우리가 기꺼이 인정 마이클 Jahn Yuting Guo 절차 및 순수 문화 및 활성된 슬러지 커뮤니티의 데이터 집합을 각각 제공 합니다. 우리는 추가 biogas 커뮤니티 샘플을 분석 하기 위한 카트린 Mörters 감사 합니다. 이 작품 음식과 농업 (BMEL), 중소기업 (ZIM)를 위한 연방 내각의 중심 혁신 프로그램에 대 한 독일 연방 내각 대신 대 (FNR, 프로젝트 바이오 가스-지문 Nr. 22008313) Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e.에 의해 투자 되었다 경제와 에너지 (BMWi) (INAR-ABO, 16KN043222), 독일 Bundesstiftung Umwelt (DBU, 프로젝트 온 디맨드 프로덕션 폰 Phosphatdünger aus Reststoffen 폰 Brauerei und Kläranlage 33960/01-32), 교육에 대 한 독일 연방 내각 및 연구 (BMBF) (FZK 03XP0041G), 및 헬름홀츠 협회의 자금 프로그램 지향 (POF III R31 주제 3 Bioenergy).

<ol><li>Xu, X., Hui, D., King, A. W., Song, X., Thornton, P. E., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+microbial+assimilations+of+soil+carbon%2C+nitrogen%2C+phosphorus%2C+and+sulfur+in+terrestrial+ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Convergence of microbial assimilations of soil carbon, nitrogen, phosphorus, and sulfur in terrestrial ecosystems.</a> Scientific Reports. 5 (1), 17445(2015).</li>
<li>Fathepure, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+studies+in+microbial+degradation+of+petroleum+hydrocarbons+in+hypersaline+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Recent studies in microbial degradation of petroleum hydrocarbons in hypersaline environments.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 173(2014).</li>
<li>Alshehrei, F. <a target="_blank" href="http://pubs.sciepub.com/jaem/5/1/2/">Biodegradation of Synthetic and Natural Plastic by Microorganisms.</a> Journal of Applied & Environmental Microbiology. 5 (1), 8-19 (2017).</li>
<li>Sarria, S., Kruyer, N. S., Peralta-Yahya, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+Synthesis+of+medium-chain+chemicals+from+renewables%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microbial Synthesis of medium-chain chemicals from renewables.</a> Nature Biotechnology. 35 (12), 1158-1166 (2017).</li>
<li>Günther, S., Faust, K., Schumann, J., Harms, H., Raes, J., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-sorting+and+mass-transfer+paradigms+control+managed+natural+metacommunities%3A+Species-sorting+and+mass-transfer+paradigms+in+metacommunities%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Species-sorting and mass-transfer paradigms control managed natural metacommunities: Species-sorting and mass-transfer paradigms in metacommunities.</a> Environmental Microbiology. 18 (12), 4862-4877 (2016).</li>
<li>Lambrecht, J., Cichocki, N., Hübschmann, T., Koch, C., Harms, H., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+quantification%2C+sorting+and+sequencing+of+methanogenic+archaea+based+on+F420+autofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric quantification, sorting and sequencing of methanogenic archaea based on F420 autofluorescence.</a> Microbial Cell Factories. 16 (1), 180(2017).</li>
<li>Huttenhower, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function+and+diversity+of+the+healthy+human+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure, function and diversity of the healthy human microbiome.</a> Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).</li>
<li>Lloyd-Price, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strains%2C+functions+and+dynamics+in+the+expanded+Human+Microbiome+Project%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Strains, functions and dynamics in the expanded Human Microbiome Project.</a> Nature. 550, 61-66 (2017).</li>
<li>Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coming+of+age%3A+ten+years+of+next-generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecological+Stability+Properties+of+Microbial+Communities+Assessed+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Ecological Stability Properties of Microbial Communities Assessed by Flow Cytometry.</a> mSphere. 3 (1), e00564-e00517 (2018).</li>
<li>Koch, C., Günther, S., Desta, A. F., Hübschmann, T., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometric+fingerprinting+for+analyzing+microbial+intracommunity+structure+variation+and+identifying+subcommunity+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cytometric fingerprinting for analyzing microbial intracommunity structure variation and identifying subcommunity function.</a> Nature Protocols. 8 (1), 190-202 (2013).</li>
<li>Koch, C., Fetzer, I., Schmidt, T., Harms, H., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+Functions+in+Managed+Microbial+Systems+by+Cytometric+Bar+Coding%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Monitoring Functions in Managed Microbial Systems by Cytometric Bar Coding.</a> Environmental Science & Technology. 47 (3), 1753-1760 (2013).</li>
<li>Lefort, T., Gasol, J. M. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/plankt/article/36/1/243/1519288">Short-time scale coupling of picoplankton community structure and single-cell heterotrophic activity in winter in coastal NW Mediterranean Sea waters.</a> Journal of Plankton Research. 36 (1), 243-258 (2014).</li>
<li>Besmer, M. D., Epting, J., Page, R. M., Sigrist, J. A., Huggenberger, P., Hammes, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Online+flow+cytometry+reveals+microbial+dynamics+influenced+by+concurrent+natural+and+operational+events+in+groundwater+used+for+drinking+water+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Online flow cytometry reveals microbial dynamics influenced by concurrent natural and operational events in groundwater used for drinking water treatment.</a> Scientific Reports. 6, 38462(2016).</li>
<li>van Gelder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytometric+approach+to+follow+variation+and+dynamics+of+the+salivary+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A cytometric approach to follow variation and dynamics of the salivary microbiota.</a> Methods. 134, 67-79 (2018).</li>
<li>Jehmlich, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+tool+for+characterization+of+microbial+cultures+by+combining+cytomics+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advanced tool for characterization of microbial cultures by combining cytomics and proteomics.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 88 (2), 575-584 (2010).</li>
<li>Jahn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+Determination+of+Plasmid+Copy+Number+of+Flow-Sorted+Cells+using+Droplet+Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Accurate Determination of Plasmid Copy Number of Flow-Sorted Cells using Droplet Digital PCR.</a> Analytical Chemistry. 86 (12), 5969-5976 (2014).</li>
<li>Koch, C., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+microbiome+dynamics+-+Cytometric+fingerprints+for+routine+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Personalized microbiome dynamics - Cytometric fingerprints for routine diagnostics.</a> Molecular Aspects of Medicine. 59, 123-134 (2018).</li>
<li>Jahn, M., Vorpahl, C., Hübschmann, T., Harms, H., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copy+number+variability+of+expression+plasmids+determined+by+cell+sorting+and+Droplet+Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Copy number variability of expression plasmids determined by cell sorting and Droplet Digital PCR.</a> Microbial Cell Factories. 15 (1), 211(2016).</li>
<li>Koch, C., Fetzer, I., Harms, H., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHIC-an+automated+approach+for+the+detection+of+dynamic+variations+in+complex+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">CHIC-an automated approach for the detection of dynamic variations in complex microbial communities.</a> Cytometry Part A. 83 (6), 561-567 (2013).</li>
<li>Günther, S., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitated+gate+setting+by+sequential+dot+plot+scanning%3A+Facilitated+Gate+Setting+by+Sequential+Dot+Plot+Scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Facilitated gate setting by sequential dot plot scanning: Facilitated Gate Setting by Sequential Dot Plot Scanning.</a> Cytometry Part A. 87 (7), 661-664 (2015).</li>
<li>Guo, Y., Baumgart, S., Stärk, H. -J., Harms, H., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Cytometry+for+Detection+of+Silver+at+the+Bacterial+Single+Cell+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mass Cytometry for Detection of Silver at the Bacterial Single Cell Level.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1326(2017).</li>
<li>Gasol, J. M., Del Giorgio, P. A. <a target="_blank" href="http://digital.csic.es/bitstream/10261/5293/1/planktonic.pdf">Using flow cytometry for counting natural planktonic bacteria and understanding the structure of planktonic bacterial communities.</a> Scientia Marina. 64 (2), 197-224 (2000).</li>
<li>Gasol, J. M., Morán, X. A. G. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/10.1007/8623_2015_139">Flow Cytometric Determination of Microbial Abundances and Its Use to Obtain Indices of Community Structure and Relative Activity.</a> Hydrocarbon and Lipid Microbiology Protocols. , 159-187 (2016).</li>
<li>Props, R., Monsieurs, P., Mysara, M., Clement, L., Boon, N. <a target="_blank" href="https://besjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/2041-210X.12607">Measuring the biodiversity of microbial communities by flow cytometry.</a> Methods in Ecology and Evolution. 7 (11), 1376-1385 (2016).</li>
<li>Kinet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+community+fingerprinting+and+amplicon+sequencing+for+the+assessment+of+landfill+leachate+cellulolytic+bioaugmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry community fingerprinting and amplicon sequencing for the assessment of landfill leachate cellulolytic bioaugmentation.</a> Bioresource Technology. 214, 450-459 (2016).</li>
<li>De Roy, K., Clement, L., Thas, O., Wang, Y., Boon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+for+fast+microbial+community+fingerprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry for fast microbial community fingerprinting.</a> Water Research. 46 (3), 907-919 (2012).</li>
<li>Koch, C., Harnisch, F., Schröder, U., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometric+fingerprints%3A+evaluation+of+new+tools+for+analyzing+microbial+community+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cytometric fingerprints: evaluation of new tools for analyzing microbial community dynamics.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 273(2014).</li>
<li>Amalfitano, S., Fazi, S., Ejarque, E., Freixa, A., Romaní, A. M., Butturini, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29265528">Deconvolution model to resolve cytometric microbial community patterns in flowing waters: Deconvolving Cytometric Microbial Subgroups.</a> Cytometry Part A. 93 (2), 194-200 (2017).</li>
<li>Buysschaert, B., Kerckhof, F. -M., Vandamme, P., De Baets, B., Boon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+fingerprinting+for+microbial+strain+discrimination+and+physiological+characterization%3A+Flow+Cytometric+Fingerprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric fingerprinting for microbial strain discrimination and physiological characterization: Flow Cytometric Fingerprinting.</a> Cytometry Part A. 93 (2), 201-212 (2017).</li>
<li>Besmer, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory-Scale+Simulation+and+Real-Time+Tracking+of+a+Microbial+Contamination+Event+and+Subsequent+Shock-Chlorination+in+Drinking+Water%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Laboratory-Scale Simulation and Real-Time Tracking of a Microbial Contamination Event and Subsequent Shock-Chlorination in Drinking Water.</a> Frontiers in Microbiology. 8 (1900), (2017).</li>
<li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26909672">High-resolution microbiota flow cytometry reveals dynamic colitis-associated changes in fecal bacterial composition: Technical comment.</a> European Journal of Immunology. 46 (5), 1300-1303 (2016).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

미생물 인구 및 지역 사회에 대 한 성공적인 분석 잘 조정 된 cytometers, 세포 매개 변수의 적절 한 선택 및 샘플링, 측정 및 데이터 평가 쪽으로 고정에서 신뢰할 수 있는 워크플로 필요합니다. 선택한 셀 매개 변수는 사용할 수 있는 여기 파장 consort 해야 합니다. 우리가 사용 하 고 매우 낮은 농도;에서 민감한 DAPI 추천 하지만 일반적으로 하지 표준 cytometer 설정에 구성 된 UV 레이저에 의해 흥분 할 필요가 있다. SYBR 같은 다른 염료 나, 또한 얼룩 전체 인구 또는 지역 사회 녹색 하지만 일반적으로 열 등 한 해상도 제공 합니다. 우리는 미생물 지역 사회에서 물고기 절차 또는 생존 테스트를 사용 하 여 권장 하지 않습니다. 이러한 접근 방법은 계량, 확인 하 고 지역 사회에서 개별 종에 그들의 효과 불확실 때문에 제어할 수 없습니다. 그들은 수 없습니다 안정적으로 테스트, 일반적인 지역 사회의 상당한 비율은 여전히 순수한 문화로 사용할 수 없습니다.
프로토콜에 중요 한 단계는 샘플링 및 고정 절차로 셀 정렬 포함 됩니다. 샘플링 특정 순수한 문화와 flocs를 집계 하거나 샘플 매트릭스의 입자에 고착 미생물 커뮤니티의 추세에 의해 복잡 하 게 될 수 있습니다. 이러한 집계를 낭비 하 고 신뢰할 수 있는 결과 보장 하기 위해 흐름 cytometric 분석에 그들을 소개 하기 전에 샘플에서 세포를 분리 하는 필수적 이다. 발표 준비 프로토콜 단일 세포 분석 수 있도록 최적화 했다. 마지막 50 µ m 여과 어떤 잔여 집계를 제거 하 고 셀 정렬의 70 µ m 노즐 및 분석기의 흐름 베트 막힘 방지를 측정 하기 전에 수행 됩니다. 폐수 처리 공장에서 셀 flocs 특히 풍부 하 고, 강력 하 고 시스템의 기능에 중요 한 있습니다. 우리는 planktonic 조사 및 슬러지 기반 설립된 프로토콜을 테스트 하는 본격적인 폐수 처리 식물의 다른 탱크에 미생물 지역 사회. 집계 했다 명확 하 게 방출 하는 세포를 형성 하는 슬러지와 지역 사회 구성 안정 유지. 또한, planktonic 및 슬러지 기반 커뮤니티 그들 모든 3 개의 샘플된 탱크 (그림 8, 보조 파일 1-S10) 사이의 놀라운 유사성을 전시. 이러한 결과 포 름 알 데히드와 에탄올 집착의 신선한, 포름알데히드 처리-비교 16S rDNA amplicon 시퀀싱에 의해 확인 했다-, 그리고 정렬된 샘플10. 그럼에도 불구 하 고, 매우 강한 biofilms 또는 밀접 하 게 연결 된 체인에서 성장 하는 박테리아와 같은 환경 샘플을 도전 수 있습니다 수 없습니다 없앨 수 있습니다. 유비 쿼터 스 입자 히스토그램에 표시 되 고 투명 한 풍부에 의해 셀 리 수로 토양 샘플 특히 문제가 될 수 있습니다. 이러한 경우에 기존의 시퀀싱 방법 적용 될 필요가 있다.
모든 새로운 샘플 세트의 고정 안정성 결과 유효성을 보장 하기 위해 실험을 설계 하기 전에 테스트 되어야 합니다. 좋은 고정 안정성 풀링된 얼룩이 지 고 하루에 여러 샘플 시간 점의 측정 해줍니다. 또한 복제 측정 및 결론 및 실험의 최종 평가 후 결정적인 시간 포인트의 회고전 셀 정렬 수 있습니다. 순수한 문화 정착 안정성 28 일 동안 (그림 9) 확인 했습니다. 현장 실험 샘플 수송을 포함 하 여, (이 경우에는 활성된 슬러지 커뮤니티에 대 한 바이오 가스 커뮤니티, 보충 파일 1-S9 195 한 일)에 더 긴 기간 동안 고정 안정성을 테스트 해야 합니다.
얼룩 보통 문제가 아니다 그러나 bioinformatic 평가 도구 응용 프로그램을 허용 하는 생물학 표준으로 제어할 필요가 있다. 우리가 사용 하는 모의 변형 대장균 BL21 (DE3)는 ASC 프로토콜에 따라 집착 되었고 모든 얼룩 일괄 처리에 사용 하기 위해 비축.
DAPI, SYBR 녹색에서에서 떨어져 내가 성공적으로 적용 되었습니다 몇 년14,23,,2425,26미생물 커뮤니티를 해결 하기 위해. 높은-낮은 및 핵 산 하위 집합 (HNA 및 LNA)으로 지역 사회를 해결할 수 있습니다 SYBR 녹색 온라인 방법에서 라이브 셀을 사용 하 여. DAPI, dna 바인딩에 더 구체적인 고 한 샘플 세트에 50 개 이상의 subcommunities의 구별을 가능 하 게 그러나, 얼룩이 지기 전에 정착 단계를 요구 한다.
셀 정렬은이 접근의 뛰어난 기능 그리고 특정 subcommunities 더 관심의 경우에 적용 될 수 있다. 그것은 둘 다 PFA-(30 분만에 대 한 수행)도 에탄올 치료 또는 DAPI10 얼룩 했다 후속 16S amplicon 시퀀싱에 부정적인 영향을 강조 해야 합니다. 잠재력 정착의 영향과 subcommunity metagenome에 얼룩 분석 여전히 테스트 해야.
커뮤니티 기능 및 추세 역학에 대 한 정보를 많이 얻을 수 있습니다 정렬 방식에서 독립적인 생물 정보학 도구를 가상으로 셀 수준에서 커뮤니티 기능을 해결 하 고 abiotic 이러한 기능 연결을 포함 하는 경우 매개 변수입니다.
최근, 여러 가지 새로운 생물 정보학 평가 도구, 모든 유용 두 SYBR 녹색 나와 DAPI 접근, cytometric 커뮤니티 패턴을 해결 하기 위해 개발 되었습니다. 이들은 FlowFP27, 민물 지역 사회29 설립 deconvolution 모델 및 그들의 생리에 따라 긴장을 차별 하는 데 사용 하는 도구는 패키지 (flowCHIC20, flowCyBar28),이 연구에 사용 된 특성30. 또한, cytometric 다양성 결정된25 수 있으며 심지어 안정성 속성 미생물 커뮤니티의 온라인 도구10이제 지켜질 수 있다.
따라서, 흐름 cytometric 분석 미생물 지역 사회와 가능한 abiotic 매개 변수 상관 관계의 급속 한 평가 관해서 큰 장점이 있다. 그러나, 여전히 방법에 제한이 있습니다. 그것은 진정한 온라인 경험된 기반된 게이트 설정 절차로 인해 flowCyBar 도구를 적용할 수 없습니다. 또한, 주문 품, 사용 하기 쉬운 교류 cytometers의 개발 흐름 cytometric 미생물 분석 접근의 확산을 사전 크게 것 이다. 이 방향으로 첫 번째 단계는 착수28.
그것은 높은 주파수 세균 생성 시간 범위 내에서 모니터링 있으며 생태 패러다임 cytometric 데이터5에 적용 되는 표시 된 미생물 생태학, 미생물 cytometry의 미래 응용 프로그램을 구상 수 있습니다. ,10. 스위스31필수 식 수 컨트롤 같은 자연 환경의 일상적인 검 진 방법은 매우 유용합니다. 그것은 또한 인간의15 또는 동물32 미생물 검사 같은 의료 응용 프로그램에 대 한 유용한 도구가 될 수 있습니다. 또한, 생물 정보학의 최신 개발 될 관리 되는 미생물 시스템의 공정 제어에 필수적인 센서 미생물 cytometry를 사용 수 있습니다. 미생물 커뮤니티 cytometry는 또한 특정 커뮤니티 하위 집합의 게놈 조사 높은 해상도 수 있는 셀 정렬, 검사 도구를 제공 합니다.

미생물 라이브 인간의 여러 측면에서 중요 한 역할을 담당할. 그들은 행성 탄소, 질소, 인 및 유황 사이클1및2,3 저하 뿐만 아니라 폐수 처리 등 다양 한 산업에서4 biocatalysts 합성 법의 주요 생물 드라이버 5 또는 생명 공학6. 그들은 심지어는 직접에 영향을 미치는 인간의 건강과 신진 대사7,8인간 microbiome 구성. 따라서, 구조, 기능 및 미생물, 그들의 즉시 환경에 대 한 응답에서의 동적 행동에 정보는 우리가 완전히 이해 하 고 이러한 시스템을 조작 하고자 하는 경우에, 필요 합니다. 차세대 시퀀싱 (NGS)는 미생물의 구조와 기능9를 해결 하기 위한 설립된 기술. 그러나, 분석과 NGS 데이터의 평가 양적 정보를 얻을 수 없습니다 이며 여전히 비싼, 시간이 걸리는 절대로 성능 복도 내에서 현장 결과 제공 하기 위해 준비. 일부 박테리아 생성 시간 1 시간 그리고 끊임없이 변화 하는 사회 구조에서 특정 환경10원인 아래 표시 됩니다. 이러한 역학에 따라 시퀀싱 방법을 사용 하 여 가장 과학적인 실험실의 재정 및 인력 용량을 초과 것입니다.
대조적으로, cytometry 높은 시간, 노동 및 비용 효율성을 유지 하면서 커뮤니티 지문 비슷한 NGS 데이터를 제공할 수 있습니다. 여기, 우리가 현재 흐름 cytometric 기술을 단일 셀 수준에 미생물 지역 사회 역학에서 라인을 따라 할 수 있습니다. NGS, 달리 cytometry 기능 유전자 계통 발생 제휴 또는 정보를 제공 하지 않습니다 하지만 양적 세포 수를 제공 합니다. Cytometry 사용 하 여, 미생물 커뮤니티 subcommunities 별개 가벼운 살포와 형광 속성 (앞으로 산포 (FSC) 및 측면 살포 (SSC) 셀 크기와 단위의 각각 제공)으로 해결할 수 있습니다. 제시 방식을 주로 활용 셀 크기-그리고 DNA 금액 특정 세포 유형 및 생리 (성장) 상태에 관련 된 관련된 정보. DNA 콘텐츠 UV-고르기 4', DNA의 A T 풍부한 지역에 바인딩하고 다른 염색체 수준 해결도 수는 6-diamidino-2'-phenylindole (DAPI) 염료를 사용 하 여 정량 이다. DAPI 형광 및 FSC 결합 하 여 50 이상 subcommunities 구별 고 시간11에 나타났는데 변경 모니터링 될 수 있습니다. Subcommunity 풍부 유사 변화 pH 및 제품 titers12, 글로벌 매개 변수, 날씨13,14또는 창 자 또는 타 액과 같은 마이크로 환경 주변에 상관 될 수 있습니다. 특정 치료15microbiomes입니다. 이러한 상관 관계 공개 키 subcommunities 전체 공동체의 대사 네트워크의 특정 기능에 대 한 책임. 키 subcommunities 수 다음 수 특히 승진 주변 마이크로-환경, 변경 하 여 억제 또는 후속 시퀀싱15 또는 proteomic 조사16정렬.
그러나, 미생물 커뮤니티 cytometry 하지 아직 널리 설립 흐름 cytometric 장치 미생물 인구 또는 지역 사회를 제대로 해결 능력의 다소 낮은 수 또한, 경험, 커뮤니티 분석 파이프라인 및 효과적인 데이터 평가의 부족 연구원 미생물 분석도 전에 직면에 대 한 진입 장벽을 포즈 수 있습니다. 우리는 이러한 문제를 해결 하기 위해 포괄적인 워크플로 설립 했다. 그들의 일반적인 적용을 설명 하기 위해 우리 3 모범 샘플 세트 (보조 파일 1-S1), 즉 나에 그들을 발표할 예정 이다) 정의 된 명확한 매체 (슈 도모 나 스 putida KT 2440에에서 성장 하는 바이오 응용 프로그램에 대 한 순수한 문화 (PC) 포도 당), ii) 복잡 한 실험실 커뮤니티 명확한 매체 (활성된 슬러지 커뮤니티 (ASC) 합성 폐수) 및 iii에) 고밀도 매트릭스 (biogas 커뮤니티 (BC) 옥수수 목초)에서 자연적인 환경에서 복잡 한 사회.
여러 가지 요인이 이러한 샘플 세트의 각각에 대 한 프로토콜 선택 영향. 깊은 동결 싶고 독성 화학 물질의 사용 하지만 주로 충격 설탕 프로 스 팅에 대 한 액체 질소의 사용으로 인해 실험실 환경에 제한 됩니다. 포 름 알 데히드 안정화 및 후속 에탄올 고정 aliquot 준비를 위한 필요 없이 대량 샘플링을 허용 하 고 오랜 기간 동안 안정적인 것을 입증 했다. 그러나, 인간 침15 등 단백질이 풍부한 샘플 단백질 flocs, 포 름 알 데히드에 의해 denaturized 불리 한 신호 잡음 비율을 발생할 수 있습니다 때문에 문제가 될 수 있습니다. 이 비교에서 절차의 대부분의 시간 (총에서 약 1 시간) 소요 됩니다 샘플 건조 하지만 독성 화학 물질 없이 사이트에 수행할 수 있습니다. 그것은 튜브, 냉각 또는 추가 위험 예방 조치 없이 쉽게 전달할 수 있는 안정 된 펠 릿을 생성 합니다. 또한, 많은 대체 고정 방법이 제안된11되었습니다. 우리는 강력히 새로운 샘플 세트를 소개 하는 경우 다른 프로토콜의 해상도 고정 안정성 테스트 권장 합니다.
우리는 세트를 분석 하 두 개의 서로 다른 흐름 cytometers 사용: i)는 매우 정교 하 고 비싼, 연구 중심 셀 정렬 및 현장 응용 프로그램5에 대 한 더 적절 한 나타나는 ii)는 응용 프로그램 집중 벤치 가기 분석기. PC와 ASC 셀 정렬와 함께 측정 하는 동안 BC 벤치 가기 분석기로 측정 되었다. 3 모범 샘플의 분석 최적화 재현성, 샘플 안정성과 워크플로 필요한 다른 절차를 설정합니다. 다음 프로토콜은 세 가지 다른 시스템에 대 한 섹션을 지정 합니다.

<table><tbody><tr><td>Milli-Q system Synthesis A10</td><td>Merck, Darmstadt, (GER)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioPak Ultrafiltration Cartridge</td><td>Merck, Darmstadt, (GER)</td><td>CDUF BI0 01</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo Legacy cell sorter</td><td>Beckman-Coulter, Brea, California (USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Innova 90C</td><td>Coherent, Inc , Santa Clara (USA)</td><td></td><td>334 nm - 364 nm, 100 mW</td></tr><tr><td>Innova 70C&amp;nbsp;</td><td>Coherent, Inc , Santa Clara (USA)</td><td></td><td>488 nm, 400 mW</td></tr><tr><td>Genesis MX488-500 STM OPS</td><td>Coherent, Inc , Santa Clara (USA)</td><td></td><td>488 nm, 400 mW</td></tr><tr><td>Xcyte CY-355-150</td><td>Lumentum, Milpitas, California, USA</td><td></td><td>355 nm, 150 mW</td></tr><tr><td>Photomultiplier tubes R928 and R3896</td><td>Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Summit 4.3 software</td><td>Beckman-Coulter, Brea, California (USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 &amp;micro;m&amp;nbsp; FluoSpheres</td><td>Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA)</td><td>F8815</td><td>350/440 blue fluorescent</td></tr><tr><td>2 &amp;mu;m YG FluoSpheres</td><td>Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA)</td><td>F-8827</td><td>505/515 yellow-green fluorescent beads&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.5 &amp;mu;m Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres</td><td>PolyScience, Niles, Illinois (USA)</td><td>18339</td><td>360/407</td></tr><tr><td>1 &amp;mu;m Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres</td><td>PolyScience, Niles, Illinois (USA)</td><td>17458</td><td>360/407 blue fluorescent</td></tr><tr><td>1 &amp;micro;mYG FluoSpheres</td><td>Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA)</td><td>F-13081</td><td>505/515 yellow-green fluorescent beads&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)</td><td>CAS no. 7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)</td><td>CAS no. 7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Cyflow Space&amp;nbsp;</td><td>Sysmex Corporation, Kobe (Japan)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV Laser Genesis CX,</td><td>Coherent, Inc , Santa Clara (USA)</td><td></td><td>355 nm, 150 mW</td></tr><tr><td>H6779-32 series PMTs</td><td>Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FloMax software</td><td>Sysmex Partec GmbH, G&amp;ouml;rlitz, (GER)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>all optical filters</td><td>Carl Zeiss, Jena (GER)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)</td><td>CAS no. 7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth, Karlsruhe (GER)</td><td>6781.3</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 10.0.8r1</td><td>FlowJo, LLC, Ashland, Oregon (USA)</td><td></td><td>Build number: 42398</td></tr><tr><td>R-software v.3.4.3</td><td>R Core Team</td><td></td><td></td></tr><tr><td>flowCHIC</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html&quot;&gt;http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html&lt;/a&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>flowCyBar</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html&quot;&gt;http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html&lt;/a&gt;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

characterizing microbiome dynamics &#8211; flow cytometry based workflows from pure cultures to natural communities

순수한 문화 조사 및 미생물 지역 사회 역동성의 모니터링은 이해 하 고 자연 생태계와 기술 응용 미생물에 의해 구동 제어 중요 합니다. 차세대 시퀀싱 메서드는 널리 활용 해결 microbiomes, 하지만 그들은 일반적으로 리소스와 시간을 집중 하 고 주로 질적 정보를 제공. 흐름 cytometric 미생물 분석 그 단점에서 고통을 하지 않습니다 및 상대 subcommunity 나타났는데 및 절대 제공할 수 있는 셀 번호 줄에. 직접 계통 발생 정보를 제공 하지 않습니다, 비록 그것 분석 깊이 접근을 시퀀싱의 해상도 강화할 수 있다. 의료 응용 프로그램 연구 및 일상적인 설정에 예리한 대조, cytometry 미생물 분석 하지 널리 사용 됩니다. 샘플 준비 및 데이터 분석 파이프라인에 대 한 누락 된 정보는 종종 교과서 교류 cytometry 응용 프로그램 것 미생물 분석도 전에 직면 하는 연구원에 대 한 진입 장벽을 만들 수 있습니다. 여기, 선물이 순수 문화에 대 한 세 개의 포괄적인 워크플로, 복잡 한 사회에서 분명 도전 행렬에 중간과 복잡 한 사회 각각. 우리는 개별 샘플링 및 고정 절차를 설명 하 고 각각 샘플 집합에 대 한 프로토콜을 얼룩이 지 최적화. 우리는 cytometric 분석 중심으로 복잡 한 연구와 응용 프로그램 집중된 벤치 톱 장치 셀 정렬 절차를 설명 하 고, 데이터 분석 패키지를 제안. 우리는 또한 중요 한 실험 제어를 제안 하 고 각각 샘플 세트를 제시 워크플로 적용 합니다.

다음 대표 결과 복제의 필요성을 강조 하 고 3 개의 샘플 세트의 각각에 서로 다른 데이터 시각화 및 분석 기법을 예증. 그들은 각 집합에 대 한 표준 연구 질문에 대 한 적합 한 가능한 데이터 평가 파이프라인의 결과 보여줍니다. 그러나, 제시 기법으로 선물을 샘플 집합에 독점 하지 않습니다. 교류 cytometry 원시 데이터와 함께 FlowRepository ID FR-FCM-ZY46에 공개적으로 사용할 수 되었다. 이전 업로드 된 ASC 데이터는 ID FR FCM ZYD7에서 사용할 수 있습니다.
생물학과 기술적인 복제 했다 촬영, 준비 하 고 게시 프로토콜11에 따라 분석. PC와 ASC에서 생물학적 복제 3 병렬 플라스 크에서 촬영 됐다. BC의 생물 복제는 파일럿 규모의 공장에서 한 위치에 3 개의 후속 samplings로 촬영 했다. 한 샘플의 3 aliquots 고정, 스테인드 되었고 기술 재현성을 보장 하기 위해 분석. 방법 재현성11이전에 게시 절차 따라 평가 했다. 하나의 샘플 세트 (보조 파일 1-S6)의 모든 샘플에 대 한 게이트 템플릿 게이트 당 표준 편차 (%)를 계산에 사용 되었다.
PC를 위한 관계 되는 풍부의 최대 표준 편차 평균 표준 편차는 2.13% (그림 1) 동안 3.44%, 이었다. ASC와 BC, 상대 나타났는데 최대 표준 편차 표준 편차의 평균 2.13%와 0.21% (보충 파일 1-S8) 동안 1.27%, 0.88%, 이었다.
표준 절차, 순수한 긴장 문화를 조사할 때 지연 위상, 생성 시간 및 특정 조건 하에서 세포 밀도 분석 하는 성장 곡선의 준비 이다. 우리가이 절차 흐름 cytometric 분석 워크플로 (그림 2) 시스템의 더 깊은 이해를 달성 하기 위해 결합. DAPI 대 FSC 형광 플롯 배치 문화의 다른 지점에서 문화의 세포 주기 상태 공개. 마스터 게이트 템플릿 (보충 파일 1-S6) 하나 (c1n), 포함 된 셀의 비율을 측정 하기 위해 설립 되었다 2 (c2n)와 여러 개의 염색체 (cXn, 그림 2B). 접종된 세포의 우세 비율 하나의 염색체 (0 h에서 93.7%) 했다. 이 지 수 성장, 어디 거의 모든 셀 하나 이상의 (99.6%, 4 h)을 포함 하 고 이상 인구 (53.1%)의 절반도 포함 된 두 개 이상의 염색체 동안 대폭 변경. 이것의 생성 시간 보다 더 빨리 그것의 염색체를 복제 하는 P. putidas 능력을 보여줍니다.
흐름 cytometric 분석 미생물 커뮤니티의 진화를 모니터링을 위한 매우 유용한 입증 했다. 그것은 더 많은 자원을 집중 분자 방법5,10보다 가까이 지역 사회 역학을 따를 수 있습니다. 우리 영화에이 역동성을 강조 하 고 시간이 지남에 활성된 슬러지 사회 변화에 대 한 개요를 얻었다. 각 1 초 프레임 샘플 포인트 (보충 파일 2)의 FSC 대 DAPI 형광 줄거리를 보여 줍니다. 0 일과 4 일 사이 매우 뚜렷한 변화는 7 일 후 핵심 공동체의 설립에 선행 되었다. 추가 subcommunities 하루 21에서 했다. 우리는 subcommunity 수준에 미생물 역학의 평가 사용 하는 마스터 게이트 서식 파일 (보충 파일 1-S6) 설립. 실험의 다른 단계에 있는 지배적인 subcommunities 명확 하 게 CyBar 도구 (그림 3)를 사용 하 여 확인 되었다. 상대 subcommunity 나타났는데 도움이 흥미로운 (키 시간에 발생에 중요 한 변화) 빌 게이츠를 선택 하 고 가능한 주파수 분배와 (이상 5% 상대 풍부) 정렬 및 추가 분석22.
산업 규모 생물 응용 프로그램 동요 제한으로 인해 잠재적인 공간 heterogeneities를 직면할 수 있다. 그들은 또한 자주 운영 매개 변수, 교대 비 합성 기판의 품질에서 변화에 노출 됩니다. BC 이러한 시스템을 대표 하 고 동적으로 구동된 플러그 흐름 반응 기에서 다른 지역에서 샘플링. DAPI 대 FSC 형광 플롯 (그림 4) 모범 샘플 포인트의 표시만 작은 공간, 하지만 발음 임시이. BC는 둘 다를 사용 하 여 조사에 추가, 빠른 자동화 세련 및 자세한 마스터 게이트 템플릿 기반 CyBar 접근.
자동화, 신속 하 고 공평한 자연의 산업 환경에서 특히 bioprocesses의 현장 제어에 대 한 흥미는 세련 된 게. 그것은 모든 사용 가능한 샘플의 원시.fcs 데이터를 비교합니다. 이러한 비교의 두 그림 5에 표시 됩니다. 결과 서로 값에 관한 공간 및 시간이 이전 관측을 확인 합니다. NMD 플롯 생성 양식 세련 된 도구 호환성 매트릭스 (그림 6) 더이 결과 substantiates 하 고 그에 따라 그것을 시각화.
또한, 우리는 마스터 게이트 템플릿 (보충 파일 1-S6)를 사용 하 여 BC의 23 subcommunities의 상대 나타났는데 계산. 1 년 기간에서 48 샘플의 상관 관계 분석 기능 미생물 지역 사회 관계를 이해 하 실시 됐다. 이 추가 조사 (4 셀 정렬)에 대 한 관심의 식별 수 있습니다. Abiotic 매개 변수와 함께 강한 긍정적인 또는 부정적인 상관 관계 같은 제품 titers 이해 하 고 생태계 및 바이오 프로세스를 최적화 하는 데 도움이 수 있습니다. 이 상관 관계 (그림 7)에 포함 된 유기 로딩 속도 같은 비 생물 적인 매개 변수를 예로 보여주. G4, G5, g 10 강한 긍정적인 상관 관계를 전시 하 고 수 있는 가능 하 게 포함 되 고 발효 종, G8에 부정적인 상관 관계 methanogenic archaea을 향해 힌트 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig1.jpg"> 그림 1: 순수 문화의 cytometric 분석의 재현성. FSC 대 DAPI 형광 ± 1 표준 편차 (C, D)를 나타내는 오차 막대와 제어 구슬 (A, B) 및 바 3 subcommunity 나타났는데 [%]의 플롯을 플롯 합니다. 상대 나타났는데 보충 파일 1-s 6에 표시 된 게이트 템플릿을 결정 했다. A, B, C 4 h에서 성장 곡선의 찍은 3 생물 복제와 3 개의 기술 복제 P1, P2, P3 샘플 A에서 준비 되었고 몇 번이 고, 각각 측정: M1, M2, M3, 그들의 각각 표준 편차와 함께 부여 됩니다. 50000 이벤트 셀 게이트에 기록 되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig2.jpg"> 그림 2: 순수 문화 성장 곡선 중의 세포 주기 분석 실험 (A) 이상 12 헤. FSC 대 DAPI 형광의 지 수 성장 단계 동안 DNA 콘텐츠의 변화는 bi 시간당 samplings 플롯 합니다. 이 측정 시리즈 팬 들은 구슬 (보충 파일 1-S3 참조)의 정보를 포함 하지 않습니다. (B). ± 1 표준 편차와는 subcommunities에서 상대 나타났는데 시간이 지남에 나타내는 오차 막대를 가진 광학 밀도 기반 성장 곡선. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig3.jpg"> 그림 3: 활성된 슬러지 커뮤니티 구조 24 일 동안의 진화. (A) 주파수 분배 동향의 유사성에 의해 정렬 된 개별 게이츠 boxplots 시각 overlaying와 flowCyBar, 해당 색상 키 (B)와 NMD 플롯 재치 R 유사성 분석 < 0.001 ( C). 기본 플롯 보충 파일 2에 필름 순서에 표시 됩니다. 상대 나타났는데 보충 파일 1-S6 게이트 서식 파일을 사용 하 여 결정 했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig4.jpg"> 그림 4: 미생물 지역 사회 구조는 산업 규모에서의 공간과 일시적인이 플러그 흐름 biogas 반응 기. (A) 4의 미생물 지역 사회 구조의 비교 샘플링 포트 I-IV 날 223. (B) 하루 384 포트에서 시간 의존 사회 구조 변이 하루 0에서에서의 비교 II. 소음 뒤늦게 시각화를 향상 시키기 위해 차단 되어 있다. 250000 이벤트 셀 게이트 (보충 파일 1-S6)에 측정 되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig5.jpg"> 그림 5: Cytometric 히스토그램 이미지 비교-세련 된. 세련 된 알고리즘의 원리는 공간 및 시간이 각각 대표 하는 두 개의 샘플을 비교 하 여 exemplified입니다. (i) 세련 된 이미지는 두 개의 매개 변수 (FSC 대 DAPI 형광) 표시를 선택한 후.fcs 파일에서 생성 됩니다. 그레이 스케일 (0-255) 코드는 픽셀에서 이벤트 수 있습니다. (ii) 세련 된 하위 포함 하는 셀 영역을 지정한 후 생성 (여기: 200 < < 4000, 200 x < y < 2200). (iii) XOR 조합 이미지 사이의 하위 픽셀을 비교 하 여 만들어집니다. 차이가 0을 검은색으로 표시 됩니다. 최대 차이 200 이며 흰색으로 표시 됩니다입니다. 해당 XOR 값 XOR 이미지의 모든 픽셀의 그레이 스케일 값을 추가 하 여 계산 됩니다. (iv) 오버레이 조합 이미지 하위 픽셀의 그레이 스케일 값을 추가 하 여 만들어집니다. 해당 오버레이 값을 0 및 그러므로 정보를 포함 하지 않는 오버레이 이미지의 픽셀을 계산 하 여 계산 됩니다. (v) 서로 값 XOR 및 오버레이 값을 분할 하 여 계산 됩니다. 다음은 그림 6에서 NMD 음모에 대 한 기초입니다. 모두는 서로 가치와 NMD 플롯 표시는 무시할 수 공간-그리고 발음된 일시적인 지역 사회가 성분. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig6.jpg"> 그림 6: 세련 된 기반 바이오 커뮤니티 샘플의 유사성 분석. 0-하루 샘플 분석 (보충 파일 1-S11)을 왜곡 하는 그것의 매우 다른 지역 사회 구조 때문이 음모에서 제외 했다. NMD 플롯 낮은 공간에 대 한 가설을 확인-및 높은 일시적인이 세련 된 도구를 사용 하 여 만든 고 그림 5에 설명 했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig7.jpg"> 그림 7: 바이오 커뮤니티에 상관 관계 분석. 매트릭스는 Spearman의 등급 순서 계수를 사용 하 여 계산 하 고 보충 파일 1-S6에서 마스터 게이트 템플릿으로 결정 했다 23 subcommunities의 상대적인 나타났는데 기반. 그들은 1 년 기간에서 48 샘플에 대 한 유기 로딩 속도 (OLR)와 상관 했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig8.jpg"> 그림 8: planktonic (P)와 슬러지의 유사성 분석 기반 폐수 지역 사회 (S). 샘플 기본 헤어 청 징 제 (PCL), 활성화 슬러지 분 지 (AS)와 본격적인 폐수 처리 공장 (보충 파일 1-S10에서 점 플롯)의 소화 탱크 (DT)에서 찍은. 상대 나타났는데 보충 파일 1-s 6에 표시 된 게이트 템플릿을 사용 하 여 결정 했다. 이러한 subcommunity 나타났는데도 CyBar (보조 파일 1-S10) 및 NMD를 만드는 flowCyBar 도구와 분석 되었다 음모 (R < 0.01). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig9.jpg"> 그림 9: 순수 문화 정착 안정성. 0 h에서 찍은 성장 곡선 실험에서 샘플 15% 글리세롤에 고정 후 28 일 동안-80 ° C에서 저장 되었다. FSC 대 DAPI 형광 구슬 표시 됩니다 컨트롤과 플롯 합니다. 측정 시리즈 팬 들은 구슬 (보충 파일 1-S3)의 정보를 포함 하지 않습니다. 50000 이벤트 셀 게이트 (보충 파일 1-S6)에 기록 되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig9large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 파일 1: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/Supplementary-File-1.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 파일 2: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/Supplementary_File_2.gif" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

흐름 cytometric 분석은 순수 문화 조사 및 미생물 지역 사회 역학을 모니터링 귀중 한 입증 했다. 우리는 순수한 문화 및 도전 행렬에서 명확한 매체 뿐만 아니라 복잡 한 사회에 대 한 데이터 분석, 샘플링에서 세 개의 포괄적인 워크플로 각각 제시.

특성화 미생물 역학-Cytometry 워크플로 순수 문화에서 자연 커뮤니티를 기반으로

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical ...

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Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly constituted by proteins and exopolysaccharides, among other factors 7-10. The microbial community encased within the biofilm often shows the differentiation of distinct subpopulation of specialized cells 11-17. These subpopulations coexist and often show spatial and temporal organization within the biofilm 18-21.
Biofilm formation in the model organism Bacillus subtilis requires the differentiation of distinct subpopulations of specialized cells. Among them, the subpopulation of matrix producers, responsible to produce and secrete the extracellular matrix of the biofilm is essential for biofilm formation 11,19. Hence, differentiation of matrix producers is a hallmark of biofilm formation in B. subtilis.
We have used fluorescent reporters to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers in biofilms of B. subtilis 15,19,22-24. Concretely, we have observed that the subpopulation of matrix producers differentiates in response to the presence of self-produced extracellular signal surfactin 25. Interestingly, surfactin is produced by a subpopulation of specialized cells different from the subpopulation of matrix producers 15.
We have detailed in this report the technical approach necessary to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers and surfactin producers within the biofilms of B. subtilis. To do this, fluorescent reporters of genes required for matrix production and surfactin production are inserted into the chromosome of B. subtilis. Reporters are expressed only in a subpopulation of specialized cells. Then, the subpopulations can be monitored using fluorescence microscopy and flow cytometry (See Fig 1).
The fact that different subpopulations of specialized cells coexist within multicellular communities of bacteria gives us a different perspective about the regulation of gene expression in prokaryotes. This protocol addresses this phenomenon experimentally and it can be easily adapted to any other working model, to elucidate the molecular mechanisms underlying phenotypic heterogeneity within a microbial community.

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Microbial biofilms are generally constituted by distinct subpopulations of specialized cells. Single-cell analysis of these subpopulations requires the use of fluorescent reporters. Here we describe a protocol to visualize and monitor several subpopulationswithin B. subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.

의 단일 세포 분석 바실러스 subtilis</em형광 현미경 및 유동세포계측법 사용> Biofilms

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

연구

면역학 및 감염병학

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond quickly to environmental changes and can be thus used as indicators of water quality. Currently, biofilm assessment is mostly based on integrative and functional endpoints, such as photosynthetic or respiratory activity, which do not provide information on the biofilm community structure. Flow cytometry and computational visualization offer an alternative, sensitive, and easy-to-use method for assessment of the community composition, particularly of the photoautotrophic part of freshwater biofilms. It requires only basic sample preparation, after which the entire sample is run through the flow cytometer. The single-cell optical and fluorescent information is used for computational visualization and biological interpretation. Its main advantages over other methods are the speed of analysis and the high-information-content nature. Flow cytometry provides information on several cellular and biofilm traits in a single measurement: particle size, density, pigment content, abiotic content in the biofilm, and coarse taxonomic information. However, it does not provide information on biofilm composition on the species level. We see high potential in the use of the method for environmental monitoring of aquatic ecosystems and as an initial biofilm evaluation step that informs downstream detailed investigations by complementary and more detailed methods.

Flow cytometry in combination with visual clustering offers an easy-to-use and fast method for studying aquatic biofilms. It can be used for biofilm characterization, detection of changes in biofilm community structure, and detection of abiotic particles embedded in the biofilm.

Cytometry와 수생 Biofilms의 특성

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

환경과학

Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales

Understanding the transport, dispersion and deposition of microorganisms in porous media is a complex scientific task comprising topics as diverse as hydrodynamics, ecology and environmental engineering. Modeling bacterial transport in porous environments at different spatial scales is critical to better predict the consequences of bacterial transport, yet current models often fail to up-scale from laboratory to field conditions. Here, we introduce experimental tools to study bacterial transport in porous media at two spatial scales. The aim of these tools is to obtain macroscopic observables (such as breakthrough curves or deposition profiles) of bacteria injected into transparent porous matrices. At the small scale (10-1000 &#181;m), microfluidic devices are combined with optical video-microscopy and image processing to obtain breakthrough curves and, at the same time, to track individual bacterial cells at the pore scale. At larger scale, flow cytometry is combined with a self-made robotic dispenser to obtain breakthrough curves. We illustrate the utility of these tools to better understand how bacteria are transported in complex porous media such as the hyporheic zone of streams. As these tools provide simultaneous measurements across scales, they pave the way for mechanism-based models, critically important for upscaling. Application of these tools may not only contribute to the development of novel bioremediation applications but also shed new light on the ecological strategies of microorganisms colonizing porous substrates.

Breakthrough curves (BTCs) are efficient tools to study the transport of bacteria in porous media. Here we introduce tools based on fluidic devices in combination with microscopy and flow cytometric counting to obtain BTCs.

유체 장치를 현미경 검사법과 유동 세포측정과 결합하여 공간 저울을 가로지르는 다공성 미디어에서 미생물 수송을 연구합니다.

Understanding the transport, dispersion and deposition of microorganisms in porous media is a complex scientific task comprising topics as diverse as ...

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is strongly regulated by the surrounding flow and nutritional environment. Biofilm growth also increases the heterogeneity of the local microenvironment by generating complex flow fields and solute transport patterns. To investigate the development of heterogeneity in biofilms and interactions between biofilms and their local micro-habitat, we grew mono-species biofilms of Pseudomonas aeruginosa and dual-species biofilms of P. aeruginosa and Escherichia coli under nutritional gradients in a microfluidic flow cell. We provide detailed protocols for creating nutrient gradients within the flow cell and for growing and visualizing biofilm development under these conditions. We also present protocols for a series of optical methods to quantify spatial patterns in biofilm structure, flow distributions over biofilms, and mass transport around and within biofilm colonies. These methods support comprehensive investigations of the co-development of biofilm and habitat heterogeneity.

Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.

바이오 필름 및 서식지의 이질성의 공동 개발을 특성화하기위한 방법

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

생체공학

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. Determining the real time state of a microbial cell goes beyond live or dead categories, as microbes can exist in a dormant state, whereby cell division and metabolic activities are reduced. Given the need for detection and quantification of microbes, flow cytometry (FCM) with molecular probes provides a rapid and accurate method to help determine overall population viability. By using SYTOX Green and SYTOX Orange in the model cyanobacteria Microcystis aeruginosa to detect membrane integrity, we develop a transferable method for rapid indication of single cell mortality. The molecular probes used within this journal will be referred to as green or orange nucleic acid probes respectively (although there are other products with similar excitation and emission wavelengths that have a comparable modes of action, we specifically refer to the fore mentioned probes). Protocols using molecular probes vary between species, differing principally in concentration and incubation times. Following this protocol set out on M.aeruginosa the green nucleic acid probe was optimized at concentrations of 0.5 &#181;M after 30 min of incubation and the orange nucleic acid probe at 1 &#181;M after 10 min. In both probes concentrations less than the stated optimal led to an under reporting of cells with membrane damage. Conversely, 5 &#181;M concentrations and higher in both probes exhibited a type of non-specific staining, whereby &#39;live&#39; cells produced a target fluorescence, leading to an over representation of &#39;non-viable&#39; cell numbers. The positive controls (heat-killed) provided testable dead biomass, although the appropriateness of control generation remains subject to debate. By demonstrating a logical sequence of steps for optimizing the green and orange nucleic acid probes we demonstrate how to create a protocol that can be used to analyse cyanobacterial physiological state effectively.

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism Microcystis aeruginosa Using Flow Cytometry

Microbial populations contain substantial cell heterogeneity, which can dictate overall behavior. Molecular probe analysis through flow cytometry can determine physiological states of cells, however its application varies between species. This study provides a protocol to accurately determine cell mortality within a cyanobacterium population, without underestimating or recording false positive results.

분자 프로브 최적화 (광합성 생물의 세포 사망을 확인하는 방법<em&gt; Microcystis aeruginosa의</em&gt;) 유동 세포 계측법을 사용하여

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. ...

의학

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular components responsible for supplying cell energy; however, excess mitochondria also produce reactive oxygen species (ROS) that could cause cell death. Therefore, the number of mitochondria must constantly be adjusted to fit the needs of the cells. This dynamic regulation is achieved in part through the function of lysosomes that remove surplus/damaged organelles and macromolecules. Hence, cellular mitochondrial and lysosomal contents are key indicators to evaluate the metabolic adjustment of cells. With the development of probes for organelles, well-characterized lysosome or mitochondria-specific dyes have become available in various formats to label cellular lysosomes and mitochondria. Multicolor flow cytometry is a common tool to profile cell phenotypes, and has the capability to be integrated with other assays. Here, we present a detailed protocol of how to combine organelle-specific dyes with surface markers staining to measure the amount of lysosomes and mitochondria in different T cell populations on a flow cytometer.

This article illustrates a powerful method to quantify mitochondria or lysosomes in living cells. The combination of lysosome- or mitochondria-specific dyes with fluorescently conjugated antibodies against surface markers allows the quantification of these organelles in mixed cell populations, like primary cells harvested from tissue samples, by using multicolor flow cytometry.

미토 콘 드리 아와 T 세포에서는 리소좀의 다 색 흐름 Cytometry 기반 정량화

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is responsible for altering infection for many of these viruses. Thus, characterizing the nature of virus-bacteria binding is a foundational step needed for elucidating the mechanism(s) by which bacteria alter viral infection. For human norovirus, commensal bacteria enhance B cell infection. The virus directly binds to these bacteria, indicating that this direct interaction is involved in the mechanism of infection enhancement. A variety of techniques can be used to quantify interactions between bacteria and viruses including scintillation counting of radiolabeled viruses and polymerase chain reaction (PCR). Both methods require the use of live virus, which may need to be generated in the laboratory. Currently, none of the established in vitro culture systems available for human norovirus are robust enough to allow for generation of highly concentrated viral stocks. In lieu of live virus, virus-like particles (VLPs) have been used to characterize the interactions between norovirus and bacteria. Herein a flow cytometry method is described with uses virus specific antibodies to quantify VLP binding to gram-negative and gram-positive bacteria. Inclusion of both bacteria only and isotype controls allowed for optimization of the assay to reduce background antibody binding and accurate quantification of VLP attachment to the bacteria tested. High VLP:bacterium ratios result in VLPs binding to large percentages of the bacterial population. However, when VLP quantities are decreased, the percent of bacteria bound also decreases. Ultimately, this method can be employed in future experiments elucidating the specific conditions and structural components that regulate norovirus:bacterial interactions.

The goal of this protocol is to quantify binding of the eukaryotic pathogen human norovirus to bacteria. After performing an initial virus-bacterium attachment assay, flow cytometry is used to detect virally-bound bacteria within the population.

유세포측정을 사용하여 공생 균에 결합하는 인간 노로바이러스 바이러스와 같은 입자 정량화

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is ...

Flow Cytometric Characterization of Murine B Cell Development

Extensive studies have characterized the development and differentiation of murine B cells in secondary lymphoid organs. Antibodies secreted by B cells have been isolated and developed into well-established therapeutics. Validation of murine B cell development, in the context of autoimmune prone mice, or in mice with modified immune systems, is a crucial component of developing or testing therapeutic agents in mice and is an appropriate use of flow cytometry. Well established B cell flow cytometric parameters can be used to evaluate B cell development in the murine peritoneum, bone marrow, and spleen, but a number of best practices must be adhered to. In addition, flow cytometric analysis of B cell compartments should also complement additional readouts of B cell development. Data generated using this technique can further our understanding of wild type, autoimmune prone mouse models as well as humanized mice that can be used to generate antibody or antibody-like molecules as therapeutics.

We describe herein a simple analysis of the heterogeneity of the murine immune B cell compartment in the peritoneum, spleen, and bone marrow tissues by flow cytometry. The protocol can be adapted and extended to other mouse tissues.

뮤린 B 세포 발달의 유동 세포 측정 특성화

Extensive studies have characterized the development and differentiation of murine B cells in secondary lymphoid organs. Antibodies secreted by B cells ...

Flow Cytometry Approach to Characterize Phagocytic Properties of Acutely-Isolated Adult Microglia and Brain Macrophages In Vitro

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in neurological diseases including neurodegeneration and stroke. CNS-MPs are involved in phagocytic clearance of pathological proteins, debris and neuronal synapses, each with distinct underlying molecular pathways. Characterizing these phagocytic properties can provide a functional readout that compliments molecular profiling of microglia using traditional flow cytometry, transcriptomics and proteomics approaches. Phagocytic profiling of microglia has relied on microscopic visualization and in vitro cultures of mouse neonatal microglia. The former approach suffers from limited sampling while the latter approach is inherently poorly reflective of the true in vivo state of adult CNS-MPs. This paper describes optimized protocols to phenotype phagocytic properties of acutely-isolated mouse CNS-MPs by flow cytometry. CNS-MPs are acutely isolated from adult mouse brain using mechanical dissociation followed by density gradient centrifugation, incubated with fluorescent microspheres or fluorescent A&#946; fibrils, washed, and then labeled with panels of antibodies against surface markers (CD11b, CD45). Using this approach, it is possible to compare phagocytic properties of brain-resident microglia with CNS-infiltrating macrophages and then assess the effect of aging and disease pathology on these phagocytic phenotypes. This rapid method also holds potential to functionally phenotype acutely-isolated human CNS-MPs from post-mortem or surgical brain specimens. Additionally, specific mechanisms of phagocytosis by CNS-MP subsets can be investigated by inhibiting select phagocytic pathways.

<meta charset="utf8"></head><body>In vitro에서 급성 고립된 성인 미세아교세포와 뇌 대식세포의 식세포 특성을 특성화하기 위한 유세포 분석 접근법

Assessment of phagocytic properties of microglia and brain macrophages can provide a valuable functional dimension to molecular profiling studies. We describe a validated protocol that uses flow cytometry to rapidly and reliably quantify phagocytosis of fluorescent microspheres and amyloid beta fibrils by acutely-isolated microglia and brain macrophages from mouse models.

In vitro에서 급성 고립된 성인 미세아교세포와 뇌 대식세포의 식세포 특성을 특성화하기 위한 유세포 분석 접근법

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in ...

특성화 미생물 역학-Cytometry 워크플로 순수 문화에서 자연 커뮤니티를 기반으로

요약

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분자 프로브 최적화 (광합성 생물의 세포 사망을 확인하는 방법

미토 콘 드리 아와 T 세포에서는 리소좀의 다 색 흐름 Cytometry 기반 정량화

유세포측정을 사용하여 공생 균에 결합하는 인간 노로바이러스 바이러스와 같은 입자 정량화

뮤린 B 세포 발달의 유동 세포 측정 특성화

In vitro에서 급성 고립된 성인 미세아교세포와 뇌 대식세포의 식세포 특성을 특성화하기 위한 유세포 분석 접근법

In vitro에서 급성 고립된 성인 미세아교세포와 뇌 대식세포의 식세포 특성을 특성화하기 위한 유세포 분석 접근법