이 프로토콜은 여러 응용 분야가 있을 수 있는 마우스에서 고순도 내피 세포를 분리하고 배양하는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 방법을 보여줍니다. 이 기술은 내피 세포의 수율과 순도를 보존하는보다 간단한 방법입니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 직원 연구원 인 Nina Nguyen이 될 것입니다.
시작하려면 마그네틱 비드를 몇 초 동안 소용돌이칩니다. 50 마이크로리터의 비드를 CD31 및 CD102용 2개의 1.5 밀리리터 마이크로원심분리 튜브에 피펫팅한다. 1밀리리터의 비드 세척 버퍼를 넣고 잘 섞는다.
튜브를 자기 분리기에 놓고 유리 파스퇴르 피펫으로 상청액을 제거합니다. 50마이크로리터의 비드 세척 완충액에 비드를 재현탁합니다. 그런 다음 50 마이크로 리터의 비드마다 5 마이크로 리터 또는 2.5 마이크로 그램의 CD31 또는 CD102 항체를 추가합니다.
섭씨 4도에서 밤새 또는 실온에서 3시간 동안 끝 회전자를 부드럽게 회전시켜 비드 현탁액을 배양합니다. 면역비드를 4회 세척한 다음, 면역비드를 50 마이크로리터의 비드 세척 완충액에 재현탁시킨다. 분리 당일, 25 밀리리터의 HBSS를 25 밀리그램의 1 형 콜라게나제에 첨가하고 부드럽게 회전시켜 배양하십시오.
그런 다음 22마이크로미터 필터를 사용하여 필터링합니다. 5-7 일 된 마우스 강아지를 안락사 한 후 시체에 70 % 에탄올을 뿌립니다. 다음으로, 흉강을 노출시키기 위해 가슴의 전체 측벽을 따라 위쪽으로 횡격막을 위쪽으로 자릅니다.
폐가 하얗게 변할 때까지 5 밀리리터의 차가운 DMEM을 심장의 우심실에 주입하십시오. 그런 다음 해당 기관지 원위부에 있는 엽을 하나씩 잘라 폐를 제거합니다. 20밀리리터의 얼음처럼 차가운 기초 배지로 미리 채워진 50밀리리터의 원뿔형 튜브에서 폐엽을 당깁니다.
과도한 적혈구를 씻어내기 위해 손으로 튜브를 10-15초 동안 부드럽게 저어줍니다. 세포 여과기로 배지에서 폐를 제거하고 멸균 된 가위로 말다툼하십시오. 다진 조직을 25 밀리리터의 예열 된 콜라게나제 용액과 함께 50 밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다.
회전하는 믹서에서 부드럽게 저어줍니다. 20 밀리리터 주사기를 15 게이지 무딘 캐뉼라에 부착하고 세포 현탁액에 10-15 회 거품을 내지 않고 현탁액을 격렬하게 분쇄하십시오. 70 마이크로 미터 셀 스트레이너를 통해 50 밀리리터 원추형 튜브로 현탁액을 여과합니다.
그런 다음 소화에 사용되는 원추형 튜브와 세포 여과기를 15 밀리리터의 기본 배지로 헹굽니다. 세포 현탁액을 섭씨 4도에서 8분 동안 400배 G로 원심분리합니다. 펠릿을 2 밀리리터의 완전한 배지에 재현 탁하십시오.
8 밀리리터의 완전한 배지를 넣고 배양하십시오. 다음날, 칼슘과 마그네슘이 없는 HBSS 10밀리리터로 플라스크를 두 번 세척하고 10밀리리터의 완전 배지를 추가합니다. 세포가 90-95% 융합되면 1차 면역비드 분리를 위한 준비가 된 것입니다.
부착성 내피 세포를 칼슘과 마그네슘 없이 10밀리리터의 HBSS로 두 번 세척합니다. 2 밀리리터의 트립신이없는 세포 분리 용액을 첨가하고 플라스크에서 모든 세포가 들어 올려 지도록 배양합니다. 8 밀리리터의 기초 배지를 첨가하십시오.
다음으로, 실온에서 4 분 동안 400 배 G에서 세포를 회전시키고 2 밀리리터의 기본 배지에 재현탁시킨다. 비드를 재현탁하기 위해 몇 초 동안 항-CD31 코팅 비드를 소용돌이. 세포 현탁액 2밀리리터당 30마이크로리터의 비드를 추가하고 뚜껑을 고정합니다.
엔드 오버 엔드 로테이터에서 실온에서 10분 동안 튜브를 배양합니다. 그런 다음 튜브를 자기 분리기에 2분 동안 놓습니다. 상층액을 흡인하고 자석에서 튜브를 제거합니다.
3밀리리터의 기본 배지를 튜브에 추가하고 여러 번 위아래로 피펫팅하여 비드 셀 펠릿을 재현탁합니다. 자기 분리기의 튜브를 2분 동안 교체합니다. 그런 다음 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 상청액을 조심스럽게 흡인합니다.
최종 세척 후, 상청액이 투명해지면, 비드 세포 펠릿을 3밀리리터의 완전 성장 배지에 재현탁시키고, 이를 T75 플라스크에 옮긴다. 완전한 성장 배지 7 밀리리터를 넣고 배양하십시오. 다음날 칼슘과 마그네슘없이 HBSS로 세포를 다시 씻으십시오.
그런 다음 10 밀리리터의 완전한 매체를 첨가하십시오. 세포가 90-95% 융합되면 2차 면역비드 분리를 위한 준비가 됩니다. 첫 번째 면역비드 선택은 조약돌 형성으로 성장하는 CD31 양성 세포를 식별합니다.
항-CD102 코팅 비드를 사용한 두 번째 면역비드 선택은 내피 세포 순도를 증가시키고 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 세포 집단이 CD31 양성이고 CD102 양성임을 확인합니다. 내피 염증 경로 및 내피 장벽 기능을 연구하기 위해 쥐 사이토믹스로 처리하여 P 값이 0.01 미만인 내피 세포에 의한 상당한 IL-6 생산을 유도했습니다. 또한, 경내피 저항은 감소하여 증가된 내피 투과성을 나타냈다.
분리된 내피 세포는 내피 기능 장애 장애에 대한 내피 기반 치료 표적을 발견하기 위해 내피 세포 자극 또는 장벽 기능 분석에 사용할 수 있습니다.
