedural steps are straightforward. The acquisition of target cells requires only 2-3 weeks, a reduction of at least 1 week compared to existing methods.

This study developed an optimized protocol for the isolation of murine mesangial cells (MCs) and their ex vivo cell culture. These cells can be passaged multiple times, frozen, revived, and cultured without compromising cell growth or protein expression.

Mesangial cells (MCs) are stromal cells located in the middle space of the glomerulus, with pivotal functions in glomerular homeostasis. Methods for ...