이 연구는 미국 국립 과학 재단에 의해 제공 된 지원 (# 프로젝트: CHE 1339637) 미국 환경 보호국에서 추가 지원. 우리 일반 실험실 지원에 대 한 닥터 존스 코랄, 닥터 로렌 Kristofco, 개 빈 Saari, 사무엘 드는, Bekah Burket 및 Bridgett 힐 감사합니다.

이 프로토콜에서 연구 일반적으로 표준화 된 실험 설계를 수행 하 고 미국 환경 보호 기구 (EPA no. 2000.0) fathead 황 어에 대 한 경제 협력을 위한 조직에서 권장 되는 통계 분석 지침 및 제 브라에 대 한 개발 (OECD no. 236)입니다. 이러한 실험 디자인 (예를 들어, 복제 증가) 미래 연구에 대 한 현재 프로토콜 내에서 수정할 수 있습니다. 생선 문화 조건에 따라 이전 문학17게시. 모든 실험 절차와 물고기 문화 프로토콜 따라 베일 러 대학에서 승인 기관 동물 관리 및 사용 위원회 프로토콜.
1. 노출 물고기 화학 치료를
<ol><li>카페인 재구성된 하드 물에 용 해 하 여 카페인 노출 솔루션을 준비 합니다. 높은 카페인 치료 낮은 카페인 치료 수준의 생산 하드 물으로 희석 하 여 적절 한 직렬 희석을 수행 합니다. 주: 표 1 각이 실험에 사용 하는 치료 수준 요약 합니다.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">제 브라</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Fathead 미노</td>
		</tr>
<tr>
<td>치료</td>
			<td>공칭 카페인 농도 (mg/L)</td>
			<td>측정 된 카페인 농도 (mg/L)</td>
			<td>치료</td>
			<td>공칭 카페인 농도 (mg/L)</td>
			<td>측정 된 카페인 농도 (mg/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>제어</td>
			<td>0</td>
			<td>< LOD</td>
			<td>제어</td>
			<td>0</td>
			<td>< LOD</td>
		</tr>
<tr>
<td>75 Centile *</td>
			<td>0.001</td>
			<td>0.001</td>
			<td>75 Centile *</td>
			<td>0.001</td>
			<td>0.001</td>
		</tr>
<tr>
<td>95 Centile *</td>
			<td>신제품 개발: 0.039</td>
			<td>0.013</td>
			<td>95 Centile *</td>
			<td>신제품 개발: 0.039</td>
			<td>0.009</td>
		</tr>
<tr>
<td>99th Centile *</td>
			<td>0.412</td>
			<td>0.361</td>
			<td>99th Centile *</td>
			<td>0.412</td>
			<td>0.310</td>
		</tr>
<tr>
<td>THV</td>
			<td>4.07</td>
			<td>3.81</td>
			<td>THV</td>
			<td>4.07</td>
			<td>4.12</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% LC50</td>
			<td>48.46</td>
			<td>46.66</td>
			<td>10% LC50</td>
			<td>14.1</td>
			<td>14.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>40% LC50</td>
			<td>193.82</td>
			<td>186.67</td>
			<td>40% LC50</td>
			<td>56.38</td>
			<td>53.91</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 제 브라와 fathead 미노 실험에 대 한 실험적인 카페인 치료. 각 치료에 대 한 카페인의 공칭 및 측정 값을 받는다. *이 연구에 사용 된 카페인 치료 카페인16의 측정된 환경 값에 따라 노출 배포판의 위 centiles를 나타냅니다. THV: 치료 위험 값입니다. 탐지의 LOD: 제한
<ol start="2"><li>개별 노출 샴페인에 준비 솔루션을 붓는 다. Fathead 미노 노출 챔버에 대 한 노출 솔루션의 200 mL와 함께 가득한 제 브라 노출 챔버에 대 한 노출 솔루션의 20 mL 100 mL 유리 비 커와 500 mL 비 커를 사용 합니다.</li>
	<li>전송 피 펫을 사용 하 여, 각 치료 마다 4 개의 복제 노출 챔버 10 zebrafish 태아 세 4-6 h 게시물 수정 (hpf)를 배치 합니다.</li>
	<li>장소 10 fathead 미노 애벌레 치료 당 3 복제 노출 챔버의 각 화의 24 시간 이내 세. Fathead 미노 애벌레의 더 큰 크기에 맞게 잘라 전송 피 펫의 끝 이전에 전송.</li>
	<li>16:8 h 빛: 다크 photoperiod 28 ±의 일정 한 온도에서 zebrafish 실험 유지 1 ° c. 사용 하 여 동일한 photoperiod 정권 fathead 미노 연구에 대 한 하지만 25 ±의 온도 1 ° c.</li>
	<li>
화학 노출의 96 h, 후 부하 개별 물고기 (zebrafish)를 위한 48의 24 (fathead 미노)에 대 한 별도 우물에 잘 접시.
	<ol>
<li>각 잘 솔루션의 동일한 볼륨을 포함 하는 보장 하기 위해, zebrafish 애벌레 48 잘 플레이트 잘 당 1000 µ L 볼륨에 대 한 5000 µ L autopipette를 사용 하 여 전송. 철수와 전송 zebrafish 애벌레 및 노출 하는 autopipette를 사용 하 여 솔루션을 동시에.</li>
		<li>그들의 큰 크기로 인해, fathead 미노 애벌레 차단 팁 전송 피 펫을 사용 하 여 전송 합니다. 각 개별 웰 스 fathead 미노 애벌레를 전송 하기 전에 채우기는 autopipette를 사용 하 여 2000 µ L을 잘. 웰 스에 개별 fathead 애벌레를 전송할 때 전송 피 펫 팁 잘 솔루션에 놓고 잘으로 피 펫 팁에서 수영 하는 물고기를 허용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. 교정 비디오 추적 매개 변수
<ol><li>
행동 조치 전에 비디오 트랙 소프트웨어에 관찰 및 교정 매개 변수 설정 (재료의 표 참조).
	<ol>
<li>1 애벌레 물고기 개별 잘에서 녹음 실에서 잘 접시를 놓습니다. 보정 매개 변수를 설정 표현으로 판과 관련 된 물고기를 사용 합니다.</li>
		<li>비디오 트랙 소프트웨어에서 클릭 "파일 | 생성 프로토콜", 어떤"프로토콜 작성 마법사"대화 상자가 열립니다. "위치 수" 필드에 잘 접시의 개인 우물의 수를 입력 하 고 "확인"을 클릭 합니다.</li>
		<li>화면 상단에서 클릭 "보기 | 전체 화면 "을 잘 플레이트의 오버 헤드 카메라 뷰를 표시 하려면 시스템을 묻는 메시지가 표시 됩니다.</li>
		<li>3 여러 모양으로 나타나는 "그리기 영역" 아이콘을 클릭. 보기 영역 잘 접시의 오른쪽에 "지역"를 표시 하는 필드에 원 아이콘을 선택 합니다.</li>
		<li>커서를 사용 하 여 추적 영역 잘 플레이트의 왼쪽 상단에 원형 비디오의 윤곽을 그리 다. "오른쪽 위 마크" 선택한 다음 상단 오른쪽 잘의 보기 영역을 설명 합니다. 그런 다음, "하단 마크" 하단 오른쪽 잘 윤곽을 선택 합니다. 참고: 원형 윤곽을 그리기, 후의 위치 가능성이 하셔야 조정 해야 합니다.  윤곽선의 위치를 조정 하려면 "선택"을 클릭 하 고 개요 영역을 이동 하려면 커서를 사용 합니다. 또한, 윤곽선 "복사본" 및 다음 "붙여넣기"를 클릭 하 여 복제 될 수 있습니다.</li>
		<li>후 왼쪽 상단, 오른쪽, 상단, 하단 오른쪽 잘 추적 영역으로 정의 된 "빌드" 소프트웨어 자동으로 나머지 우물의 보기 영역을 나타내는 표시를 클릭 합니다.</li>
		<li>"교정" 표시 된 영역에서 "인출 규모"를 클릭 합니다. 커서를 사용 하 여 접시에 걸쳐 가로 선을 그립니다. 라인을 그려 "교정 측정" 이라고 표시 된 대화 상자가 표시 됩니다. 잘 플레이트 길이 입력 하 고 "확인"을 클릭 합니다.</li>
		<li>"그리기 영역" 아이콘을 클릭 하 여 그리기 관리자를 종료 합니다.</li>
		<li>"타일" 아이콘을 클릭 합니다.  커서를 사용 하 여 각 상자는 녹색 보기 화면에 표시 되는 모든 상자를 강조 표시 합니다. 참고: 6 개별 작은 사각형의 그룹으로 타일 아이콘 표시</li>
		<li>"보기 | 전체 화면 "입니다.  보기 영역 접시의 오른쪽에 "검출 임계값" 상자에서 "Bkg"을 클릭 합니다. 임계값 조절 막대를 사용 하 여 픽셀 검출 임계값을 설정 하려면. 적절 한 픽셀 검출 임계값을 선택 하는 한 번, "그룹에 적용"을 클릭 하십시오. 참고:이 프로토콜 설정 합니다 감지 임계값 zebrafish 관찰에 대 한 블랙 모드에서 13, 110에 fathead 미노 관찰에 대 한 투명 모드에서.</li>
		<li>"이동 임계값" 표시 상자에서 원하는 운동 속도 추적 매개 변수를 입력 합니다. 속도 매개 변수가 설정 되 면 "그룹에 적용"을 클릭 합니다. 참고:이 프로토콜 5 mm/s에서 20 m m/s 및 비활성/작은 움직임에서 작은/큰 움직임을 설정합니다. 이 선택 세 가지 다른 속도 수준에서 애벌레 물고기 움직임을 추적 하는 소프트웨어 프로그램: 비활성 (동결) = < 5 mm/s, 소형 (크루즈) = 5-20 m m/s, 그리고 큰 (파열) = > 20 m m/s.</li>
		<li>클릭 "매개 변수 | 프로토콜을 매개 변수 "드롭 다운 메뉴에서 합니다. 대화 상자에서 Enter 관측 시간 및 통합 시간 "시간" 탭을 선택 합니다. 매개 변수를 입력 한 후 "확인"을 클릭 합니다.</li>
		<li>설정 하려면 명암 photoperiod 시간과 광도 빛 드라이버 설정 대화 상자 "매개 변수"에서 "라이트 운전"을 선택 하 여 각 photoperiod 오픈에 대 한 드롭 다운 메뉴. 주: 여러 빛-어둠 photoperiods를 설정 하기 위한 프로토콜 비디오를 참조 하십시오.</li>
		<li>비디오 추적 매개 변수를 설정 관찰 프로토콜을 저장 합니다. 참고:이 프로토콜 4 명암 단계 구성 된 두 개의 10 분 빛 및 2 개의 10 분 어두운 기간을 변경 하 여 다음 10 분 새 환경 순응 단계를 포함 하는 50 분 동안 물고기 동작을 관찰 합니다. 통합 시간 50 분 행동 재판의 각 분에 대 한 동작을 측정 하기 위해 설정 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 애벌레 물고기 운전의 관찰 및 Photomotor 동작
<ol><li>행동 녹음 실에서 실험 물고기를 포함 하는 잘 접시를 놓습니다.</li>
	<li>추적 소프트웨어 비디오에서 3 단계에서 개발 추적 프로토콜을 엽니다.</li>
	<li>비디오 추적 뷰어에서 모든 애벌레는 컴퓨터 화면에서 볼 수 있는지 확인 하려면, 그 하나의 개별 유 충은 각 음에 존재 하 고 개별 우물 2.1.5 및 2.1.6 단계에서 정의 된 관측 영역 내에서 정렬 됩니다 확인 합니다.</li>
	<li>클릭 "실험 | "실행 합니다. 참고: 시스템 이름 및 관측 데이터를 저장할 위치를 입력 하 라는 메시지가 나타납니다.</li>
	<li>일단 이름 및 저장 위치 관측의 데이터 지정, 모든 미리 정의 된 보기 영역을 강조 하기 위해 "여러 라이브 이미지" 아이콘을 클릭 참고:이 아이콘 컴퓨터 화면의 상단에 위치 하 고 4 개의 작은 사각형으로 분할 상자 나타납니다. 이 아이콘을 클릭 하면 모든 미리 정의 된 보기 영역을 강조 표시 됩니다.</li>
	<li>녹음 실의 패널을 닫고 클릭 "배경 | 시작 "컴퓨터 모니터에.</li>
</ol>4. 행동 데이터 분석
<ol><li>애벌레 물고기 활동 데이터를 검색 하려면 추적 소프트웨어에 의해 자동으로 컴파일 및 행동 실험 (3.4 단계)을 시작 하기 전에 사용자가 지정한 폴더에 스프레드시트를 엽니다.</li>
	<li>각각 그림 1A 및 1B 순진한 unexposed zebrafish fathead 미노 애벌레, 운동 활동의 대표적인 측정을 참조 하십시오. 효과적으로 빛이 어둡거나 빛 어두운 전환 움직임 차이의 크기를 검사 하는 PMR 계산 그림 1C 및 1d 를 참조 하십시오.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57938/57938fig1.jpg"> 그림 1: 노출 되지 않은 제 브라 (A 및 B) 및 fathead 미노 (C , D)의 초기 활동의 예입니다. 제 브라 (A)에 대 한 평균 (± SEM) 거리 수영 및 fathead 미노 (C) 활동의 각 대표 1 분 간격으로 점 들에 의해 주어진 다. 두 어둡고 photomotor 응답의 2 개의 빛 기간 측정 됩니다. 마지막 (a, c, e, 및 g) 및 (b, d, f, 그리고 h) 첫 번째 분 photoperiod 각의 zebrafish (B)의 PMRs Photomotor 응답을 계산 하는 데 사용 됩니다 및 fathead 미노 (D)는 마지막 순간 사이 여행을 하는 의미 (±SEM) 거리에 변화 측정 초기 photoperiod와 다음 기간의 첫 번째 분. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57938/57938fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

<ol>
	<li>Malaj, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organic+chemicals+jeopardize+the+health+of+freshwater+ecosystems+on+the+continental+scale.">Organic chemicals jeopardize the health of freshwater ecosystems on the continental scale.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (26), 9549-9554 (2014).</li><li>Sch&#228;fer, R. B., K&#252;hn, B., Malaj, E., K&#246;nig, A., Gergs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+organic+toxicants+to+multiple+stress+in+river+ecosystems.">Contribution of organic toxicants to multiple stress in river ecosystems.</a> Freshwater Biology. 61 (12), 2116-2128 (2016).</li><li>Andersen, M. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Toxicity testing in the 21st century: a vision and a strategy. , (2007).</li><li>Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+matters:+developmental+stage+of+Danio+rerio+larvae+influences+photomotor+response+thresholds+to+diazinion+or+diphenhydramine.">Age matters: developmental stage of Danio rerio larvae influences photomotor response thresholds to diazinion or diphenhydramine.</a> Aquatic Toxicology. 170, 344-354 (2016).</li><li>Rihel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+behavioral+profiling+links+drugs+to+biological+targets+and+rest/wake+regulation.">Zebrafish behavioral profiling links drugs to biological targets and rest/wake regulation.</a> Science. 327 (5963), 348-351 (2010).</li><li>Kokel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+behavior-based+identification+of+neuroactive+small+molecules+in+the+zebrafish.">Rapid behavior-based identification of neuroactive small molecules in the zebrafish.</a> Nature Chemical Biology. 6 (3), 231-237 (2010).</li><li>Bruton, T., Alboloushi, A., DeL a Garza, B., Kim, B. -. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fish+on+Prozac+(and+Zoloft):+ten+years+later.">Fish on Prozac (and Zoloft): ten years later.</a> Aquatic Toxicology. 151, 61-67 (2014).</li><li>Huggett, D., Cook, J., Ericson, J., Williams, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+theoretical+model+for+utilizing+mammalian+pharmacology+and+safety+data+to+prioritize+potential+impacts+of+human+pharmaceuticals+to+fish.">A theoretical model for utilizing mammalian pharmacology and safety data to prioritize potential impacts of human pharmaceuticals to fish.</a> Human and Ecological Risk Assessment. 9 (7), 1789-1799 (2003).</li><li>Fitzsimmons, P. N., Fernandez, J. D., Hoffman, A. D., Butterworth, B. C., Nichols, J. 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A., Haddad, S. P., Chambliss, C. K., Brooks, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+uptake+of+and+sensitivity+to+diphenhydramine+in+embryonic+and+larval+zebrafish.">Differential uptake of and sensitivity to diphenhydramine in embryonic and larval zebrafish.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 37, 1175-1181 (2018).</li><li>Steele, W. B., Kristofco, L. A., Corrales, J., Saari, G. N., Haddad, S. P., Gallagher, E. P., Kavanagh, T. J., Kostal, J., Zimmerman, J. B., Voutchkova-Kostal, A., Anastas, P. T., Brooks, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+behavioral+toxicology+of+two+common+larval+fish+models:+exploring+relationships+between+modes+of+action+and+locomotor+responses.">Comparative behavioral toxicology of two common larval fish models: exploring relationships between modes of action and locomotor responses.</a> Science of the Total Environment. 460-461, 1587-1600 (2018).</li></ol>

저자는 공개 없다.

행동 독성 학 연구에 대 한 화학 치료 수준을 선택할 때 여러 가지 요인은 고려해 야 합니다. 현재 연구에서 카페인 치료 수준에서 폐수 유출16예측된 환경 노출 시나리오에 대 한 상위 centile 값에 따라 선정 됐다. 가능 하면 우리가 일상적으로 수생 독성 연구 환경 관측19,,2021의 개 연 론 노출 평가 사용 하 여 처리 레벨을 선택 합니다. 의약품에 대 한 계산 가능한 THV 또한 현재 연구에서 치료 수준으로 포함 되었다. THV 값 (식 1)22,23 예측된 물 농도 물고기23조 제약의 인간의 치료 복용량 (Cmax)로 이어지는로 정의 됩니다, 초기 플라즈마 노력24, 모델링에서 영감 있고 혈액: 물 화학 분할 계수 (식 2)25에 따라 계산 합니다.
THV C최대 = / PBW (식 1) 로그
로그 PBW 로그 = [(100.73. Kow 로그 · 0.16) + 0.84] (식 2)
여기, 우리는 또한 zebrafish 및 fathead 미노 LC50 값을 기준으로 sublethal 치료 수준을 선택합니다. 우리이 이렇게 행동 반응에 대 한 유용한 벤치마킹 절차 특히 때 고려해 여러 화학 물질에 걸쳐 물고기 모델 특정 동작의 임계값을 비교 합니다. 그것은 더 급성 진단 기계 연구와 평가 대 한 수생 독성에 유용 될 수 있는 만성 비율의 계산을 지원 합니다. LC50 값 단계 2.1에에서 주어진 표준된 지침에 따라 예비 독성 생물 검정에서 얻은 했다.
이 프로토콜에서 일반적인 실험적인 디자인을 채용 하 고 통계적 기법 물고기 모델 독물학 연구를 위한 표준화 된 방법 미국 EPA와 OECD에서 권장. 비록 우리가 보고 p 값 (예., < 0.01, < 0.05, < 0.10), 큰 차이가 (α = 0.10) 활동 수준의 경우 분산 분석 (ANOVA)을 사용 하 여 치료 중 식별 됩니다 정상 및 분산 정의의 등가 충족 됩니다. Dunnett의 또는 Tukey의 HSD 포스트 hoc 테스트 치료 수준 차이 식별 하기 위해 수행 됩니다. 우리 선택이 알파 (α = 0.10) 값을 유형 II 오류, 특히 초기 계층 분석 및 대신 understudied 행동 끝점 및 모델 생물26, 생물학으로 중요 한 효과 크기의 이해는 제한 하는 경우 여러 비교를 위해 생물 의학에서 일반적인 절차를 사용 (예., Bonferroni 보정 RNA-Seq 데이터에 대 한)27.  미래의 연구는 이러한 행동 반응의 다양성을 이해 하 고 그에 따라 실험 디자인 (예를 들어, 증가 복제) 수정 필요 합니다.
요인의 수 화학 노출 이외에 애벌레 물고기의 행동을 좌우할 수 있다. 예를 들어, 나이, 잘 크기, 온도, 조명 조건, 및 각 잘 나타내는 중요 한 고려 사항11,30노출 솔루션의 시간. 이러한 이유로 주의 실험 중 애벌레 물고기의 운동 동작에 영향을 미칠 수 있는 외부 요인의 영향을 최소화 하기 위해 취해야 한다. 행동 관찰 좁은 시간 창 (3 ~ 4 h)와 하루 효과의 시간 애벌레 운동 동작11에 최소한의 영향을 미칠 것으로 예상 하는 때 기간에 걸쳐 수행 되어야 한다. 또한, 애벌레 물고기 유지 되어야 한다 (28 ± 1 ° C zebrafish)와 24 ± 1 ° C FHM에 대 한 일관 된 온도에 그리고 노출 기간 동안 인큐베이터 온도 제어에 정의 된 명암 주기. 또한, 행동 기록 됩니다 실험실의 온도 조건에 동작 온도 영향을 피하기 위해 실험 조건에 가깝게 유지 되어야 한다. 또한, 행동 관찰 하는 동안 사용 하는 웰 스 각 개별 물고기에 대 한 일관성 있는 볼륨에서 유지 되어야 합니다.
애벌레와 배아 zebrafish PMRs 이전에서 사용 된 생물 의학 과학 소설 화합물12,13대 한 잠재적인 치료 목표를 식별 하 이 프로토콜 zebrafish 이전 행동 연구 조사 환경 오염 물질의 화학 bioactivity 38 끝점을 사용 하 여 확장 합니다. 카페인은 행동 (MoA)의 이해 메커니즘으로 일반적인 수 중 오염 물질, 상거래에 많은 화합물 중요 한 기계적 데이터가 부족 합니다. 따라서,이 프로토콜은 MoAs의 독성 데이터를 상용 화학 물질39를 포함 하 여 부족 한 화합물에 대 한 통찰력을 얻기 위해 사용할 수 있습니다. 또한, 프로토콜 두 가장 일반적으로 사용 되 어 모델에 대 한 메서드를 제공합니다. 설명 했 듯이 이전에 제 브라는 일반적인 생물 생선 모델을 ecotoxicology에서 점점 인기 끌고있다, 미노는 일반적으로 환경 평가 응용 프로그램에 대 한 생태 모델으로 사용 되지만 받은 fathead 자동화 된 시스템은 제 브라에 비해 행동 연구에 비교적 덜 관심. 물고기 행동 독성 학 연구에 대 한 표준화 아무 규제 방법 남아,이 프로토콜 향후 지원에 대 한 접근을 제공 합니다.
카페인 수생 환경16에서 발견 된 수준에서 물고기 모델의 각에 행동 반응 elicited. 로드 리 게 스-길 외. 2018 글로벌 환경 노출 배포판 카페인16의 측정된 값에 따라 수생 시스템 개발. 특히, 예측된 폐수 방류 수 농도의 95%는 현재 연구 (표 2)에서 제 브라와 fathead 미노의 가장 중요 한 행동 끝점에 대 한는 LOECs 아래 나누어질 것 이다. 카페인의 여러 가지 행동 효과 환경 관련 수준 (특히 어두운 조건)에서 zebrafish에 관찰 되었다, 그러나 그것은 불분명 여부 이러한 행동 수정 또는 천연 물고기 인구에 발생할 수 있습니다 결과 생태학적으로 중요 한 불리 한 결과입니다. 하지만 민감한, 진단 검사 목적에 유용, 애벌레 물고기 행동 임계값 대표 다른 생활사 단계 또는 자연적인 인구에 있는 물고기의 수 있습니다. 더 연구는 보증 비슷한 여부 결정 하 행동 응답 임계값 것 자연에서 발생 되며 생물 학적 조직의 개인 이나 인구 수준에 불리 한 결과의 표시.

비록 물고기 모델을 생물 의학 연구를 위해 점점 사용 된다, 물고기는 정기적으로 고용 생태 및 생리 연구, 표면 바다의 오염을 확인 하 고 화학 물질의 독성에 관한 임계값 이해를. 화학 오염 수 중 생태계에 악영향을 줄 수 있기 때문에 소스 물 공급1,2의 품질을 위태롭게 그러한 노력이 중요 하다. 그러나 상거래, 부족에에서 화학 물질의 대부분도 기본적인 독물학 정보3.
전통적으로 규제 독성 시험에 사용 하는 동물 모델 분석 실험 자원 집중 및 높은 처리량을 제공할 수 없습니다 독성 21 세기4에 테스트에 필요한 초기 계층 심사. 그 후, 채택 하 고 활용할 수 있는 보다 신속 하 고 효율적으로 화면 생물 학적 활동3,5용 생체 외에서 모델 성장 원동력이입니다. 셀 기반 모델 제시 많은 기회, 하지만 그들은 종종 생물학적 복잡성, 부족 하 고 따라서 대사6을 포함 하 여 많은 중요 한 전체 유기 체 프로세스에 대 한 계정을 하지 않습니다.
Zebrafish는 수생 독성 및 ecotoxicology7,8대체 모델로 인기를 얻고 있다 일반적인 생물 동물 모델입니다. 그들의 작은 크기, 빠른 개발 및 높은 통치 감안할 때, 물고기 모델 신속 하 고 효율적으로 화면 bioactivity 및 전체 유기 체 규모9에 독성 화학 물질을 사용할 수 있습니다. 자동된 추적 소프트웨어의 도움으로 애벌레 zebrafish 행동 독성10,11에 대 한 오염 물질 차단에 향상 된 진단 유틸리티를 제공 합니다. 운동 끝점 행동의 화학적 메커니즘의 정보 표현 형 동작을 사용할 수 있습니다 및 다음 미정 비 발한 분자12, subcellular 목표를 식별할 수는 약 학에 학문은 설명 했다 13. Zebrafish는 생물 의학에서 인기 있는 애벌레 물고기 모델 이다, 반면 fathead 미노는 ecotoxicology 연구 및 예비 하는 동안 사용 되는 일반적인, 생태학적으로 중요 한 물고기 모델 (예를 들어, 새로운 화학 평가) 및 (예를 들어, 주위 표면 물 또는 폐수 유출 방전 모니터링) 회고전의 환경 평가 불행히도, 애벌레 fathead 황 어의 행동 답변 zebrafish 보다 현저 하 게 더 적은 주목을 받았다. 우리의 지속적인 연구 모델과 2 개의 일반적인 애벌레 물고기, zebrafish 및 fathead 미노 애벌레 물고기 패턴 표시 예상된 모드 또는 다양 한 화학 물질에 대 한 행동의 메커니즘에 나왔다. 따라서, 행동 끝점 신속 하 고 민감하게 독성에 대 한 화학 물질을 확인 하 고 초기 계층 평가 중 특히 산업 화학 및 기타 오염 물질에 대 한 subcellular 목표를 식별 하는 잠재력을 제공 합니다.
여기, 우리 보고 애벌레 물고기에 행동 반응 프로필을 조사 하기 위한 프로토콜. 카페인, 모델 neurostimulant과 다음 인간의 소비 식품의 폐수 처리 식물에서 방전을 통해 수 중 시스템을 도입 하는 일반적인 수 중 오염 물질을 사용 하 여 이러한 방법을 보여 줍니다 음료, 그리고 제약 카페인14와 공식화입니다. 두 애벌레 zebrafish 및 fathead 미노, 조명 조건, 수시로 불린다 photomotor 응답 (PMR)으로 배아와 애벌레 제약 연구 기간 동안에 급격 한 변화를 포함 하 여 카페인 행동 응답 검토 zebrafish13,15. 우리 각 물고기 모델에 대 한 화학 응답 프로 파일을 개발 하는 여러 운동 끝점을 통해 카페인의 효과 식별 합니다. 이 연구에 사용 하는 치료 수준 카페인 카페인16의 측정된 환경 값에 따라 노출 배포판의 위 centiles를 나타냅니다. 우리는 또한 애벌레 물고기 LC50 값, 그리고 치료 위험 값 (THV), 물고기 인간 치료 플라즈마 복용량과 일치에 플라스마 수준에서 결과를 예상 하는 물에 약 제 농도를 벤치마킹 하는 치료를 포함 합니다.

<table><tbody><tr><td>ViewPoint Zebrabox</td><td>ViewPoint</td><td></td><td>ZebraLab and ZebraLab platform for automated behavioral observations</td></tr><tr><td>Caffeine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0750-100G</td><td>Study chemical</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>VWR</td><td>9110589</td><td>Maintains light/dark cycle and temperature for fathead minnow experiments</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35824-636</td><td>Maintains light/dark cycle and temperature for zebrafish experiments</td></tr><tr><td>100 mL glass beakers</td><td>VWR</td><td>89000-200</td><td>Zebrafish exposure chambers&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>500 mL glass beakers&amp;nbsp;</td><td>Pyrex</td><td>EW-34502-03</td><td>Fathead minnow exposure chambers</td></tr><tr><td>5,000 &amp;micro;L auto-pipette</td><td>Eppendorf</td><td>Research 5000</td><td>Used to fill individual wells in well plates</td></tr><tr><td>Transfer Pippettes</td><td>VWR</td><td>414-004-004</td><td>Used to transfer study organisms&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>48-well plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-52</td><td>Larval zebrafish behavioral recording chambers</td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>VWR</td><td>10062-896</td><td>Larval fathead minnow behavioral recording chambers</td></tr><tr><td>Calcium sulfate dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3771</td><td>For reconstituted hard water</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td>For reconstituted hard water</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>For reconstituted hard water</td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>For reconstituted hard water</td></tr><tr><td>z-mod recirculating system</td><td>Marine Biotech Systems</td><td></td><td>Recirculating system to maintian zebrafish cultures</td></tr><tr><td>Statistical analysis software</td><td>Sigma Plot&amp;nbsp;</td><td>Version 13.0</td><td>Used to analyze beahvioral data and produce figures</td></tr><tr><td>Statistical analysis software</td><td>Graphpad Prism</td><td>Prism 5</td><td>Used to produce figures&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Autosampler/quaternary pumping system</td><td>Agilent Technologies</td><td>Infinity 1260 model&amp;nbsp;</td><td>Analytical verification of caffeine treatment levels</td></tr><tr><td>Jet stream thermal gradient electrospray ionization source</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>Analytical verification of caffeine treatment levels</td></tr><tr><td>Triple quadrupole mass analyzer&amp;nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>Model 6420</td><td>Analytical verification of caffeine treatment levels</td></tr><tr><td>10&amp;nbsp;cm&amp;nbsp;&amp;times;&amp;nbsp;2.1&amp;nbsp;mm Poroshell 120 SB-AQ column (120&amp;Aring;, 2.7)&amp;nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>685775-914T</td><td>Caffiene chromatography&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MassHunter Optimizer Software&amp;nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>Determine the ionization mode, monitored transitions, and instrumental parameters for caffeine/caffeine-d9 and paraxanthine/paraxanthine-d6</td></tr></tbody></table>

experimental protocol for examining behavioral response profiles in larval fish: application to the neuro-stimulant caffeine

물고기 모델과 행동 점점 생명 과학;에 사용 그러나, 오랫동안 물고기 생태, 생리 및 독성에 관한 연구의 대상이 되고있다. 디지털 추적 플랫폼을 자동화를 사용 하 여, neuropharmacology에 최근 노력 소설 작은 분자에 대 한 잠재적인 치료 표적 식별 애벌레 물고기 운동 동작을 활용 하. 이러한 노력에 비슷한 환경 과학 및 비교 약리학 연구 및 독성 오염 물질의 계층된 평가에 대 한 표면 바닷물의 실시간 모니터링 진단 도구로 물고기 모델의 다양 한 동작을 검사는 오염 물질의 위협 Zebrafish는 생물 의학에서 인기 있는 애벌레 물고기 모델 이다, 반면 fathead 미노 ecotoxicology에서 일반적인 애벌레 물고기 모델입니다. 불행히도, fathead 미노 애벌레 행동 연구에 상당히 적은 관심을 받았습니다. 여기, 우리 개발 모델 neurostimulant로 카페인을 사용 하 여 행동 프로 파일 프로토콜을 설명 하 고. Fathead 황 어의 photomotor 응답 했다 카페인에 의해 때때로 영향을, 비록 zebrafish photomotor 및 환경 관련 수준 응답 운동 끝점에 대 한 현저 하 게 더 과민 했다. 미래의 연구가 필요 나이 및 시간와 물고기 간의 비교 행동 감도 차이 이해 하 고 비슷한 행동 효과 자연에서 발생 하는 것 개인에 불리 한 결과의 표시 될 있는지 확인 또는 생물 학적 조직의 인구 수준입니다.

카페인 치료 수준을 분명 zebrafish 및 fathead 황 어와 96 h 실험 동안 다 하지 않았다. 예를 들어 표 1 각 치료 수준의 농도를 분석 검증된을 선물 한다. 이 프로토콜 동위 원소 희석 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS) 이전에 보고 된 방법28를 일반적으로 다음에 의해 카페인 치료 수준에 대 한 물 샘플을 확인 합니다. Paraxanthine, 카페인의 1 차 대사 산물의 형성 또한 정량 했다. 이러한 분석 절차의 설명에 보충 분석 정보 제공 됩니다. 치료의 공칭 및 분석 검증 사이 상사 성 때문에 공칭 치료 수준이이 논문의 나머지 부분에 걸쳐 표시 됩니다. 카페인은 크게 zebrafish 및 fathead 미노 동작 변경. 그러나, zebrafish 운동 응답은 더 fathead 황 어 보다 카페인에 민감한 일관 되 게 되었다. 제 브라와 fathead 미노 애벌레에 대 한 가장 중요 한 행동 끝점 카페인 0.039 밀리 그램의 농도에 의해 영향을 받은/최저 관찰된 영향 농도 (LOECs) 및 아무 관찰 된 효과 농도 (NOECs) 나 표 2 요약 대 한 두 가지 물고기 모델에서 각 행동 끝점입니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">제 브라</td>
			<td colspan="3">Fathead 미노</td>
		</tr>
<tr>
<td>끝점</td>
			<td>LOEC (mg/L)</td>
			<td>NOEC (mg/L)</td>
			<td>끝점</td>
			<td>LOEC (mg/L)</td>
			<td>NOEC (mg/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>총 거리 어둠</td>
			<td>0.412</td>
			<td>신제품 개발: 0.039</td>
			<td>총 거리 어둠</td>
			<td>−</td>
			<td>56.38</td>
		</tr>
<tr>
<td>총 거리 빛</td>
			<td>48.46</td>
			<td>4.07</td>
			<td>총 거리 빛</td>
			<td>−</td>
			<td>56.38</td>
		</tr>
<tr>
<td>총 수 다크</td>
			<td>0.412</td>
			<td>신제품 개발: 0.039</td>
			<td>총 수 다크</td>
			<td>−</td>
			<td>56.38</td>
		</tr>
<tr>
<td>총 수 빛</td>
			<td>48.46</td>
			<td>4.07</td>
			<td>총 수 빛</td>
			<td>−</td>
			<td>56.38</td>
		</tr>
<tr>
<td>거리 어둠 붕괴</td>
			<td>−</td>
			<td>193.82</td>
			<td>거리 어둠 붕괴</td>
			<td>−</td>
			<td>56.38</td>
		</tr>
<tr>
<td>거리 빛 파열</td>
			<td>193.82</td>
			<td>48.46</td>
			<td>거리 빛 파열</td>
			<td>−</td>
			<td>56.38</td>
		</tr>
<tr>
<td>어두운 건의 파열</td>
			<td>193.82</td>
			<td>48.46</td>
			<td>어두운 건의 파열</td>
			<td>−</td>
			<td>56.38</td>
		</tr>
<tr>
<td>붕괴 수 빛</td>
			<td>193.82</td>
			<td>48.46</td>
			<td>붕괴 수 빛</td>
			<td>−</td>
			<td>56.38</td>
		</tr>
<tr>
<td>기간 어둠 붕괴</td>
			<td>193.82</td>
			<td>48.46</td>
			<td>기간 어둠 붕괴</td>
			<td>−</td>
			<td>56.38</td>
		</tr>
<tr>
<td>금지 기간 빛</td>
			<td>−</td>
			<td>193.82</td>
			<td>금지 기간 빛</td>
			<td>−</td>
			<td>56.38</td>
		</tr>
<tr>
<td>순항 거리 어둠</td>
			<td>0.412</td>
			<td>신제품 개발: 0.039</td>
			<td>순항 거리 어둠</td>
			<td>−</td>
			<td>56.38</td>
		</tr>
<tr>
<td>순항 거리 빛</td>
			<td>48.46</td>
			<td>4.07</td>
			<td>순항 거리 빛</td>
			<td>−</td>
			<td>56.38</td>
		</tr>
<tr>
<td>어두운 계산 순항</td>
			<td>0.412</td>
			<td>신제품 개발: 0.039</td>
			<td>어두운 계산 순항</td>
			<td>−</td>
			<td>56.38</td>
		</tr>
<tr>
<td>순항 건의 빛</td>
			<td>48.46</td>
			<td>4.07</td>
			<td>순항 건의 빛</td>
			<td>−</td>
			<td>56.38</td>
		</tr>
<tr>
<td>크루 징 기간 어둠</td>
			<td>0.412</td>
			<td>신제품 개발: 0.039</td>
			<td>크루 징 기간 어둠</td>
			<td>−</td>
			<td>56.38</td>
		</tr>
<tr>
<td>크루 징 기간 빛</td>
			<td>48.46</td>
			<td>4.07</td>
			<td>크루 징 기간 빛</td>
			<td>−</td>
			<td>56.38</td>
		</tr>
<tr>
<td>어두운 거리를 고정</td>
			<td>0.412</td>
			<td>신제품 개발: 0.039</td>
			<td>어두운 거리를 고정</td>
			<td>신제품 개발: 0.039</td>
			<td>0.001</td>
		</tr>
<tr>
<td>고정 거리 빛</td>
			<td>신제품 개발: 0.039</td>
			<td>0.001</td>
			<td>고정 거리 빛</td>
			<td>−</td>
			<td>56.38</td>
		</tr>
<tr>
<td>어 어두운 계산</td>
			<td>0.412</td>
			<td>신제품 개발: 0.039</td>
			<td>어 어두운 계산</td>
			<td>−</td>
			<td>56.38</td>
		</tr>
<tr>
<td>냉동 수 빛</td>
			<td>48.46</td>
			<td>4.07</td>
			<td>냉동 수 빛</td>
			<td>−</td>
			<td>56.38</td>
		</tr>
<tr>
<td>어두운 기간을 동결</td>
			<td>−</td>
			<td>193.82</td>
			<td>어두운 기간을 동결</td>
			<td>56.38</td>
			<td>14.10</td>
		</tr>
<tr>
<td>기간 가벼운 동결</td>
			<td>48.46</td>
			<td>4.07</td>
			<td>기간 가벼운 동결</td>
			<td>−</td>
			<td>56.38</td>
		</tr>
<tr>
<td>어두운 1 PMR</td>
			<td>48.46</td>
			<td>4.07</td>
			<td>어두운 1 PMR</td>
			<td>신제품 개발: 0.039</td>
			<td>0.001</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 PMR 빛</td>
			<td>48.46</td>
			<td>4.07</td>
			<td>1 PMR 빛</td>
			<td>−</td>
			<td>56.38</td>
		</tr>
<tr>
<td>다크 2 PMR</td>
			<td>48.46</td>
			<td>4.07</td>
			<td>다크 2 PMR</td>
			<td>−</td>
			<td>56.38</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 PMR 빛</td>
			<td>48.46</td>
			<td>4.07</td>
			<td>2 PMR 빛</td>
			<td>−</td>
			<td>56.38</td>
		</tr>
<tr>
<td>어두운 1 PMR 파열</td>
			<td>−</td>
			<td>193.82</td>
			<td>어두운 1 PMR 파열</td>
			<td>−</td>
			<td>56.38</td>
		</tr>
<tr>
<td>빛 1 파열 PMR</td>
			<td>−</td>
			<td>193.82</td>
			<td>빛 1 파열 PMR</td>
			<td>−</td>
			<td>56.38</td>
		</tr>
<tr>
<td>어두운 2 PMR 파열</td>
			<td>193.82</td>
			<td>48.46</td>
			<td>어두운 2 PMR 파열</td>
			<td>−</td>
			<td>56.38</td>
		</tr>
<tr>
<td>빛 2를 파열 PMR</td>
			<td>−</td>
			<td>193.82</td>
			<td>빛 2를 파열 PMR</td>
			<td>−</td>
			<td>56.38</td>
		</tr>
<tr>
<td>어두운 1 PMR 순항</td>
			<td>48.46</td>
			<td>4.07</td>
			<td>어두운 1 PMR 순항</td>
			<td>−</td>
			<td>56.38</td>
		</tr>
<tr>
<td>크루즈 1 PMR 빛</td>
			<td>48.46</td>
			<td>4.07</td>
			<td>크루즈 1 PMR 빛</td>
			<td>−</td>
			<td>56.38</td>
		</tr>
<tr>
<td>어두운 2 PMR 순항</td>
			<td>48.46</td>
			<td>4.07</td>
			<td>어두운 2 PMR 순항</td>
			<td>−</td>
			<td>56.38</td>
		</tr>
<tr>
<td>순항 빛 2 PMR</td>
			<td>193.82</td>
			<td>48.46</td>
			<td>순항 빛 2 PMR</td>
			<td>56.38</td>
			<td>14.10</td>
		</tr>
<tr>
<td>어 어두운 1 PMR</td>
			<td>48.46</td>
			<td>4.07</td>
			<td>어 어두운 1 PMR</td>
			<td>−</td>
			<td>56.38</td>
		</tr>
<tr>
<td>빛 1 냉동 PMR</td>
			<td>193.82</td>
			<td>48.46</td>
			<td>빛 1 냉동 PMR</td>
			<td>−</td>
			<td>56.38</td>
		</tr>
<tr>
<td>어두운 2 PMR 동결</td>
			<td>48.46</td>
			<td>4.07</td>
			<td>어두운 2 PMR 동결</td>
			<td>−</td>
			<td>56.38</td>
		</tr>
<tr>
<td>빛 2 동결 PMR</td>
			<td>193.82</td>
			<td>48.46</td>
			<td>빛 2 동결 PMR</td>
			<td>−</td>
			<td>56.38</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 제 브라와 fathead 미노 행동 NOECs와 카페인에 대 한 LOECs. 아니 관찰 영향 농도 (NOEC), 빛/어둠의 각각에 대 한 최저 관찰 영향 농도 (LOEC) (mg/L) 값 수영 활동 끝점 및 photomotor 제 브라와 fathead 황 어 카페인에 노출에 대 한 응답. 대시 표시 효과 없이 모든 치료 단계에 걸쳐 특정 끝점에서 관찰 되었다.
그림 2 는 총 운동 활동 zebrafish 및 fathead 미노 96 h 카페인에 노출 다음의 PMRs를 선물 한다. Fathead 미노 애벌레 PMRs zebrafish, 보다 낮은 치료 수준 (0.038 mg/L)에서 카페인 photomotor 끝점의 현저 하 게 많은 수에 의해 변경 된 zebrafish에 영향을 받았다. 카페인 (193.82 mg/L)의 높은 치료 수준이이 반응을 정확 하 게 반대 했다 zebrafish에 PMR 변경 컨트롤에서. 그러나이 높은 치료 수준,, PMRs 어둠 속에서 감소 하 고 조명 조건에서 증가.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57938/57938fig2.jpg"> 그림 2: 수영 활동과 제 브라 (A 및 B) 및 96 h 카페인에 노출 후 fathead 미노 (C , D)의 photomotor 응답. 제 브라 (A)에 대 한 평균 (± SEM) 거리 수영 및 fathead 미노 (C) 활동의 각 대표 1 분 간격으로 점 들에 의해 주어진 다. 제 브라 (B)와 (D) fathead 미노의 Photomotor 응답 평균 (± SE) 총 거리는 초기 photoperiod의 last minutes와 다음 기간의 첫 번째 분 사이 여행에 변화로 측정 됩니다. 두 어둡고 두 빛 기간 photomotor 응답 측정 되었다. 24의 총 (4 각의 복제 6 애벌레) zebrafish, 12 (3 각의 복제 4 애벌레) fathead 황 어 행동 관찰을 위해 사용 되었다. p < 0.10; p < 0.05; p < 0.01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57938/57938fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
애벌레 PMRs를 측정 하는 것 외에도 빛과 어둠 운동 활동 3 이동 거리에 대 한 속도 임계값, 움직임의 수 및 움직임의 기간에 걸쳐 분석 했다. 이 데이터는 행동 응답 카페인 ( Supplemental 그림 1,그림 3)에 대 한 프로 파일을 개발 하는 데 사용 됩니다. 카페인 저해 활동에는 물고기 모델에, 운동 끝점을 크게 영향을 받습니다. 비록 크게 하지 두 생선, 카페인에 노출 다음 붕괴 속도 임계값에 시연된 활동 증가 모델. PMR 관측의 결과 마찬가지로 카페인 영향 zebrafish 운동 끝점의 더 많은 수 있습니다. 사실, 카페인은 크게는 THV 환경 현실적인 수준에서 어두운 조건 하에서 여러 가지 운동 응답을 변경. 그러나, fathead 미노 운동 활동은 크게 영향을 받지 어떤 치료 수준으로 조명 조건 하에서.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57938/57938fig3.jpg"> 그림 3: 96 h 카페인에 노출 후 애벌레 zebrafish 및 fathead 황 어의 응답 프로필. Zebrafish 어두운 (A) 빛 (B) 수영 96 h 카페인에 노출 된 후 어두운 fathead 미노 (C)와 빛 (D) 활동을 의미 하는 비교 하는 활동을 의미 합니다. 2 10 분 어두운 photoperiods와 각 물고기 모델에 대 한 2 개의 10 분 빛 photoperiods 데이터 나타내는 활동을 꾸몄다. 각 그림에서 0 축에 표시 되는 제어 데이터 정규화 됩니다. 행동 매개 변수 포함 거리, 움직임 (개수)의 수 및 각 이동의 기간에 붕괴 3 속도 레벨에 걸쳐 헤 엄 (> 20 m m/s), 순항 (5-20 m m/s), 냉동 고 (< 5 mm/s). 각 속도 임계값의 운동 패턴, 뿐만 아니라 총 거리 수영 하 고 움직임의 총 수 표시 됩니다. ↑ 제어에 비해 활동에 상당한 증가 나타내고 ↓ 제어에 비해 활동에 상당한 감소를 나타냅니다. 24의 총 (4 각의 복제 6 애벌레) zebrafish, 12 (3 각의 복제 4 애벌레) fathead 미노 행동 관측에 사용 하는 각 그룹에 대 한. p < 0.10; p < 0.05; p < 0.01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57938/57938fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 그림 1: 제 브라 (A 및 B) 및 3 속도 임계값에 걸쳐 fathead 미노 (C , D)의 Photomotor 응답 합니다. 제 브라 (A, B 및 C) 및 fathead 미노 애벌레 (D, E 및 F) photomotor 응답 3 속도 임계값에 걸쳐 (동결: 20 mm/s) 카페인에 96 시간 노출 후. 제 브라와 fathead 미노의 Photomotor 응답 초기 photoperiod의 last minutes와 다음 기간의 첫 번째 분 사이 여행을 하는 의미 (±SE) 총 거리 변경으로 측정 됩니다. 두 어둡고 두 빛 기간 photomotor 응답 측정 되었다. 24의 총 (4 각의 복제 6 애벌레) zebrafish, 12 (4 애벌레의 3 복제) fathead 황 어 행동 관찰을 위해 사용 되었다. * p < 0.01 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57938/Steele_et_al_JoVE_Supplemental_Figure_1_01302018.pptx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine at JoVE.com

Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine

애벌레에서 행동 응답 프로필을 조사 하기 위한 실험 프로토콜: 신경 흥분 제 카페인에 응용

여기, 선물이 애벌레 zebrafish fathead 미노 운동 활동 및 photomotor 응답 (PMR) 자동된 추적 소프트웨어를 사용 하 여 검사 하는 프로토콜. 공통 통합 독성 생물 검정, 이러한 행동의 분석 화학 bioactivity를 검사 하는 진단 도구를 제공 합니다. 이 프로토콜은 카페인, 모델 neurostimulant를 사용 하 여 설명 합니다.

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and ...

experimental-protocol-for-examining-behavioral-response-profiles

Research

JoVE Journal

Environment

11.1K 조회수.  Baylor University. 여기, 선물이 애벌레 zebrafish fathead 미노 운동 활동 및 photomotor 응답 (PMR) 자동된 추적 소프트웨어를 사용 하 여 검사 하는 프로토콜. 공통 통합 독성 생물 검정, 이러한 행동의 분석 화학 bioactivity를 검사 하는 진단 도구를 제공 합니다. 이 프로토콜은 카페인, 모델 neurostimulant를 사용 하 여 설명 합니다.

비디오: Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

라이트 농도의 변화에​​ Zebrafish의 응답을 측정하기 위하여 행동 어세이

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

연구

생물학

Studying Neurobehavioral Effects of Environmental Pollutants on Zebrafish Larvae

Recent years more and more environmental pollutants have been proved neurotoxic, especially at the early development stages of organisms. Zebrafish larvae are a preeminent model for the neurobehavioral study of environmental pollutants. Here, a detailed experimental protocol is provided for the evaluation of the neurotoxicity of environmental pollutants using zebrafish larvae, including the collection of the embryos, the exposure process, neurobehavioral indicators, the test process, and data analysis. Also, the culture environment, exposure process, and experimental conditions are discussed to ensure the success of the assay. The protocol has been used in the development of psychopathic drugs, research on environmental neurotoxic pollutants, and can be optimized to make corresponding studies or be helpful for mechanistic studies. The protocol demonstrates a clear operation process for studying neurobehavioral effects on zebrafish larvae and can reveal the effects of various neurotoxic substances or pollutants.

A detailed experimental protocol is presented in this paper for the evaluation of neurobehavioral toxicity of environmental pollutants using a zebrafish larvae model, including the exposure process and tests for neurobehavioral indicators.

제브라피시 유충에 대한 환경 오염물질의 신경행동 효과 연구

Recent years more and more environmental pollutants have been proved neurotoxic, especially at the early development stages of organisms. Zebrafish larvae ...

환경과학

Behavioral Approaches to Studying Innate Stress in Zebrafish

Responding appropriately to stressful stimuli is essential for survival of an organism. Extensive research has been done on a wide spectrum of stress-related diseases and psychiatric disorders, yet further studies into the genetic and neuronal regulation of stress are still required to develop better therapeutics. The zebrafish provides a powerful genetic model to investigate the neural underpinnings of stress, as there exists a large collection of mutant and transgenic lines. Moreover, pharmacology can easily be applied to zebrafish, as most drugs can be added directly to water. We describe here the use of the 'novel tank test' as a method to study innate stress responses in zebrafish, and demonstrate how potential anxiolytic drugs can be validated using the assay. The method can easily be coupled with zebrafish lines harboring genetic mutations, or those in which transgenic approaches for manipulating precise neural circuits are used. The assay can also be used in other fish models. Together, the described protocol should facilitate the adoption of this simple assay to other laboratories.

This manuscript describes a simple method to measure stress behaviorally in adult zebrafish. The approach takes advantage of the innate tendency that zebrafish prefer the bottom half of a tank when in a stressful state. We also describe methods for coupling the assay with pharmacology.

제 브라 피시에서 선천적인 스트레스를 연구 하는 행동 접근법

Responding appropriately to stressful stimuli is essential for survival of an organism. Extensive research has been done on a wide spectrum of ...

행동분석학

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system measures spontaneous behaviors and the response to an aversive stimulus, which is shown to the larvae via a PowerPoint presentation. The recorded images are analyzed with an ImageJ macro, which automatically splits the color channels, subtracts the background, and applies a threshold to identify individual larvae placement in the lanes. We can then import the coordinates into an Excel sheet to quantify swim speed, preference for edge or side of the lane, resting behavior, thigmotaxis, distance between larvae, and avoidance behavior. Subtle changes in behavior are easily detected using our system, making it useful for behavioral analyses after exposure to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Our laboratory developed a novel high-throughput automated imaging system that is useful for the detection of several different behaviors in 7-day-old zebrafish larvae. The system can be used for detecting subtle changes in behavior after the larvae have been exposed to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Zebrafish의 유충에 자동으로 높은 처리량 행동 분석

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

신경과학

Boldness, Aggression, and Shoaling Assays for Zebrafish Behavioral Syndromes

A behavioral syndrome exists when specific behaviors interact under different contexts. Zebrafish have been test subjects in recent studies and it is important to standardize protocols to ensure proper analyses and interpretations. In our previous studies, we have measured boldness by monitoring a series of behaviors (time near surface, latency in transitions, number of transitions, and darts) in a 1.5 L trapezoidal tank. Likewise, we quantified aggression by observing bites, lateral displays, darts, and time near an inclined mirror in a rectangular 19 L tank. By dividing a 76 L tank into thirds, we also examined shoaling preferences. The shoaling assay is a highly customizable assay and can be tailored for specific hypotheses. However, protocols for this assay also must be standardized, yet flexible enough for customization. In previous studies, end chambers were either empty, contained 5 or 10 zebrafish, or 5 pearl danios (D. albolineatus). In the following manuscript, we present a detailed protocol and representative data that accompany successful applications of the protocol, which will allow for replication of behavioral syndrome experiments.

This manuscript describes the setup, implementation, and analysis of boldness, aggression, and shoaling in zebrafish and testing for the presence of a behavioral syndrome. A standardized approach for behavioral quantification will allow for easier comparison across studies. Modifications to this protocol are possible as each assay can be run individually.

Zebrafish의 행동 증후군에 대한 대담, 침략, 그리고이 얕아 분석

A behavioral syndrome exists when specific behaviors interact under different contexts. Zebrafish have been test subjects in recent studies and it is ...

의학

Pharmacological Validation of the Prepulse Inhibition of Startle Response in Larval Zebrafish using a Commercial Automated System and Software

While there is an abundance of commercial and standardized automated systems and software for performing the prepulse inhibition (PPI) assay in rodents, to the best of our knowledge, all PPI assays performed in the zebrafish have, until now, been done using custom made systems which were only available to individual groups. This has thereby presented challenges, particularly with regard to issues of data reproducibility and standardization. In the present work, we generated a protocol that utilizes commercially available automated systems to pharmacologically validate the PPI&#160;assay in larval zebrafish. Consistent with published findings, we were able to replicate the results of apomorphine, haloperidol and ketamine on the PPI response of 6 days post-fertilization zebrafish larvae.

Here we describe a protocol that utilizes commercially available automated systems to pharmacologically validate the prepulse inhibition (PPI) assay in larval zebrafish.

While there is an abundance of commercial and standardized automated systems and software for performing the prepulse inhibition (PPI) assay in rodents, ...

성인 제브라피쉬의 신경 독성 효과를 평가하기 위한 행동 테스트 배터리

Neurotoxicity Assessment in Adult Danio rerio using a Battery of Behavioral Tests in a Single Tank

The presence of neuropathological effects proved to be, for many years, the main endpoint for assessing the neurotoxicity of a chemical substance. However, in the last 50 years, the effects of chemicals on the behavior of model species have been actively investigated. Progressively, behavioral endpoints were incorporated into neurotoxicological screening protocols, and these functional outcomes are now routinely used to identify and determine the potential neurotoxicity of chemicals. Behavioral assays in adult zebrafish provide a standardized and reliable means to study a wide range of behaviors, including anxiety, social interaction, learning, memory, and addiction. Behavioral assays in adult zebrafish typically involve placing the fish in an experimental arena and recording and analyzing their behavior using video tracking software. Fish can be exposed to various stimuli, and their behavior can be quantified using a variety of metrics. The novel tank test is one of the most accepted and widely used tests to study anxiety-like behavior in fish. The shoaling and social preference tests are useful in studying the social behavior of zebrafish. This assay is particularly interesting since the behavior of the entire shoal is studied. These assays have proven to be highly reproducible and sensitive to pharmacological and genetic manipulations, making them valuable tools for studying the neural circuits and molecular mechanisms underlying behavior. Additionally, these assays can be used in drug screening to identify compounds that may be potential modulators of behavior.
We will show in this work how to apply behavioral tools in fish neurotoxicology, analyzing the effect of methamphetamine, a recreational drug, and glyphosate, an environmental pollutant. The results demonstrate the significant contribution of behavioral assays in adult zebrafish to the understanding of the neurotoxicological effects of environmental pollutants and drugs, in addition to providing insights into the molecular mechanisms that may alter neuronal function.

저자 스포트라이트: 성체 제브라피시의 환경 및 약물 유발 행동 변화 평가 

Here, we present a comprehensive behavioral test battery, including the novel tank, Shoaling, and social preference tests, to effectively determine the potential neurotoxic effects of chemicals (e.g., methamphetamine and glyphosate) on adult zebrafish using a single tank. This method is relevant to neurotoxicity and environmental research.

단일 탱크에서 행동 테스트 배터리를 사용한 성인 Danio rerio 의 신경 독성 평가

The presence of neuropathological effects proved to be, for many years, the main endpoint for assessing the neurotoxicity of a chemical substance. ...

Photomotor Response Assay: A Method to Measure the Behavioral Response of Larval Zebrafish to a Sudden Change in Lighting Condition

Source: Steele, W. B., et al. <a href="https://www.jove.com/v/57938/" target="_blank">Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine</a>.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2018).
This video describes the photomotor response assay of zebrafish and fathead minnow larvae using an automated tracking software. The protocol measures the behavioral response of the larval fish following a sudden change in lighting condition.

애벌레에서 행동 응답 프로필을 조사 하기 위한 실험 프로토콜: 신경 흥분 제 카페인에 응용

요약

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제브라피시 유충에 대한 환경 오염물질의 신경행동 효과 연구

제 브라 피시에서 선천적인 스트레스를 연구 하는 행동 접근법

Zebrafish의 유충에 자동으로 높은 처리량 행동 분석

Zebrafish의 행동 증후군에 대한 대담, 침략, 그리고이 얕아 분석

Pharmacological Validation of the Prepulse Inhibition of Startle Response in Larval Zebrafish using a Commercial Automated System and Software

단일 탱크에서 행동 테스트 배터리를 사용한 성인 Danio rerio 의 신경 독성 평가

단일 탱크에서 행동 테스트 배터리를 사용한 성인 Danio rerio 의 신경 독성 평가

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Photomotor Response Assay: 조명 조건의 급격한 변화에 대한 애벌레 제브라피시의 행동 반응을 측정하는 방법

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