이 프로젝트는 생명과학과 연구 노르웨이 위원회, 부여 번호 243811 및 244461 (양식 프로그램)의 노르웨이 대학에 의해 투자 되었다. 우리는 물고기 시설을 유지 하기 위한 생명 공학의 노르웨이 대학에서 루르 드 Carreon 탄을 감사입니다.

이 연구에서 동물 실험은 생명 과학, 관리 및 연구 동물의 복지에 대 한 다음 지침의 노르웨이 대학에 의해 승인 되었다.
1입니다. 솔루션의 준비
<ol><li>정확한 측정을 위해 제조업체의 지침에 따라 osmometer 및 pH 미터 계기 보정.</li>
	<li>
캘리포니아2 +-와 Mg2 +500ml를 준비-Dulbecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 (dPBS), 7.75 (단계 1.2.1)을 pH와 290 mOsm/kg (단계 1.2.2) 살 균 여과 (1.2.3 단계) 전에 osmolality 조정 무료.
	<ol>
<li>신중 하 게 신중 하 게 해결책을 교 반 하면서 방울 1 M NaOH 솔루션을 추가 하 여 보정 된 pH 미터 7.75에 pH를 조정 합니다.</li>
		<li>보정된 osmometer를 사용 하 여 솔루션의 osmolality 측정 하 고 마 니 톨 290 mOsm/kg osmolality 증가 하는 데 필요한 금액을 계산. 마 니 톨의 필요한 금액을 추가 하 고 다시 올바른 조정 되도록 솔루션의 osmolality 측정. 참고: 필요한 마 니 톨의 크기는 일반적으로 다른 배치 사이 변화 한다, 측정 osmolality에 따라 다릅니다. 마 니 톨에의 한 분자 1 삼 투 입자를 같습니다.</li>
		<li>멸 균 필터 dPBS 솔루션 0.2 µ m 필터를 사용 하 여. 참고: 솔루션 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 3 개월 이상.</li>
	</ol>
</li>
	<li>L-글루타민 및 중 탄산염, Leibovitz (L-15) 문화 매체의 500 mL를 준비 하 고 그것은 10 mm NaHCO3 (단계 1.3.1), 4.5 m m 포도 당 (1.3.2), 단계 및 2mm 상용 글루타민 (1.3.3 단계) 보완. 290 mOsm/kg (1.3.4), 단계에 대 한 해결책을 조정 살 균 필터 그것 (1.3.5 단계), 페니실린 스 솔루션 (단계 1.3.6)의 2.5 mL을 추가. 참고: 솔루션 저장할 수 있습니다 4 ° C에 적어도 4 주 동안.<ol>
<li>10 m m 솔루션을 달성 하기 위해 문화 매체의 500 mL 당 NaHCO3 의 420 mg을 추가 합니다.</li>
		<li>4.5 m m 솔루션을 달성 하기 위해 문화 매체의 500 mL 당 포도 당의 405 mg을 추가 합니다.</li>
		<li>2mm 솔루션을 달성 하기 위해 문화 매체의 500 mL에 글루타민 솔루션의 100 x 재고의 5 mL를 추가 합니다. 모든 용액 해산 때까지 휘저어.</li>
		<li>마 니 톨을 사용 하는 osmometer (단계 1.2.2에서에서 수행)와 290 mOsm/kg을 솔루션을 조정 합니다.</li>
		<li>0.2 µ m 필터를 사용 하 여 L-15 매체의 살 균 여과 수행 합니다.</li>
		<li>살 균 여과 후 페니실린의 50 U/mL 및 50 µ g/mL 스에 해당 하는 페니실린 스 솔루션의 2.5 mL를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>50 mL (0.1%) 트립 신 유형 II-S (단계 1.2 준비) 수정된 dPBS에 녹아의 1 mg/mL를 사용 하 여 트립 신 솔루션의 준비. 살 균 플라스틱 튜브에 2ml의 aliquots를 만들고 사용까지-20 ° C에서 저장. 참고: Aliquots 2 mL의 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 3 개월 이상.</li>
	<li>1 mg/mL (0.1%) 트립 신 억제 물 유형 I-S의,를 사용 하 여 트립 신 억제제 솔루션 50 mL를 준비 하 고 (단계 1.2 준비) 수정된 dPBS에서 해산 하는 DNase의 2 µ g/mL와 함께 그것을 보완. 살 균 플라스틱 튜브에 2ml의 aliquots를 만들고 사용까지-20 ° C에서 저장. 참고: Aliquots 2 mL의 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 3 개월 이상.</li>
</ol>2입니다. 장비 준비
<ol><li>셀 분리에 대 한 팁을 연마 하는 불에 의해 유리 펫을 준비 합니다. 2 다른 크기 범주와 팁을 확인 (0.6-0.8의 중간 오프닝 µ m 및 0.4-0.6의 작은 개통 µ m) 동시에 피펫으로 선회 하면서 시간과 거리는 불꽃에서 재생 하 여. 넣어 유리 펫 깨끗 한 유리 용기에 압력솥 (모드를 사용 하는 고체 105 ° C에서 45 분).</li>
	<li>얼음으로 폴리스 티 렌 상자를 준비 합니다.</li>
	<li>해 부 동안에 pituitaries를 전송 하 고 얼음에 유지 1.5 mL (단계 1.2 준비) 수정된 dPBS의 플라스틱 튜브를 준비 합니다.</li>
	<li>(단계 1.2 준비) 수정된 dPBS의 10 mL 15 mL 튜브를 준비 하 고 셀 분리까지 얼음에 그것을 유지.</li>
	<li>신선한 준비 또는 트립 신, 트립 신 억제제 솔루션 (1.4와 1.5 단계에서 준비)의 aliquots를 해 동 하 고 사용까지 얼음에 그들을 유지.</li>
	<li>pituitaries의 화학 분리 하기 전에 원하는 온도 도달 물 수 있도록 해 부를 시작 하기 전에 26 ° C에 물 목욕을 설정 합니다.</li>
	<li>전에, 하는 동안, 그리고 물고기를 고정 해 부 및 정밀한 바늘 및 왁 스 격판덮개에 사용할 미세 집게를 포함 한 사용 후 70% 에탄올과 모든 해 부 도구를 청소 합니다. 깨끗 한 장갑을 사용 (변경 하 고 자주 청소) 셀의 잠재적인 오염을 방지 하는 전체 절차 동안.</li>
</ol>3. 뇌 해 부 및 세포 분리
<ol><li>얼음 비 자금 (0 ° C)에 그것을 immersing 하 여 물고기를 안락사. 돌이킬 수 없는 저체온증이 충격을 위해 적어도 1 분 동안 얼음 비 자금에서 물고기를 둡니다. 참고: 몇 초 후 동원 정지 및 평형 손실이 발생할 것입니다. 생선과 얼음 물에 완전히 빠져들은 거짓말을 하지 않습니다, 얼음 위에 후자는 질 식으로 이어질 것입니다 하 고 잠재적인 피부 화상을 신속 하 고 자비 롭 저체온증이 충격 대신 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>신속 하 게 그물에 물고기 해 부 현미경 아래 왁 스 격판덮개 전송 하 고 목을 통해 바늘 펀치 척추를 파괴.</li>
	<li>안정 해 부 하기 전에 머리 (뇌)의 뒤에 머리의 각 측에 (입)을 통해 전면에 한 바늘을 삽입 하 여 미세한 바늘을 사용 하 여 왁 스 격판덮개에 물고기의 머리 핀.</li>
	<li>해 부 현미경 아래 물고기 하 고 부드럽게 직각된 팁과 미세 집게를 사용 하 여 머리의 상단에 비늘을 긁어.</li>
	<li>신중 하 게 머리의 측면에서 피부 아래 좋은 집게의 각된 끝을 삽입 하 고 집게 포함 두개골 지붕에 확고 한 그립을 잡고 있는 동안 입의 방향에는 집게를 천천히 움직여서 두개골 지붕 제거.</li>
	<li>잘라 척수 완전히 직각된 팁과 집게를 사용 하 여. 참고: 시간 효율적으로 중요 한 요소, 그래서 작업 이다 고 정확 하 게 제한 시간을 보냈다는 pituitaries의 해 부에서 세포는 접시에 도금 될 때까지. 일부 연습 후 뇌 해 부 10 주위 에서만 있는 물고기, 당 약 2-3 분 소요 됩니다 s 두뇌는 이미 노출 될 경우는 뇌 하 수 체를 선택 하는 데 필요한.</li>
	<li>신중 하 게 노출 하는 뇌 하 수 체 고 스트레이트 팁으로 깨끗 한 겸으로 해 부 입으로 뇌를 플립. 플라스틱 튜브 1.5 mL 수정 dPBS를 포함 하는 뇌 하 수 체 전송 (자세한 단계 2.3 참조) 얼음에. 하는 뇌 하 수 체 튜브에 성공적으로 추가 되 고 아무것도 집게에 남아 현미경 집게의 끝을 확인 하십시오. 참고: 문화 요리 준비를 동시에는의 수에 따라 필요에 따라 많은 pituitaries를 해 부. 엄지손가락의 규칙으로 서 성인 생선 접시 (다운스트림 응용 프로그램에 따라 달라 집니다)는 세포의 적절 한 밀도를 당 적어도 10 pituitaries를 계산 합니다.</li>
	<li>실 온에서 1-2 대 한 탁상 원심 분리기에서 pituitaries 아래로 회전 합니다. 조심 스럽게 dPBS 유리 피 펫을 사용 하 여 제거 하 고 모든 pituitaries를 제거 하지 않도록 주의.</li>
	<li>씻어는 pituitaries, 1-2 s, 탁상 원심 분리기에서 스핀 다운 trypsin 솔루션의 추가 1 mL을 추가 하기 전에 유리 피 펫을 사용 하 여 액체의 대부분을 제거 (단계 1.4에서에서 준비) trypsin 솔루션의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>가령, 부드러운 떨고, 30 분, 26 ° C에서 물 욕조에 튜브를 품 어 또는 양자 택일로, 영화 튜브 몇 번 인큐베이션 기간 동안.</li>
	<li>실 온에서 1-2 대 한 탁상 원심 분리기에서 pituitaries 아래로 회전 시키십시오 그리고 모든 pituitaries 튜브의 하단에 위치 하 고 있는지 확인 하십시오. 유리 피 펫과 트립 신 솔루션의 대부분을 제거 하 고는 트립 신을 비활성화 하는 pituitaries 세척 트립 신 억제 물 솔루션 (1.5 단계에서 준비) 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>실 온에서 1-2 대 한 탁상 원심 분리기에서 그들을 아래로 회전 하 여 튜브의 하단에 pituitaries를 수집 합니다. 유리 피 펫과 액체의 대부분을 제거 하 고 트립 신 억제 물 솔루션 (1.5 단계에서 준비) 1 mL를 추가 합니다. 부드러운 떨고, 가령 20 분 26 ° C에서 물 욕조에 튜브 또는 양자 택일로, 영화 튜브 몇 번 비활성화는 트립 신을 인큐베이션 기간 동안.</li>
	<li>L-15 매체의 2 개 mL를 추가 하 고 셀을 도금 하기 전에 적당 한 온도 pH 도달할 수 있도록 1% CO2 와 26 ° C에 적어도 10 분 동안 품 어 하 여 중앙 유리 바닥 35 m m 폴 리 d lysine 코팅 셀 문화 접시를 준비 합니다. 참고: 플라스틱 셀 문화 접시 사용할 수도 있습니다. 중앙된 유리 바닥 접시를 사용 하 여의 주요 장점은 셀 도금은 지역 이다 더 작은, 따라서, 적은 뇌 세포는 접시 당 필요. 일부 다운스트림 응용 프로그램 또한 유리 하단 (즉, 일부 이미징 기법)을 요구할 수 있습니다.</li>
	<li>기계적 분리를 시작 하기 전에 원하는 온도 도달할 수 있도록 4 ° C에 15 mL 튜브에 대 한 냉각 원심 분리기를 설정 합니다.</li>
	<li>수집 회전 하 여 튜브의 하단에 pituitaries 실 온에서 1-2 대 한 탁상 원심 분리기에서 (에서 단계 3.11) 트립 신 억제제 솔루션 튜브 및 모든 pituitaries 전에 튜브의 하단에 위치 해 있는지 확인 신중 하 게 유리 피 펫을 사용 하 여 트립 신 억제제 솔루션의 대부분을 제거 합니다. 참고: 다음의 모든 단계에서 층 류 벤치 (LAF) 프로토콜 셀의 오염을 피하기 위하여 셀 작업에 대 한 인증을 수행 합니다.</li>
	<li>뇌 조직 조각 (단계 2.4에서에서 준비) 얼음 수정된 dPBS의 1 mL을 추가 하 고 부드럽게 불 광택 유리 피 펫 (단계 2.1에서에서 준비)에서 (x 6-7) 위아래로 조직 조각을 빨 아. 참고: 온도 필수적인 측면, 그래서 4 ° c.에 모든 솔루션을 유지 이 시점에서 앞으로, 가능 하면 얼음에 모든 단계를 수행 합니다.</li>
	<li>실 온에서 1-2 대 한 탁상 원심 분리기에서 조직 조각을 아래로 회전 시키십시오 그리고 신중 하 게 얼음에 새로운 15 mL 튜브에 해리 셀 (거의 1 mL)을 포함 하는 dPBS의 위쪽 부분을 전송. 튜브의 바닥으로 피 펫 조직 조각 남아 있습니다 이동 하지 마십시오.</li>
	<li>단계 3.16-3.17 dPBS의 모든 10 mL 사용 될 때까지 한 번에 셀 차가운 dPBS의 1 mL에 해리를 반복 합니다. (추가 하는 dPBS의 마지막 3-4 mL)에 대 한 분리의 중소 열고 스위치를 끝으로 더 작은 개통을 가진 유리 피펫은와 유리 피 펫을 사용 하 여 시작 합니다. 여전히 표시 되는 경우 조직 조각 분리 프로시저의 끝으로 분리, 대 dPBS 2 마지막 단계 쪽으로 약 10 배를 pipetting 증가 하 고 마지막으로 잔여 조직 조각을 남겨두고. 부드럽게 셀 resuspend 그리고 거품의 표면에 셀 연결 셀 손상 발생할 수 있습니다으로 거품을 만들지 마십시오. 참고:이는 이 프로토콜의 중요 한 단계 이며 좋은 결과 달성 하기 위해 몇 가지 훈련이 필요 합니다.</li>
	<li>원심 분리기 (4 ° C에 냉각 된 사전)에 4 ° c.에서 10 분 동안 200 x g 에서 셀 아래로 회전 튜브를 균형 셀 펠 릿 것 튜브의 측면 표시 되었는지 확인 합니다.</li>
	<li>원심 분리기에서 튜브를 조심 스럽게 제거 하 고 부드럽게는 원심 분리 후 직접 유리 피 펫과 상쾌한 빈 15 mL 플라스틱 튜브에 전송. 상쾌한의 대부분을 제거 하지만 작은 (수시로 보이지 않는) 셀 펠 릿 손실 되지 않도록 주의 해야 합니다.</li>
	<li>조심 스럽게 L-15 문화 매체의 50-100 µ L에서 셀 펠 릿 resuspend. 참고:이 단계에서 가능 하다는 셀의 개수 및 생존 능력 테스트 (예: 셀 trypan 블루는 hemocytometer를 사용 하 여 존재 계산), 하지만 주의 세포 현 탁 액의 일부를 사용 하 여이 목적에 대 한 수익률을 낮출 것 이다. 로 셀 접시의 센터 외부 확산의 위험을 증가 시킬 것 이다 큰 서 스 펜 션의 볼륨을 사용 하지 마십시오.</li>
	<li>조심 스럽게 L-15 매체 (준비 단계 3.13에서에서)의 2 개 mL를 포함 하는 셀 문화 접시 중간에 해리 셀 똑. 유리 바닥의 오목 부분 외부 확산 셀 것을 피하기 위해 인큐베이터에 그들을 이동 하기 전에 약 5 분 동안 접시의 바닥에 침 몰에 셀 수 있습니다.</li>
	<li>철저 하 게 침 몰 하 고 접시의 바닥에 연결을 모든 셀 수 있도록 26 ° C와 1% CO2 접시를 품 어.</li>
	<li>30 분 후 그들은 문화 접시에 첨부 되도록 현미경에서 세포를 봐.</li>
	<li>26 ° C와 1% CO2에서 셀을 품 어를 계속 합니다.</li>
	<li>신중 하 게 변경의 대부분 (전부는 아니지만) 보통 3-4 일 마다. 참고: 셀을 방해 하 고 있도록 유리 바닥에서 분리 수 있습니다 매체를 더 자주 변경 하지 마십시오. 실험에 대 한 셀을 사용 하 여 그들을 뿌리기 후 1 주일 이내.</li>
</ol>

<ol>
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U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+involved+in+GnRH2-stimulation+of+identified+LH-producing+gonadotropes+from+lhb-GFP+transgenic+medaka+(Oryzias+latipes).">Signal transduction involved in GnRH2-stimulation of identified LH-producing gonadotropes from lhb-GFP transgenic medaka (Oryzias latipes).</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 372 (1-2), 128-139 (2013).</li><li>Verbalis, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+volume+regulation+in+response+to+changes+in+osmolality.">Brain volume regulation in response to changes in osmolality.</a> Neuroscience. 168 (4), 862-870 (2010).</li></ol>

저자는 선언할 수 없다.

체 외에서 세포 배양 시스템 연구자 올바른 방법1에서 사용 하는 경우 다른 생물학 질문의 과다 한 답변에 대 한 강력한 도구를 제공 합니다. 그것은 그 해리 셀 인접 셀에 그들의 연결을 잃 었 수 있습니다 얻은 다른 기능 속성 보다 그들은 원래 에 비보를 기억 하는 것이 중요. 위험에 생체 외에서 실험에서 얻은 결과 잘못 해석 되 고 피하기 위해, 그것은 고?...

세포 배양 정상적인 세포질 생리학에서 마약 검사 및 발암1에 이르기까지 생물학 질문에 응답 하기 위한 우수한 모델 시스템을 제공 하는 분자 생물학 연구에 사용 되는 주요 도구 중 하나입니다. 1 차 셀, 효소 및 기계적인 방법을 사용 하 여 동물 조직에서 직접 분리는 종종 세포 보다 더 생물학적으로 관련 생물학 응답 vivo에서 상황에 가까이 있을 수 있습니다 간주 됩니다. 1 차 셀 문화를 준비 하기 위한 프로토콜 관심 있는 셀은 적응 하는 특성을 모방 하 고 생리 적으로 의미 있는 결과 얻을 각 종 및 세포 유형에 최적화 되어야 합니다.
물고기 세포에 대 한 기본 문화권 조건을 설명 하는 유사한 프로토콜에 비해 다소 부족 한 반면 수많은 프로토콜 포유류 세포 시스템에 대 한 문화 조건을 설명 합니다. 셀 온도, pH, 그리고 osmolality, 빠른 변화에 취약 하며 분리 절차 중 특히 취약 합니다. 상업적인 소금 솔루션 포유류 세포 배양에 사용 되는 문화 미디어 pH 버퍼 시스템 조건과 osmolality 특히 teleost 생선에 적합 하지 않습니다. 그것은, 그러므로, 측정 솔루션 관심의 종에서 이러한 매개 변수의 순수 관련 레벨을 조정 하는 것이 중요.
일반적인 잉어를 포함 하 여 여러 teleost 물고기 종에서 한 주 하 문화 (Cyprinus 카 르 피 오)2,3, 잔디 잉어 (Ctenopharyngodon idella)4, 금붕어 (auratus 떡 )5, 무지개 송어 (Oncorhynchus mykiss)6, 유럽 뱀장어 (앵귈라 앵귈라)7, 틸 라 피아 (Oreochromis mossambicus)8, zebrafish (Danio rerio)9, 그리고 대서양 대구 (Gadus morhua)10. 관심의 종 부 화 온도 조정 외에도 이러한 프로토콜의 몇 가지가지고 인 큐베이 팅 관심, 습도 분위기에서 7.5 7.2에서 ph의 종 차선 수 있는 포유류-같은 조건에서 셀 포함 하는 3-5% CO2. 또한, 그것은 이러한 기본 세포 배양의 여러 준비에 사용 되는 솔루션의 osmolality 조정 된 경우에 불분명 하 고 다른 솔루션 사이의 안정적인.
현재 프로토콜 대서양 대구10 주 문화 이전 작업에 따라 고을 부 화 온도, osmolality, pH, 그리고 이산화탄소 (pCO2)의 부분 압력을 포함 하 여 pH 버퍼 시스템의 구성 메 다카 (O. latipes)의 생리학. 메 다카는 작은 (3-4 cm) 민물고기 이다, 동쪽 아시아. 이 요즘, 그것 사용 된다 세계의 많은 연구소에서 모델 종으로 그것은 상대적으로 쉽게 번 식 하 고 많은 일반적인 물고기 질병11저항력. 여러 이점이 있다 모델로, 4-40 ° C11, 짧은 생성 시간, 투명 한 태아, 성 결정 유전자12, 그리고 시퀀스 게놈13, 뿐만 아니라에서 많은 온도 허용 오차를 포함 하 여 메 다카를 사용 하 여 다른 사용 가능한 유전 자원입니다.
이 프로토콜의 기본 문화 조건 medakas 물고기 시설에서에 보관 되는 26 ° C의 온도 맞게 최적화 됩니다. 또한,는 osmolality 290 mOsm/kg 담 수에 살고 있는 메 다카를 소금물에 살고 있는 대서양 대구에서 320 mOsm/kg에서 감소 되 고 메 다카 플라즈마14의 정상적인 osmolality은. 비교에서는, 포유류 플라즈마의 전형적인 osmolality 275-295 mOsm15의 범위입니다. 다양 한 온도에서 살고 물고기 고 물고기 포유류에서 다른 혈액과 세포 외 액의 pH와 버퍼 용량을 만드는 물과 직접 접촉에 있는 아가미. 포유류 문화 미디어는 pH 약 7.4의 미디어는 37 ° c.에 습도 공기에 5% CO2 의 표준 분위기 equilibrated 때 발생 하는 버퍼 시스템에 일반적으로 포함 됩니다. PH는 온도 의존 및 감소 온도16(물)에 중립 pH 증가 대 한 값입니다. 전형적인 teleost 물고기 플라스마 pH 7.9177.7에서 배열 한다. 이 프로토콜의 최적화는 pH 7.85 pH 7.75 메 다카는 CO2 0.5%에서 1%로 증가 하 여 26 ° C에서 보관에 12 ° C에서 보관 하는 대구에서에서 감소를 포함.
또한, 중 탄산염 버퍼 용량 물고기와 포유류에서 매우 다르다. CO2 물고기에서 아가미를 통해 쉽게 교환 이며 물에 pCO2 폐18에서 pCO2 의 극히 일부에. 온도 또는 pCO2 변경 하는 것은 pH와 매체의 버퍼 변경 됩니다. 따라서, pH도 포유류 세포 배양에 대 한 권장 pCO2 물고기 셀에 최적 이며 따라서, 문화 미디어는 물고기에 대 한 순수 관련 값을 포함 하는 버퍼 시스템으로 최적화 되어야 합니다 그리고 특정 관심의 종입니다. 이 프로토콜 메 다카 pituitaries에서 1 차 셀 문화를 준비 하 고 조정 부 화 온도, osmolality, pH, 그리고 pH 버퍼 시스템의 1 차 셀을 준비할 때 고려해 야 할 다른 중요 한 매개 변수 외에 포함 하는 방법을 설명 합니다. 문화 비 포유류 종에서.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline (dPBS), without calcium chloride and magnesium chloride</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>D8537</td><td>Adjust solution to pH 7.75 with 1M NaOH and 290 mOsm with mannitol.</td></tr><tr><td>L-15 medium (Leibovitz), witout L-glutamine</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>L5520</td><td>Supplement 500 ml culture medium with 10 mM NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 4.5 mM glucose, 2 mM Glutamax. Adjust solution to 290 mOsm with mannitol and filter solution through a 0.2 &amp;micro;m PES sterile filter, before adding 2.5 mL Penicillin-Streptomycin solution (see below for details).</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>S5881</td><td>Add drops of 1 M solution to increase pH of dPBS and culture medium to 7.75.</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>S5761</td><td>10 mM NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; equals 420 mg per 500 mL culture medium.</td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>63565</td><td>Use to increase osmolality of dPBS and culture medium. Calculate correct amount needed to reach an osmolality of 290 mOsm.</td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>G5400</td><td>4.5 mM&amp;nbsp; D-glucose equals 405 mg per 500 mL culture medium.</td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco (Life Technologies, Paisley, UK)</td><td>35050-061</td><td>Alternative to L-glutamine, with increased stability. 2 mM Glutamax equals 5 ml of 100x stock in 500 mL culture medium.</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>P0781</td><td>Stock solution 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL. Use 2.5 mL of stock solution in 500 mL L-15 medium (equivalent of 50 U/mL Penicillin and 50 &amp;micro;g/mL Streptomycin).</td></tr><tr><td>Trypsin type II-S</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>T7409</td><td>Prepare 1 mg/mL in dPBS solution.</td></tr><tr><td>Trypsin inhibitor type I-S</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>T6522</td><td>Prepare 1 mg/mL in dPBS solution, supplement with 2 &amp;micro;g/ml Dnase I (see details below).</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>D5025</td><td>Use in trypsin inhibitor solution (see above).</td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m Polyethersulfone (PES) sterile filter system</td><td>Corning Inc. (Corning, NY)</td><td>431097</td><td>Use for sterile filtration of dPBS and L-15 medium after adjustments.</td></tr><tr><td>35 mm cell culture dish with glass bottom, poly d-lysine coated</td><td>MatTek Corporation (Ashland, MA)</td><td>P35GC-1.5-10-C</td><td>Can also be replaced by plastic dish, depending on downstream application.</td></tr><tr><td>Dumont #5 fine forceps</td><td>Fine Science Tools (CA)</td><td>11254-20</td><td>Straight tip</td></tr><tr><td>Dumont #5/45 fine forceps</td><td>Fine Science Tools (CA)</td><td>11253-25</td><td>Angled 45&amp;deg; tip</td></tr><tr><td>Stereo microscope SZ61</td><td>Olympus Corp. (Tokyo, Japan)</td><td></td><td>Use for dissection of pituitaries.</td></tr><tr><td>Alegra X-22R Centrufuge</td><td>Beckman Coulter Inc. (Brea, CA)</td><td></td><td>With cooling option (similar to current model XR-30).</td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Techne (Staffordshire, UK)</td><td></td><td>Any water bath with the possibility of adjusting temperature will do.</td></tr><tr><td>Pasteur glass pipettes</td><td>VWR (NY)</td><td>612-1701</td><td>Outer diameter 1.6 mm, fire polish and autoclave before use.</td></tr><tr><td>Galaxy MiniStar table centrifuge</td><td>VWR (NY)</td><td>521-2844</td><td>Any small table centrigue will do.</td></tr><tr><td>Fine needles/insect pins</td><td>Fine Science Tools (CA)</td><td>26001-40</td><td>Diameter 0.03 mm. Other fine needles can be used instead.</td></tr><tr><td>Wax plate</td><td></td><td></td><td>Custom made by adding melted paraffin wax in large petri dish.</td></tr></tbody></table>

preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries

1 차 세포 배양 세포 속성 및 제어 된 환경에서 격리 된 셀의 메커니즘 연구 과학자 들에 의해 일반적으로 사용 되는 강력한 도구입니다. 포유류와 물고기 사이 생리에 광대 한 차이도 불구 하 고 물고기에서 기본 세포 문화 프로토콜 종종 기반으로 포유류 문화 조건, 자주만 약간 수정 합니다. 환경 차이는 체온 뿐만 아니라 혈 매개 osmolality, pH, 그리고 pH 버퍼 용량에 영향을. 셀 문화 미디어와 유사한 작업 솔루션 extracellular 액체 또는 혈액 혈 청에는 셀이 적응의 특성을 모방 의미는, 그것은 중요 이러한 매개 변수에 동물을 특별히 조정 됩니다.
현재 프로토콜 메 다카 (Oryzias latipes)에 대 한 최적화 된 기본 문화 조건을 설명합니다. 프로토콜과 격리 하 고 건강 한 유지 하는 방법에 자세한 내용은 1 주일 이상에 대 한 뇌 세포를 해리 하 여 제공 하는 다음 단계가 포함 됩니다: 1. 값 osmolality 조정 메 다카 혈액 플라스마, 2에서에서 발견.의 조정에 부 화 온도 정상 메 다카 온도를 (여기 수족관 시설에서), 3. 비슷한 온도에서 사는 다른 어 종에 비해 값을 pH와 중 탄산염 버퍼의 조정. 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 결과 메 다카에 대 한 생리 적으로 의미 있는 결과 홍보 하 고 다른 비 포유류 종에서 1 차 셀 문화를 만드는 과학자 참조 가이드로 사용할 수 있습니다.

이 프로토콜 메 다카 pituitaries에서 기본 세포 배양의 준비를 설명 하 고 최소한 1 주일에 대 한 문화에서 유지 될 수 있는 건강 한 세포를 제공 한다. 프로토콜 메 다카14 생리 관련 값을 기반으로 하며 또한 성인 물고기는 도금을 수확 하는 조직에서 전체 절차 동안 7.75의 pH 및 290 mOsm/kg의 osmolality를 사용 하 여 뇌 조직에 최적화 된 (그림 1</st...

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Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries

여기 우리가 준비 하 고 유지 하는 메 다카 (Oryzias latipes)에서 기본 뇌 세포 배양 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜에 최적화 된 조건을 고려 온도, osmolality, pH 등의 중요 한 매개 변수 흉내 낸 함으로써 생리 적으로 더 의미 있는 결과 물고기의 생리 적 조건에 의해.

물고기 Pituitaries에서 높은-품질 기본 세포 배양의 준비

Primary cell culture is a powerful tool commonly used by scientists to study cellular properties and mechanisms of isolated cells in a controlled ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.1K 조회수.  Norwegian University of Life Sciences. 여기 우리가 준비 하 고 유지 하는 메 다카 (Oryzias latipes)에서 기본 뇌 세포 배양 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜에 최적화 된 조건을 고려 온도, osmolality, pH 등의 중요 한 매개 변수 흉내 낸 함으로써 생리 적으로 더 의미 있는 결과 물고기의 생리 적 조건에 의해.

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Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in an intact and developing vertebrate. However, the detailed imaging of the morphologies of distinct cell types and subcellular structures is limited in whole mounts. Therefore, we established an efficient and easy-to-use protocol to culture live primary cells from zebrafish embryos and adult tissue.
In brief, 2 dpf zebrafish embryos are dechorionated, deyolked, sterilized, and dissociated to single cells with collagenase. After a filtration step, primary cells are plated onto glass bottom dishes and cultivated for several days. Fresh cultures, as much as long term differenciated ones, can be used for high resolution confocal imaging studies. The culture contains different cell types, with striated myocytes and neurons being prominent on poly-L-lysine coating. To specifically label subcellular structures by fluorescent marker proteins, we also established an electroporation protocol which allows the transfection of plasmid DNA into different cell types, including neurons. Thus, in the presence of operator defined stimuli, complex cell behavior, and intracellular dynamics of primary zebrafish cells can be assessed with high spatial and temporal resolution. In addition, by using adult zebrafish brain, we demonstrate that the described dissociation technique, as well as the basic culturing conditions, also work for adult zebrafish tissue.

We present an efficient and easy-to-use protocol for preparing primary cell cultures of zebrafish embryos for transfection and live cell imaging as well as a protocol to prepare primary cells from adult zebrafish brain.

문화와 Zebrafish 기본 세포의 Transfection

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

연구

발생학

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

에서 기본 셀 문화 Drosophila Gastrula의 태아

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

생물학

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

인간의 뇌하수체 선종 세포의 3 차원 알긴산 비드 문화

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

의학

Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish

Electrophysiological investigations of pituitary cells have been conducted in numerous vertebrate species, but very few in teleost fish. Among these, the clear majority have been performed on dissociated primary cells. To improve our understanding of how teleost pituitary cells, behave in a more biologically relevant environment, this protocol shows how to prepare viable brain-pituitary slices using the small freshwater fish medaka (Oryzias latipes). Making the brain-pituitary slices, pH and osmolality of all solutions were adjusted to values found in body fluids of freshwater fish living at 25 to 28 &#176;C. Following slice preparation, the protocol demonstrates how to conduct electrophysiological recordings using the perforated whole-cell patch-clamp technique. The patch-clamp technique is a powerful tool with unprecedented temporal resolution and sensitivity, allowing investigation of electrical properties from intact whole cells down to single ion channels. Perforated patch is unique in that it keeps the intracellular environment intact preventing regulatory elements in the cytosol from being diluted by the patch pipette electrode solution. In contrast, when performing traditional whole-cell recordings, it was observed that medaka pituitary cells quickly lose their ability to fire action potentials. Among the various perforation techniques available, this protocol demonstrates how to achieve perforation of the patched membrane using the fungicide Amphotericin B.

The article describes an optimized protocol for making viable brain-pituitary tissue slices, using the teleost fish medaka (Oryzias latipes), followed by electrophysiological recordings of pituitary cells using the patch-clamp technique with the perforated patch configuration.

건강 한 뇌-뇌 하 수 체 조각 Teleost 물고기에 뇌 세포의 Electrophysiological 조사에 대 한

Electrophysiological investigations of pituitary cells have been conducted in numerous vertebrate species, but very few in teleost fish. Among these, the ...

신경과학

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can be cultured in defined media for 16 days in vitro and are amenable to any analyses typically performed on dissociated cultures, including electrophysiological, morphological and survival analyses. The major advantage of these cultures is that specific cell types can be selectively studied in the absence of complex external influences, such as those arising from glial cells or other neuron types. When planning experiments with purified cells, however, it is important to note that neurons strongly depend on glia-conditioned media for their growth and survival. In addition, glutamatergic neurons further depend on glia-secreted factors for the establishment of synaptic transmission. We therefore also describe a method for co-culturing neurons and glial cells in a non-contact arrangement. Using these methods, we have identified major differences between the development of GABAergic and glutamatergic neuronal networks. Thus, studying cultures of purified neurons has great potential for furthering our understanding of how the nervous system develops and functions. Moreover, purified cultures may be useful for investigating the direct action of pharmacological agents, growth factors or for exploring the consequences of genetic manipulations on specific cell types. As more and more transgenic animals become available, labeling additional specific cell types of interest, we expect that the protocols described here will grow in their applicability and potential.

This protocol describes a cell sorting based method for the purification and culture of fluorescent GABAergic or glutamatergic neurons from the neocortex and hippocampus of postnatal mice or rats.

형광 활성 세포 선별을 통해 확립 된 정제 GABAergic 또는 Glutamatergic 뉴런의 일차 세포 배양

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem cells of skeletal muscle, the myogenic precursor cells (MPCs), have proven indispensible to our understanding of mammalian skeletal muscle development and growth. Particularly among the basal taxa of Vertebrata, however, data are limited describing the molecular mechanisms controlling the self-renewal, proliferation, and differentiation of MPCs. Of particular interest are potential mechanisms that underlie the ability of basal vertebrates to undergo considerable postlarval skeletal myofiber hyperplasia (i.e.&#160;teleost fish) and full regeneration following appendage loss (i.e.&#160;urodele amphibians). Additionally, the use of cultured myoblasts could aid in the understanding of regeneration and the recapitulation of the myogenic program and the differences between them. To this end, we describe in detail a robust and efficient protocol (and variations therein) for isolating and maintaining MPCs and their progeny, myoblasts and immature myotubes, in cell culture as a platform for understanding the evolution of the myogenic program, beginning with the more basal vertebrates. Capitalizing on the model organism status of the zebrafish (Danio rerio), we report on the application of this protocol to small fishes of the cyprinid clade Danioninae. In tandem, this protocol can be utilized to realize a broader comparative approach by isolating MPCs from the Mexican axolotl (Ambystomamexicanum) and even laboratory rodents. This protocol is now widely used in studying myogenesis in several fish species, including rainbow trout, salmon, and sea bream1-4.

In vitro culture systems have proven indispensible to our understanding of vertebrate myogenesis. However, much remains to be learned about nonmammalian skeletal muscle development and growth, particularly in basal taxa. An efficient and robust protocol for isolating the adult stem cells of this tissue, the myogenic precursor cells (MPCs), and maintaining their self-renewal, proliferation, and differentiation in a primary culture setting allows for the identification of conserved and divergent regulatory mechanisms throughout the vertebrate lineages.

기초 척추 계통의 주요 근원 성 전구 세포 / 근원 세포 배양의 준비

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In the granule cell precursor (GCP), the primary cilium acts as a pivotal signaling center that orchestrates precursor cell proliferation by modulating the Hh signaling pathway. The investigation of primary cilium-dependent Hh signaling machinery is facilitated by in vitro genetic manipulation of the pathway components to visualize their dynamic localization to the primary cilium. However, transfection of transgenes in the primary cultures of GCPs using the currently known electroporation methods is generally costly and often results in low cell viability and undesirable transfection efficiency. This paper introduces an efficient, cost-effective, and simple electroporation protocol that demonstrates a high transfection efficiency of ~80-90% and optimal cell viability. This is a simple, reproducible, and efficient genetic modification method that is applicable to the study of the primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathway in primary GCP cultures.

Here, we present a reproducible in vitro electroporation protocol for genetic manipulation of primary cerebellar granule cell precursors (GCPs) that is cost-effective, efficient, and viable. Moreover, this protocol also demonstrates a straightforward method for the molecular study of primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathways in primary GCP cells.

과립 세포 전구체에서 1 차적인 실륨 의존적 신호 경로를 연구하는 효율적이고 비용 효율적인 전기 포기법

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. Multiple functions, including phagocytosis, nutrient/metabolite transportation, vitamin A metabolism, etc., are conducted by the RPE on a daily basis. RPE cells are terminally differentiated epithelial cells with little or no regenerative capacity. Loss of RPE cells results in multiple eye diseases leading to visual impairment, such as age-related macular degeneration. Therefore, the establishment of an in vitro culture model of primary RPE cells, which more closely resembles the RPE in vivo than cell lines, is critical for the characteristic and mechanistic studies of RPE cells. Considering the fact that the source of human eyeballs is limited, we create a protocol to culture primary porcine RPE cells. By using this protocol, RPE cells can be easily dissociated from adult porcine eyeballs. Subsequently, these dissociated cells attach to culture dishes/inserts, proliferate to form a confluent monolayer, and quickly re-establish key features of epithelial tissue in vivo within 2 wks. By qRT-PCR, it is demonstrated that primary porcine RPE cells express multiple signature genes at comparable levels with native RPE tissue, while the expressions of most of these genes are lost/highly reduced in human RPE-like cells, ARPE-19. Moreover, the immunofluorescence staining shows the distribution of tight junction, tissue polarity, and cytoskeleton proteins, as well as the presence of RPE65, an isomerase critical for vitamin A metabolism, in cultured primary cells. Altogether, we have developed an easy-to-follow approach to culture primary porcine RPE cells with high purity and native RPE features, which could serve as a good model to understand RPE physiology, study cell toxicities, and facilitate drug screenings.

Here, an easy-to-follow method to culture primary porcine retinal pigment epithelial cells in vitro is presented.

돼지 망막 색소 상피 세포의 1 차 배양

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The preparation of high-quality single-cell suspensions is essential for single-cell level studies such as single-cell RNA or genome sequencing. However, there is no ready-to-use protocol for aquaculture fish species, particularly for the intestine of tilapia. The effective dissociation enzymes vary depending on the tissue type. Therefore, optimizing the tissue dissociation protocol by selecting the appropriate enzyme or enzyme combination to obtain enough viable cells with minimum damage is essential. This study illustrates an optimized protocol to prepare a high-quality single-cell suspension from Nile tilapia intestine with an enzyme combination of collagenase/dispase. This combination is highly effective for dissociation with the utilization of bovine serum albumin and DNase to reduce cell aggregation after digestion. The cell output satisfies the requirements for single-cell sequencing, with 90% cell viability and a high cell concentration. This protocol can also be modified to prepare a single-cell suspension from the intestines of other fish species. This research provides an efficient reference protocol and reduces the need for additional trials in the preparation of single-cell suspensions for aquaculture fish species.

Here, we demonstrate the preparation of a high-quality single-cell suspension of tilapia intestine for single-cell sequencing.

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The ...

Generation of Primary Retinal Ganglion Cell Cultures From Zebrafish Embryos

Source: Terzi, A., et al., <a href="https://app.jove.com/v/62165">ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development.</a> J. Vis. Exp. (2021)
The video demonstrates a method for culturing primary retinal ganglion cells from zebrafish embryos. Early-stage embryos undergo dissection to isolate the eyes, which are subsequently mechanically dissociated into a suspension of retinal ganglion cells. This cell suspension is cultured on coverslips coated with adhesive proteins to facilitate axon development.

제브라피시 배아(zebrafish embryos)에서 일차 망막 신경절 세포 배양 생성

1. Preparation of solutions

	E2 media (1x)
	
		Prepare 100x E2A (500 mL), 500x E2B (100 mL) and 500x E2C (100 mL) solutions by combining all components ...