Name: a microphysiologic platform for human fat: sandwiched white adipose tissue
Uploaded: 2018-08-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Microphysiologic Platform for Human Fat: Sandwiched White Adipose Tissue at JoVE.com

저자는 프로젝트 자금 LSU 건강 과학 센터에 의해 제공 하는 제도적 지원 인정 하 고 싶습니다.

LSUHSC-NO. IRB 사무실에 의해 승인 된 프로토콜 #8759 #9189, 준수 모든 작업 수행 했다 모든 동물 작품 프로토콜 #3285 IACUC 사무실 LSUHSC-호에 의해 승인 준수에서 수행 되었다
1. 셀 시트 끼우기의 시드
참고: 그림 1을 참조 하십시오.
<ol><li>씨 줄기 조직 문화 접시 (6 cm 또는 6 잘 플레이트)에 약 80 %confluency. 스와트 원하는 각 잘 잘 1 기존의 조직 문화 및 조직 문화 poly(N-isopropylacrylamide (pNIPAAm) 코팅 플라스틱 접시에 해당 크기의 1 잘 씨앗. 참고: 따라, 스와트 6 잘 플레이트 필요 합니다 한 6-잘 표준 조직 배양 플레이트 (기본 레이어)에 셀과 하나의 조직 문화 6-잘 pNIPAAm 코팅 접시 (상위 계층) 시드. pNIPAAm 코팅 접시 상업적으로 구입하실 수 있습니다 또는 실험실에서12,,1314를 생산.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO2 에 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 10 보충에서 줄기를 유지 하 고 1 %FBS 페니실린/스. x 미디어 매 2 일 변경.</li>
	<li>때까지 그들은 100% 합칠 되 고 전기 패턴 (약 6-8 일)에 합체를 셀 수 있습니다. 참고: 이러한 셀 부 력 지방 조직 안정화 위해 단일 그대로 셀 시트 작동 해야 합니다. 충분 confluent 셀 와트와 시드 시 조각화 됩니다.</li>
</ol>2입니다. 기동 장치의 준비
<ol><li>준비 몇 10 mL aliquots의 1 x 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS); 여분의 볼륨 번호판의 원하는 수 만큼 준비 합니다.</li>
	<li>
스와트 시드에 플런저 장치를 준비 합니다. 줄기는 둥근 디스크에 연결 된로 구성 된 간단한 아크릴 플라스틱을 사용 하 여 플런저를 생성 합니다. 그것은 조직 문화 우물의 둘레에 맞는지 확인 (직경: < 6 cm 접시, 6 cm < 6 잘 플레이트에 대 한 3.5 c m, 대략적인 질량: 6 cm 접시, 6 잘 플레이트에 대 한 5.1 g 6.7 g).
	<ol>
<li>프로시저 실행 것을 원활 하 게 경우에 어떤 개별 플런저와 함께 문제가 되도록 추가 plungers를 준비 합니다.</li>
		<li>플런저 디스크의 가장자리 주위 랩 테이프 감아 젤라틴 솔루션의 누설을 방지 하기 위해 적어도 2 배.</li>
		<li>스프레이 biosafety 내각 (BSC) 70 %EtOH. 스프레이로 빈, 세척제 15 mL 원뿔 튜브; BSC 내부 15 mL 원뿔 튜브 랙 튜브는 젤라틴 plungers의 위치를 확보 하는 데 도움이 됩니다.</li>
		<li>스프레이 각 테이프 포장 플런저 철저 하 게 70 %EtOH 장소 선반에 15 mL 원뿔 튜브로. 금속 와셔 (대략적인 질량 6.3 g)를 살포 하 고 한 쌍의 갈고리 집게; 함께 선반에 그들을 두십시오 와셔 기동 시드 중는 plungers에 무게를 추가 합니다.</li>
		<li>BSC 창틀 닫고 UV 빛 건조 및 살 균을 설정 합니다. 참고: 이상적으로, 기동 뿌리기 전에 24 h이이 단계를 수행 합니다. 또는, 과정 조직 컬렉션/기동 시드; 요일에 실시 그러나,이 경우에, UV 건조/살 균에 대 한 15-45 분 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 젤라틴 Plungers 준비-상단 셀 시트 응용 프로그램
<ol><li>75 ° c 물 목욕을 열</li>
	<li>
1 x HBSS의 10 mL 재고 젤라틴 분말의 0.75 g을 추가 하 여 젤라틴 솔루션을 준비 합니다. 증기 두건에서 1 M NaOH 솔루션의 산도 균형의 100 µ L를 추가 합니다.
	<ol>
<li>물 목욕을 10 mL 주식을 추가 하 고 분말 솔루션으로 해소 될 때까지 5 분에 적극적으로 악수. 가루 젤라틴 온수 물 목욕에 추가 후 곧 해산을 목표로 합니다.</li>
		<li>BSC 송풍기, UV 빛 해제 켜고 틀 마련. BSC 표면 스프레이 공급 (5 mL luer 잠금 주사기와 0.2 µ m 주사기 필터) 필터를 준비. 효율적으로 변형 적용할 plungers 젤라틴의 충분 한 볼륨에 여러 개의 필터를 준비 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>젤라틴 솔루션 도달할 때 동질적인 일관성, 필터링 솔루션을는 plungers에 적용 됩니다. 젤라틴으로 주사기를 로드 합니다. (6-잘 접시 ~2.5 mL, 6 cm 요리에 대 한 ~4.5 mL) 주사기 필터를 통해 플라스틱 plungers를 젤라틴을 적용 하 고 (~ 20 분)을 강화 하기 위해 허용.</li>
	<li>젤라틴은 고체, 일단은 plungers의 가장자리에서 테이프를 풀 다. 갈고리 집게와 플런저의 외부 가장자리에서 젤라틴을 제거 (즉, 초승달 모양의 제기 가장자리). 플런저의 센터에 남아 있는 젤라틴 완전히 수준 인지 확인 ADSC 시트와 접촉을 최대화 하기 위해.</li>
	<li>일단 초과 젤라틴을 제거 하 고, 부드럽게 ADSC pNIPAAm 코팅 판 젤라틴 plungers 적용 됩니다. 금속 와셔를 사용 하 여 플런저를 누르다. plungers를 적용 하는 동안 셀 시트를 전단 하지 마십시오.</li>
	<li>
실 온에서 1.5 h에 대 한 셀 시트에는 plungers를 둡니다. 접시/plungers pNIPAAm 코팅 판 표면에서 셀 시트의 분리를 완료 하는 데 1.5 h에 대 한 얼음 물 목욕에서 품 어.
	<ol>
<li>얼음 목욕; 잠복기 동안 주의 인큐베이션 기간 동안 셀 미디어 오염 얼음 목욕을 허용 하지 않습니다.</li>
		<li>부 화 완료 후 비 살 균 물 제거 pNIPAAm 코팅 접시의 바닥을 청소.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 백색 지방 조직 처리
<ol><li>수술 실에서 인간 지방 조직 때, 기동 시드할 수 때까지 얼음에 있는 무 균 용기에 모든 샘플을 계속. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), 등의 살 균 유지 보수 미디어 조직 안정성에 대 한 지방 조직 컨테이너를 추가 합니다.</li>
	<li>추가 될 각 잘/요리 1.5 mL microcentrifuge 관에 찬 세포 배양 시드 (6-잘 접시 100 µ L, 6 cm 요리 200 µ L).</li>
	<li>
지방이 많은 직물을 말하다.
	<ol>
<li>단단한 지방 조직 세그먼트에 대 한 다음과 같은 할.<ol>
<li>지방이 많은 직물 3의 큰 세그먼트를 세척 살 균 PBS에 x 제거 가능한 많은 PBS.</li>
			<li>개의 집게와 면도기 살 균 티슈를 말하다 고 많은 맥 관 구조 및 가능한 근 막 제거 (자세한 내용 참조).</li>
			<li>잘게 다진된 조직 두께, 액체 일관성에 때까지 면도칼으로 지방을 말하다. 참고: 이상적으로 조직이 나타납니다 와트의 없음 표시 개별 세그먼트와 동질적인이 항상 가능한.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Lipoaspirate를 다음과 같이 처리 합니다.<ol>
<li>BSC에서 비 커, 위에 멸 균 거 즈 테이프 하 고 모든 초과 액체를 수집 하는 큰 비 커에이 비이 커를 배치 합니다.</li>
			<li>25 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 필요에 따라 많은 lipoaspirate 그리고 멸 균 거 즈의 표면에 그것을 적용. Lipoaspirated 지방 질을 세척 하 고 과잉 혈액 및 지질 잔류물 제거 하이 표면에 직접 PBS를 적용 합니다.</li>
			<li>집게를 사용 하 여 물기 조직 복구, 살 균 고기 저 미 표면에 그것을 전송 하 고는 lipoaspirate를 말하다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>살 균 면도기를 사용 하 여 전송 다진된 조직; p1000 피 펫 팁의 선단부를 잘라 이 체형 lysis로 이어질 수 있는 전단 응력을 최소화 합니다. 일단 적절 한 조직의 일관성 (300-400 µ L 6-잘 접시, 6 cm 접시 500-600 µ L) 각 1.5 mL 튜브에 다진 조직의 원하는 볼륨을 전송. 다진 와트와 튜브에 짧게 미디어 믹스.</li>
	<li>
기본 ADSC 격판덮개를가지고 고 가만히 따르다 aspirate 미디어. 각 1.5 mL 튜브에서 와트/미디어 혼합물에 미디어를 바꿉니다.
	<ol>
<li>부드럽게 pNIPAAm 코팅 접시에서 젤라틴 plungers를 제거 하 고 기본 ADSC 접시에 와트 혼합물에 적용. 세포질 분리 확인 현미경 pNIPAAm 코팅 접시의 단층을 검사 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>BSC에서 약 37-40 ° C에 열 블록을 설정 합니다. 장소에 아직도 plungers, 번호판 열 블록의 표면에 이동. 셀을 품 어 젤라틴 용 해 촉진을 따뜻하게 문화 미디어의 2-3 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>~ 30 분 후 부드럽게 플레이트 표면에서는 plungers를 제거 합니다. 기본 조직 문화 접시의 뚜껑을 대체 하 고 셀 문화 인큐베이터로 이동. 젤라틴은 37 ° C에서 완전 하 게 액 화, 일단 발음 하 고 세포 배양을 바꿉니다.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO2 에 7 µ M 인슐린, 30 µ M dexamethasone, 1 x 페 놀 레드 무료 M199 매체에 유지 하는 기동 페니실린/스. 약 2 mL 미디어 6 잘 플레이트 및 6 cm 요리 3 mL에에서 유지 합니다. 미디어 매 2 일 변경.</li>
</ol>5. 기동 수확
<ol><li>콜라 (0.5 mg/mL 콜라, PBS에 500 nM 아데노신) 준비 15 mL 원뿔 튜브 (10 mL의 대략적인 볼륨)에서 aliquots. 튜브를 고정 하 고-20 ° c.에서 그들을 저장합니다</li>
	<li>셀에서 모든 문화 매체를 발음, PBS, 1 x를 세척 하 고 PBS 발음. 37 ° C 물 욕조에 녹고에 의해 콜라 aliquots를 준비. 참고: 이상적으로, 콜라 솔루션 도달 37 ° C; 즉시 그 후, 조직을 추가 합니다.</li>
	<li>
스와트 접시에서 개별 aliquots 모든 조직을 추가 합니다. 스와트 멸 균 셀 scrapper를 사용 하 여 수확 하 고 잘라 p1000 피 펫 팁 콜라 aliquots에 전송. 조직 콜라 솔루션을 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브에 직접 추가 합니다.
	<ol>
<li>또는, 50 mL 원뿔 튜브; 조직/콜라 혼합물을 품 어 증가 된 노출 영역 추가 효소 소화를 촉진 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>45 ° 각도로 incubated 궤도 셰이 커에 샘플 튜브를 배치 합니다. 30-60 분 동안 37 ° C에서 200 rpm에서 품 어.</li>
	<li>장소는 250 µ m 컬렉션에 대 한 새로운 15 mL 원뿔 튜브로 필터 메쉬. 필터를 통해 소화 체형 솔루션을 붓는 다. 참고:이 섬유 조직에 밖으로 필터링 하는 동안 통과 하는 모든 셀을 허용할 것 이다.</li>
	<li>단계 분리 수 있도록 실 온에서 5 분 동안 앉아 통해 흐름 수 있습니다. 참고:는 adipocytes 됩니다 플 로트 솔루션의 상단에 지방 stromal 세포 (ASCs) 낮은 단계에 정착 하는 동안. 500 x g 에 5 분 동안 원심 분리 세포 분리 또는 펠 릿에 줄기를 둘러싼 수확에도 극대화할 수 있습니다.</li>
	<li>
컷오프 p1000 피 펫 팁을 사용 하 여, 1.5 mL microcentrifuge 컬렉션 튜브 adipocytes (콜라 솔루션의 상단에 떠 있는 레이어) 전송. 한 번에 ~ 250 µ L를 복용, 플라스틱 튜브를 수집 하는 adipocytes의 가장자리를 따라 천천히.
	<ol>
<li>셀 내부에 준수의 복구를 최대화 하기 위해 adipocytes 수집 하면서 튜브를 천천히 회전 합니다. 1.5 mL microcentrifuge 튜브 전체 때까지 더 많은 셀을 그리기 유지.</li>
	</ol>
</li>
	<li>바늘 (~ 21 G)에 부착 된 주사기를 사용 하 여 격리 adipocytes에서 과잉 액체를 제거 합니다. 부동 체형 레이어에서 바늘 잠수함 짧게 준수 니 들 축 하 셀을 꺼내 려 니 들 선동 하 상단에 떠 빠질된 adipocytes에 대 한 기다립니다.</li>
	<li>천천히 adipocytes의 의도 하지 않은 제거 되지 않도록 주의 하면서 초과 액체를 그립니다. Microcentrifuge 튜브 졸업식 지속적으로 샘플 볼륨을 사용 하 여 (예:. 0.1 mL 각 샘플에 대 한)입니다.</li>
	<li>격리 된 셀을 사용 하 여 DNA/RNA 추출, 포도 당 통풍 관 분석 결과, 분석 결과 lipolysis, 등
</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

이 프로토콜 세부 샌드위치 인간의 흰색 adipose 조직; 줄기를 사용 하 여 인간의 ADSC 셀 라인 잘 설립 프로토콜15를 통해 격리 된 수 있습니다. 그러나, 시스템 (3T3L-1 셀 샌드위치 마우스 와트를 사용 하 여) 등 개별된 연구 요구 사항에 맞게 수 있습니다. 이 프로세스는 기본 인간의 조직 처리 해야 합니다. 표준 안전 예방 조치를 고용 한다; 인간의 조직 BSL-2 병원 체 (예: HIV, He...

지방 조직 미국1$147 십억 $210 십억 사이 연간 직접 의료 비용 운반 비만의 주 기관 이다. 지방이 많은 직물의 축적은 또한 심장 질환, 2 형 당뇨병, 그리고 특정 유형의 암2등 죽음의 다른 주요 원인에 기여. 생체 외에서 문화 모델 대사 연구와 신약 개발을 위해 필수적입니다 하지만 지방이 많은 직물의 현재 연구 모델 주요 결함. Adipocytes, 부 력, 그리고 말기 분화 세포를 세포 문화 플라스틱에 고착 하지 않을 것 이다 따라서 기존의 셀 문화 방법을 사용 하 여 경작 될 수 없습니다. 1970 년대 이후, 여러 가지 방법이 사용 되었습니다 시도에서 유리 coverslips, 천장, 현 탁 액 문화, 문화와 세포 외 매트릭스3,,45, 의 사용을 포함 하 여 이러한 장벽을 극복 하기 위해 6 , 그러나 7., 이러한 방법은 세포 죽음과 dedifferentiation, 의해 표시 된 하 고 그들은 2 주 연구 기간 보다 더 일반적으로 사용 됩니다. 또한,이 모델을 시도 하지 않는다 그들은 그대로 ECM을 유지 하지 않는, adipocytes 사이 고 stromal 상호 작용 지원 셀도 수축 힘 셀에 에서 vivo에서 발휘로 네이티브 지방 microenvironment 정리 와트.
골드 표준 기본 지방 문화 방법의 부재, 지방 연구는 차별화 된 사전 adipocytes (diffAds)에 주로 의존 했다. DiffAds multilocular, 부착, 그리고 metabolically 활성 있습니다. 대조적으로, 기본 흰색 adipocytes 단원제의 nonadherent, 그리고 상대적으로 낮은 신진 대사를 보여 줍니다. 건강 한 성숙 지방 조직 생리학 정리 현재 지방 문화 모델의 실패 가능성이 FDA 승인 약품을 직접 대상으로 adipocytes의 부재에 주요 요인입니다. 사실, 기관 모델 physiologic 생체 외에서 부족 대부분 장기 및 질병에서 중요 한 문제입니다.
Microphysiological 시스템 (MPS) 프로그램의 생성을 발표의 위치 종이, 국립 보건원 (NIH) 모든 인간의 제약 임상 시험 통해 2013 성공률은만 18 단계 II에 대 한 %와 50% 단계 III에 대 한 보고 임상 시험8. MPS 프로그램은 직접 모델 인간의 생리를 생체 외에서 monoculture의 무 능력을 해결 하기 위해 설계 되었습니다. NIH 문화 시스템 인간의 기본 또는 기관 기능 정리 다세포 3D 구문에서 줄기 세포의 구성으로 MPSs를 정의 합니다. 균질, 불멸 하 게 한 세포 배양의 reductionist 모델과 달리 MPSs-셀, 마약 셀, 약물-약물, 및 장기 약물 상호 작용9모델 정확 하 게 한다. 단기 주 문화 메서드와 달리 NIH 기준 MPS 지속 문화8에서 4 주 이상 지정합니다. MPS 프로그램의 자세한 내용은 NIH의 댓글은 (#RFA-엉-18-001)10에서 찾을 수 있습니다.
우리 간단 하 게, 소설, 적응력, 개발 하 고 저렴 한 지방 의원 "백색 지방 조직에 끼여" 되 나 (기동)11. 우리는 지방이 많은 파생 된 stromal 세포 (줄기) (그림 1) 시트 사이 "붙여" 다진된 기본 지방 조직으로 adipocytes의 자연 력 극복. 결과 3D 구조 셀 연락처 및 네이티브 지방 microenvironment 자연 체형 지원 세포 인구를 가진 성숙한 adipocytes 주변으로. 스와트 8 주 생존, exogenous 신호, adipokine 분 비, 및 동물 모델로 engraftment 응답으로 검증 되었습니다.

<table><tbody><tr><td>10x HBSS</td><td>Thermofisher</td><td>14185052</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma-aldrich</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Sigma-aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A9251</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermofisher</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>M199 Media</td><td>Thermofisher</td><td>11043023</td><td>Phenol red-free&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>250 &amp;micro;m Mesh Filter</td><td>Pierce</td><td>87791</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m Syringe Filter</td><td>Celltreat</td><td>229747</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Luer-Lok syringes&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Metal Washers</td><td></td><td></td><td>These are simple metal washers and can be bought at any hardware store. They simply add leight weight to the backs of the plugers to ensure even contact between cells and gelatin, while being easy to stock and sterilize. Approximate mass: 6.3 g&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Heated Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubated Orbital Shaker</td><td>VWR</td><td>10020-988</td><td>Samples should be pitched at 45&amp;deg; angle to facilitate collagenase digestion</td></tr><tr><td>Heat Block</td><td></td><td></td><td>Set to 37-40 &amp;deg;C and placed under Biosafety Cabinet</td></tr><tr><td>Water Bath</td><td></td><td></td><td>Set to ~75 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Specialized Plastics&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Upcell Dishes 6cm of 6-multiwell</td><td>Nunc</td><td>174902&amp;nbsp; or 174901</td><td>These are commerically available pNIPAAm-coated dishes which can be used to grow the upper sheet of ADSCs. Alternatively, pNIPAAm-coated plates can be produced in-lab. diameter: &amp;lt;6 cm for 6 cm dish, &amp;lt;3.5 cm for 6-well plate; approximate mass: 6.7g for 6 cm dish, 5.1 g for 6-well plate</td></tr><tr><td>Plastic Plunger Apparatus</td><td></td><td></td><td>These can be fashioned to fit within desired pNIPAAm-coated plastics (multiwell plates, petri dishes). They are comprised of a simple stem attached to a circular disk. They can be produced in-lab or by any facility that can fashion acrylic plastics</td></tr></tbody></table>

a microphysiologic platform for human fat: sandwiched white adipose tissue

흰색 adipose 조직 (WAT)은 무게와 매일 건강을 조절에 중요 한 역할을 한다. 아직도, 모두 충실 하 게 정리 지방 microenvironment 또는 2 주 이상 와트 생존을 연장 하지 사용할 수 있는 기본 문화 모델에 상당한 한계가 있다. 신뢰할 수 있는 주 문화 모델의 부족은 심각 하 게 와트 대사 및 약물 개발에 연구를 방해 한다. 이 위해 우리 와트 주 문화 라는 'SWAT' (샌드위치 백색 지방 조직)에 대 한 새로운 플랫폼을 개발 하는 microphysiologic 시스템의 NIH의 표준 활용 있다. 우리는 지방이 많은 파생 된 stromal 세포 시트 사이 다진된 와트 클러스터 사이 여 adipocytes의 자연 력 극복. 이 구문에서 와트 샘플 가능한 이상 8 주 문화에 있다. 스와트 유지 그대로 ECM, 셀 연락처 및 물리적 압력 조건의 vivo에서 와트; 또한, 기동 강력한 transcriptional 프로필, 외 인 화학 신호 및 전체 조직 기능에 감도 유지 합니다. SWAT의 주 지방 문화, 재현성, 간단 하 고 효과적인 메서드를 나타냅니다. 잠재적으로, 그것은 와트 생리학, 병 태 생리학, 물질 대사, 및 제약 개발 연구에 대 한 광범위 하 게 적용 가능한 플랫폼입니다.

SWAT의 처음 개별 와트 클러스터의 직렬 명시 화상 진 찰에 의해 평가 되었다 (n = 12) 약 7.6 주 동안. 클러스터에이 시간에 걸쳐 단층에 보안 남아 있었다. 약간의 형태학 상 변화는 개별 adipocytes 약간 휘게 하거나 위치 이동으로 관찰 되었다. 그러나, adipocytes도 될 multilocular 시간이 지남에 dedifferentiation의 부족을 나타내는 그들은 셀룰러 blebbing, 세포, 또는 조각화 (<strong class="x...

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A Microphysiologic Platform for Human Fat: Sandwiched White Adipose Tissue

흰색 adipose 조직 (WAT) 약물 개발 및 대사 연구를 방해, 그것의 현재 기본 문화 모델에 중요 한 결함을 있다. 여기, 선물이 stromal 세포 시트 사이 붙여 와트에 의해 많은 microphysiological 시스템을 생산 하는 프로토콜. 이 구조는 기본 와트 문화에 대 한 안정적이 고 융통성 있는 플랫폼을 제공합니다.

인간 지방 Microphysiologic 플랫폼: 백색 지방 조직에 끼여

White adipose tissue (WAT) plays a crucial role in regulating weight and everyday health.  Still, there are significant limitations to available primary ...

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Research

JoVE Journal

Behavior

6.3K 조회수.  Louisiana State University Health Sciences Center. 흰색 adipose 조직 (WAT) 약물 개발 및 대사 연구를 방해, 그것의 현재 기본 문화 모델에 중요 한 결함을 있다. 여기, 선물이 stromal 세포 시트 사이 붙여 와트에 의해 많은 microphysiological 시스템을 생산 하는 프로토콜. 이 구조는 기본 와트 문화에 대 한 안정적이 고 융통성 있는 플랫폼을 제공합니다.

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Isolation and Processing of Murine White Adipocytes for Transcriptome and Epigenome Analyses

Obesity is a complex disease influenced by genetics, epigenetics, the environment, and their interactions. Mature adipocytes represent the major cell type in white adipose tissue. Understanding how adipocytes function and respond to (epi)genetic and environmental signals is essential for identifying the cause(s) of obesity. RNA and chromatin have previously been isolated from adipocytes using enzymatic digestion. In addition, protocols have been developed for nuclear isolation, where purification is achieved by fluorescence-activated cell sorting (FACS) of adipocyte-specific transgenic reporters. One of the greatest challenges to achieving high yield and quality during such protocols is the substantial amount of lipid contained in adipose tissue. The present protocol describes an optimized procedure for isolating mature adipocytes that leverages heptane to separate lipids from the targets of interest (RNA/chromatin). The resulting RNA has high integrity and generates high-quality RNA-seq results. Likewise, the procedure improves nuclei yield rate and generates reproducible ChIP-seq results across samples. Therefore, the current study provides a reliable and universal murine adipocyte isolation protocol suitable for whole-genome transcriptome and epigenome studies.

The present protocol summarizes a universal method for isolating, purifying, and upstream processing of murine white adipocytes optimized for downstream total RNA sequencing, Nuclei Extraction by SONication (NEXSON), and ChIP-seq.

Obesity is a complex disease influenced by genetics, epigenetics, the environment, and their interactions. Mature adipocytes represent the major cell type ...

연구

유전학

Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots

Obesity has increased dramatically in the last few decades and affects over one third of the adult US population. The economic effect of obesity in 2005 reached a staggering sum of $190.2 billion in direct medical costs alone. Obesity is a major risk factor for a wide host of diseases. Historically, little was known regarding adipose and its major and essential functions in the body. Brown and white adipose are the two main types of adipose but current literature has identified a new type of fat called brite or beige adipose. Research has shown that adipose depots have specific metabolic profiles and certain depots allow for a propensity for obesity and other related disorders. The goal of this protocol is to provide researchers the capacity to identify and excise adipose depots that will allow for the analysis of different factorial effects on adipose; as well as the beneficial or detrimental role adipose plays in disease and overall health. Isolation and excision of adipose depots allows investigators to look at gross morphological changes as well as histological changes. The adipose isolated can also be used for molecular studies to evaluate transcriptional and translational change or for in vitro experimentation to discover targets of interest and mechanisms of action. This technique is superior to other published techniques due to the design allowing for isolation of multiple depots with simplicity and minimal contamination.

Due to the drastic and negative connection between obesity and other comorbidities, research on the role adipose plays in disease and overall health is warranted. We present a protocol for the isolation and excision of adipose depots allowing for the study of adipose using in situ and in vitro methods.

현지화, 식별 및 절제 쥣과 지방이 종점의

Obesity has increased dramatically in the last few decades and affects over one third of the adult US population. The economic effect of obesity in 2005 ...

의학

Three-Dimensional Culture of Vascularized Thermogenic Adipose Tissue from Microvascular Fragments

Engineering thermogenic adipose tissue (e.g., beige or brown adipose tissues) has been investigated as a potential therapy for metabolic diseases or for the design of personalized microtissues for health screening and drug testing. Current strategies are often quite complex and fail to accurately fully depict the multicellular and functional properties of thermogenic adipose tissue. Microvascular fragments, small intact microvessels comprised of arteriole, venules, and capillaries isolated from adipose tissue, serve as a single autologous source of cells that enable vascularization and adipose tissue formation. This article describes methods for optimizing culture conditions to enable the generation of three-dimensional, vascularized, and functional thermogenic adipose tissues from microvascular fragments, including protocols for isolating microvascular fragments from adipose tissue and culture conditions. Additionally, best practices are discussed, as are techniques for characterizing the engineered tissues, and sample results from both rodent and human microvascular fragments are provided. This approach has the potential to be utilized for the understanding and development of treatments for obesity and metabolic disease.

Here, we present a detailed protocol outlining the use of microvascular fragments isolated from rodent or human fat tissue as a straightforward approach to engineer functional, vascularized beige adipose tissue.

Microvascular Fragments에서 Vascularized Thermogenic Adipose Tissue의 3차원 배양

Engineering thermogenic adipose tissue (e.g., beige or brown adipose tissues) has been investigated as a potential therapy for metabolic diseases or for ...

생체공학

Using a Combination of Indirect Calorimetry, Infrared Thermography, and Blood Glucose Levels to Measure Brown Adipose Tissue Thermogenesis in Humans

In mammals, brown adipose tissue (BAT) is activated rapidly in response to cold in order to maintain body temperature. Although BAT has been studied greatly in small animals, it is difficult to measure the activity of BAT in humans. Therefore, little is known about the heat-generating capacity and physiological significance of BAT in humans, including the degree to which components of the diet can activate BAT. This is due to the limitations in the currently most used method to assess the activation of BAT-radiolabeled glucose (fluorodeoxyglucose or 18FDG) measured by positron emission tomography-computerized tomography (PET-CT).
This method is usually performed in fasted subjects, as feeding induces glucose uptake by the muscles, which can mask the glucose uptake into the BAT. This paper describes a detailed protocol for quantifying total-body human energy expenditure and substrate utilization from BAT thermogenesis by combining indirect calorimetry, infrared thermography, and blood glucose monitoring in carbohydrate-loaded adult males. To characterize the physiological significance of BAT, measures of the impact of BAT activity on human health are critical. We demonstrate a protocol to achieve this by combining carbohydrate loading and indirect calorimetry with measurements of supraclavicular changes in temperature. This novel approach will help to understand the physiology and pharmacology of BAT thermogenesis in humans.

Here, we present a protocol to quantify the physiological significance of the impact of brown adipose tissue (BAT) activity on human metabolism. This is achieved by combining carbohydrate loading and indirect calorimetry with measurements of supraclavicular changes in temperature. This novel approach can help develop a pharmacological target for BAT thermogenesis in humans.

간접 열량계, 적외선 체온 측정 및 혈당 수치의 조합을 사용하여 인간의 갈색 지방 조직 열 발생을 측정합니다.

In mammals, brown adipose tissue (BAT) is activated rapidly in response to cold in order to maintain body temperature. Although BAT has been studied ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-지우기: 조직 지방 조직의 3 차원 이미징 방법 삭제

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

생물학

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various techniques have been developed to study the morphology and biology of adipose tissue. However, conventional visualization methods are limited to studying the tissue in 2D sections, failing to capture the 3D architecture of the whole organ. Here we present whole-mount staining, an immunohistochemistry method that preserves intact adipose tissue morphology with minimal processing steps. Hence, the structures of adipocytes and other cellular components are maintained without distortion, achieving the most representative 3D visualization of the tissue. In addition, whole-mount staining can be combined with lineage tracing methods to determine cell fate decisions. However, this technique has some limitations to providing accurate information regarding deeper parts of adipose tissue. To overcome this limitation, whole-mount staining can be further combined with tissue clearing techniques to remove the opaqueness of tissue and allow for complete visualization of entire adipose tissue anatomy using light-sheet fluorescent microscopy. Therefore, a higher resolution and more accurate representation of adipose tissue structures can be captured with the combination of these techniques.

The focus of the present study is to demonstrate the whole-mount immunostaining and visualization technique as an ideal method for 3D imaging of adipose tissue architecture and cellular component.

전체-마운트 얼룩을 사용 하 여 3D 백색 지방 조직 구조의 시각화

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. Accordingly, techniques for harvesting and processing human adipose tissue have evolved in order to quickly and efficiently obtain large amounts of tissue. Among these, the closed system technology represents an innovative and easy-to-use system to harvest, process, and re-inject refined fat tissue in a short time and in the same intervention (intra-operatively). Adipose tissue is collected by liposuction, washed, emulsified, rinsed and minced mechanically into cell clusters of 0.3 to 0.8 mm. Autologous transplantation of mechanically fragmented adipose tissue has shown remarkable efficacy in different therapeutic indications such as aesthetic medicine and surgery, orthopedic and general surgery. Characterization of micro-fragmented adipose tissue revealed the presence of intact small vessels within the adipocyte clusters; hence, the perivascular niche is left unperturbed. These clusters are enriched in perivascular cells (i.e., mesenchymal stem cell (MSC) ancestors) and in vitro analysis showed an increased release of growth factors and cytokines involved in tissue repair and regeneration, compared to enzymatically derived MSCs. This suggests that the superior therapeutic potential of microfragmented adipose tissue is explained by a higher frequency of presumptive MSCs and enhanced secretory activity. Whether these added pericytes directly contribute to higher growth factor and cytokine production is not known. This clinically approved procedure allows the transplantation of presumptive MSCs without the need for expansion and/or enzymatic treatment, thus bypassing the requirements of GMP guidelines, and reducing the costs for cell-based therapies.

Here, we present human adipose tissue enzyme-free micro-fragmentation using a closed system device. This new method allows the obtainment of sub-millimeter clusters of adipose tissue suitable for in vivo transplantation, in vitro culture, and further cell isolation and characterization.

세포 표현형 및 분비 특성화를 위한 인간 지방 조직 미세 단편화

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. ...

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity is characterized by an increase in adipose tissue (AT) mass due to adipocyte hyperplasia and/or hypertrophia, leading to profound remodeling of its three-dimensional structure. Indeed, the maximal capacity of AT to expand during obesity is pivotal to the development of obesity-associated pathologies. This AT expansion is an important homeostatic mechanism to enable adaptation to an excess of energy intake and to avoid deleterious lipid spillover to other metabolic organs, such as muscle and liver. Therefore, understanding the structural remodeling that leads to the failure of AT expansion is a fundamental question with high clinical applicability. In this article, we describe a simple and fast clearing method that is routinely used in our laboratory to explore the morphology of mouse and human white adipose tissue by fluorescent imaging. This optimized AT clearing method is easily performed in any standard laboratory equipped with a chemical hood, a temperature-controlled orbital shaker and a fluorescent microscope. Moreover, the chemical compounds used are readily available. Importantly, this method allows one to resolve the 3D AT structure by staining various markers to specifically visualize the adipocytes, the neuronal and vascular networks, and the innate and adaptive immune cells distribution.

Here, we describe a simple, inexpensive and fast clearing method to resolve the 3D structure of both mouse and human white adipose tissue using a combination of markers to visualize vasculature, nuclei, immune cells, neurons, and lipid-droplet coat proteins by fluorescent imaging.

메틸살리실레이트 클리어링 및 3D 이미징에 의한 지방 조직 구조 탐구

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

<meta charset="utf8"></head><body>인간 SATMVEC: 분리 및 지방세포 누화 연구

Studying Adipose Endothelial Cell/Adipocyte Cross-Talk in Human Subcutaneous Adipose Tissue

Microvascular endothelial cells (MVECs) have many critical roles, including control of vascular tone, regulation of thrombosis, and angiogenesis. Significant heterogeneity in endothelial cell (EC) genotype and phenotype depends on their vascular bed and host disease state. The ability to isolate MVECs from tissue-specific vascular beds and individual patient groups offers the opportunity to directly compare MVEC function in different disease states. Here, using subcutaneous adipose tissue (SAT) taken at the time of insertion of cardiac implantable electronic devices (CIED), we describe a method for the isolation of a pure population of functional human subcutaneous adipose tissue MVEC (hSATMVEC) and an experimental model of hSATMVEC-adipocyte cross-talk.
hSATMVEC were isolated following enzymatic digestion of SAT by incubation with anti-CD31 antibody-coated magnetic beads and passage through magnetic columns. hSATMVEC were grown and passaged on gelatin-coated plates. Experiments used cells at passages 2-4. Cells maintained classic features of EC morphology until at least passage 5. Flow cytometric assessment showed 99.5% purity of isolated hSATMVEC, defined as CD31+/CD144+/CD45-. Isolated hSATMVEC from controls had a population doubling time of approximately 57 h, and active proliferation was confirmed using a cell proliferation imaging kit. Isolated hSATMVEC function was assessed using their response to insulin stimulation and angiogenic tube-forming potential. We then established an hSATMVEC-subcutaneous adipocyte co-culture model to study cellular cross-talk and demonstrated a downstream effect of hSATMVEC on adipocyte function.
hSATMVEC can be isolated from SAT taken at the time of CIED insertion and are of sufficient purity to both experimentally phenotype and study hSATMVEC-adipocyte cross-talk.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 피하 지방 조직 미세혈관 연구를 통한 심장 대사 질환에 대한 통찰력

Here, we describe a protocol for isolating, culturing, and phenotyping microvascular endothelial cells from human subcutaneous adipose tissue (hSATMVECs). Additionally, we describe an experimental model of hSATMVEC-adipocyte cross-talk.