안정적인 형광 미토콘드리아를 가진 불멸화 된 사구체 내피 세포는 시험관 내에서 미토콘드리아 구조에 대한 다양한 자극의 효과를 조사하는 훌륭한 도구입니다. 현재 기사에서 기술된 방법은 많은 수의 사구체 내피 세포를 생성한다. GEC에서 소분자를 테스트함으로써 GEC가 영향을받는 당뇨병 성 신장 질환에 대한 단독 요법을 선별 할 수 있습니다.
설명 된 방법은 수행하기 쉽고 특정 장비가 필요하지 않습니다. 그러나 오염 방지를 위해 설명 된 단계를 따르고 장비를 멸균하는 것이 중요합니다. 시작하려면 신장 사구체 세포를 분리하는 데 필요한 관류 및 분리 재료를 작업 공간에 배치하십시오.
새로 준비된 행크스 밸런스드 소금 용액 (HBSS)을 0.2 미크론 필터로 여과하고 오염을 피하기 위해 후드 아래에 보관하십시오. 그런 다음 200마이크로리터의 마그네틱 비드와 20밀리리터의 HBSS를 혼합합니다. RPMI를 섭씨 37도의 수조에서 10%FCS 및 내피 세포 배양 배지로 예열합니다.
이어서, 6-웰 플레이트의 2웰을 실온에서 45분 동안 콜라겐 IV 밀리리터당 10 마이크로그램의 2 밀리리터로 프리코팅한다. 플레이트를 PBS로 두 번 세척하여 콜라겐을 희석하는 데 사용된 아세트산을 제거한다. 코팅된 플레이트를 즉시 사용하거나 섭씨 2도에서 8도까지 최대 4주 동안 보관하십시오.
수술 기구와 작업 공간을 70% 에탄올로 청소하십시오. 이어서, 수술 도구를 30 분 동안 오토 클레이브한다. 마취 된 마우스의 복부를 연 후 나비 바늘을 좌심실에 삽입하십시오.
혈액 순환을 확장하기 위해 100마이크로리터의 비드 용액을 주입하려면 19게이지 바늘로 신장 아래의 하대정맥을 조심스럽게 부수고 비드 용액의 관류를 계속합니다. 그런 다음 핀셋으로 지방 조직을 부드럽게 제거하고 얇은 수술 용 가위 C로 양쪽 신장을 절제하고 얼음 위에 HBSS 1 밀리리터가 든 접시에 놓습니다. 멸균 메스로 신장을 1 밀리미터의 작은 조각으로 만듭니다.
다진 신장을 1 밀리미터의 신선하게 준비된 콜라게나제 II 형으로 섭씨 37도에서 35 분 동안 수평 셰이커에서 부드럽게 기울입니다. 소화 후 10 % FBS로 4 밀리리터의 RPMI를 추가하여 콜라게나 제를 중화시킵니다. 멸균된 100미크론 세포 여과기를 통해 소화된 조직을 50밀리리터 튜브로 여과합니다.
멸균 된 1.5 밀리리터 튜브의 바닥을 사용하여 소화 된 조직을 여과기에 대고 저어 사구체가 통과하도록합니다. 15 밀리리터의 HBSS로 셀 스트레이너를 헹굽니다. 이어서, 유동을 실온에서 5분 동안 200 XG에서 원심분리한다.
이 단계에서 튜브에는 3 개의 층이 있습니다. 상층은 세뇨관과 같은 더 작은 구조를 포함하고, 중간 층은 사구체가있는 구슬이며, 하층에는 파편이 들어 있습니다. 상청액과 상단 흰색 층을 조심스럽게 흡인하십시오.
그런 다음 사구체와 파편이 들어있는 비드가 들어있는 펠릿을 1.5ml의 HBSS에 다시 현탁시키고 2 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 튜브를 자기 농축기에 넣고 1 밀리리터의 HBSS로 비드를 두 번 세척하기 전에 상청액을 흡인합니다. 20 마이크로리터의 세포 현탁액을 슬라이드에 놓습니다.
그런 다음 사구체의 존재에 대해 현미경으로 슬라이드를 관찰하십시오. 다음으로, 펠릿을 내피 세포 성장 배지에 재현탁시키고 현탁액을 2 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 배지 3 밀리리터 당 1 마이크로 리터의 인터페론 감마를 첨가하고 섭씨 33도에서 배양하기 위해 세포를 6 웰 플레이트에 넣습니다.
3 일간의 배양 후 1 밀리리터 배지를 조심스럽게 새 배지로 교체하십시오. 이 단계에서 세포는 사구체 세포의 혼합물로 이질적입니다. 7일 후, 배지를 인터페론 감마가 보충된 2밀리리터의 새로운 내피 세포 성장 배지로 교체하여 세포 증식을 시작합니다.
10일 후 세포가 80%컨플루언스에 도달하면 트립신을 사용하여 계대배양하고 콜라겐 IV.21일 배양 후 세포를 T-75 플라스크로 옮깁니다. T-75 플라스크에 0.25 % 트립신 3 밀리리터를 넣고 섭씨 37도에서 5 분 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 3 밀리리터의 내피 성장 배지로 트립신을 중화시키고 현탁액을 15 밀리리터 튜브로 옮겨 200 XG에서 5 분 동안 원심 분리합니다.
상청액을 흡인하고 1% BSA, 2 밀리몰 EDTA, 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 PBS 1밀리리터로 세포를 세척한다. 다시, 펠렛을 200 마이크로리터의 CD31 항체 코팅 비드 및 800 마이크로리터의 PBS에 원심분리하고 재현탁시킨다. 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 지속적으로 흔들어 45 분 동안 세포를 배양합니다.
다음으로, 튜브를 자기 농축기에 놓고 BSA, EDTA 및 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 PBS로 세포를 4회 세척합니다. 마지막 세척 후, 인터페론 감마가 보충 된 3 밀리리터의 내피 성장 배지에 세포를 재현 탁시킨다. 콜라겐 IV 코팅된 웰에 웰당 1.5밀리리터의 세포를 6-웰 플레이트에 플레이트하고 섭씨 33도의 허용 조건 하에서 배양한다.
4 일 후, 750 마이크로 리터의 배지를 인터페론 감마가 보충 된 새로운 내피 성장 배지로 교체하십시오. 배양 10-14일 후 488나노미터 필터가 있는 에피형광 현미경을 사용하여 형광 미토콘드리아를 발현하는 콜로니인 CD31 양성 사구체 내피 세포 또는 GEC가 성장하는 것을 관찰합니다. 21일 후 또는 세포가 80-90% 컨플루언시에 도달하면 T-25 플라스크로 옮깁니다.
10%FCS를 함유하는 RPMI 성장 배지로 배양물을 유지한다. 또는 세포를 냉동 보존할 수 있습니다. 앞서 입증 된 것처럼 트립신을 사용하는 통로 세포.
그런 다음 세포를 원심분리하고 펠릿을 3밀리리터의 동결 배지에 재현탁합니다. 극저온 튜브에 세포를 분취하여 액체 질소, 증기 온도에 보관하십시오. 이 프로토콜은 사구체 내피 세포의 단리를 위한 방법을 기술하였다.
분리 된 사구체에서 세포는 배양 3 일 후에 천천히 성장하기 시작했습니다. 7일 후, 세포는 이질적으로 나타났고 족세포, 정수리, 상피 및 간질 세포와 같은 다른 사구체 세포 유형을 보여주었습니다. 70 내지 80%컨플루언시에 도달한 후, 내피 세포의 양성 선택을 사용하여 다른 사구체 세포를 제거하였다.
MitoDendra2 GECs는 CD31을 발현하고 시냅토포딘 음성 염색에서 알 수 있듯이 족세포 마커에 대해 음성이었습니다. 미토콘드리아 구조에 대한 포도당 농도의 영향을 조사하였다. 정상 포도당 하에서 세포에서 볼 수있는 길쭉한 미토콘드리아와 비교하여, 높은 포도당은 눈에 띄는 스페로이드 모양의 미토콘드리아에 의해 관찰 된 바와 같이 미토콘드리아의 단편화 또는 분열을 유도했습니다.
또한 405나노미터 레이저를 사용하여 단일 살아있는 MitoDendra2 GEC에서 선택된 미토콘드리아 하위 집단을 광변환했습니다. 정상 및 고 포도당 농도 처리 된 세포에 대해 선택된 영역에서 녹색에서 빨간색으로 미토콘드리아의 성공적인 광 전환이 표시됩니다. 이 전환을 통해 MitoDendra2 GEC의 융합 이벤트를 목격할 수 있었습니다.
정상 포도당 하에서, 미토콘드리아 매트릭스 융합으로 인해 황색 병합 된 녹색 및 적색 형광이 관찰되었다. 대조적으로, 고 포도당 처리 GECs에서, 미토콘드리아는 주로 단편화되었다. 소량의 성장 배지가 있는 6웰 플레이트의 한 웰에 세포를 배치하는 것은 세포가 접시에 부착되도록 하는 데 필수적입니다.
분리된 내피 세포는 미토콘드리아 기능 및 구조 연구를 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 형광 미토콘드리아 기능을 가진 불멸의 내피 세포의 사용은 약물 발견을 향한 길을 열 것입니다. 작은 분자는 세포에서 테스트 할 수 있으며 라이브 이미징을 수행하여 미토콘드리아 기능에 미치는 영향을 검사합니다.
