이 프로토콜을 통해 누구나 저렴하고 견고한 오픈 소스 기기인 smfBox를 사용하여 생체 분자 내에서 정확한 절대 거리를 측정하기 위해 단일 분자 FRET 실험을 수행할 수 있습니다. smFRET는 당신이 그들이 채택하는 다른 적합성을 특성화 할 수 있도록, 오히려 분자의 평균 수십억보다 한 번에 하나의 분자를 볼 수 있습니다. 이 방법의 아름다움은 많은 생물 분자 시스템의 구조와 역학에 빛을 비추는 데 사용할 수 있다는 것입니다.
예를 들면, 단백질 접기, 단백질 DNA 상호 작용 및 DNA 알로스터리. 분석을 시작하기 전에 레이저 제어 센터를 실행하고 연속 파교대 상전류 모드가 선택되어 있는지 확인합니다. 레이저 의 두 전원.
smOTTER 획득 소프트웨어를 실행하고 각 계측기가 올바르게 구성되어 있는지 확인합니다. 배출 경로를 맞추기 위해, 목표에 침지 오일 한 방울을 배치하고 조심스럽게 객관적인 렌즈에 깨끗한 커버 유리를 배치, 커버 유리와 목표 사이의 기포를 트래핑 방지 하기 위해 오일에 각도로 낮추는. 그런 다음 100 나노 몰러 Cy3B 염료10 마이크로 리터를 커버 유리의 중앙에 추가합니다.
레이저 듀티 사이클 패널에서 기증자 레이저를 0꺼리, 45 켜기 및 55 끄기로 설정합니다. 수락기 레이저를 50꺼오프, 45켜기 및 5꺼기로 설정합니다. 교대 레이저 여기 또는 ALEX 기간을 100 마이크로초로 설정합니다.
Z 포커스 탭을 엽니다. 획득 패널에서 레이저를 전환하여 카메라를 라이브로 시작하고 시작합니다. 밝은 반점이 중앙에 검은 색 배경으로 둘러싸여 표시되도록 노출을 조정합니다.
낮은 Z 위치에서 시작하여 밝은 반점이 최소한의 크기에 도달할 때까지 높이를 늘립니다. 그런 다음 높이를 20 마이크로미터로 올려 오일 및 커버 유리 위의 샘플에 레이저를 집중시합니다. 샘플이 초점에 도달하면 카메라를 중지합니다.
omicron 제어 센터에서는 두 검출기의 판독이 관찰될 때까지 smOTTER의 정렬 탭에서 y축 스케일을 모니터링하면서 녹색 레이저 전력을 낮추어 필요에 따라 스케일을 변경합니다. 그런 다음 SmfBox 전면에 있는 네 개의 나사를 풀고 전면 패널을 제거합니다. 핀홀을 정렬하려면 정렬 탭의 신호를 보면서 핀홀 포지셔너의 X 노브를 돌려 녹색과 빨간색으로 신호를 늘립니다.
Y 노브를 돌려 핀홀을 다른 방향으로 정렬한 다음 X 노브로 돌아가 신호가 더 이상 증가하는지 확인합니다. 핀홀 렌즈를 정렬하려면 렌즈 X 노브를 한 방향으로 돌려 신호를 감소한 다음 핀홀 X 노브를 같은 방향으로 돌려 신호를 원래 수준으로 되돌립니다. 새 최대 신호가 이전보다 높으면 핀홀과 렌즈 노브를 그 방향으로 반복적으로 이동합니다.
신호가 이전보다 낮은 경우 노브를 반대 방향으로 반복적으로 이동한 다음 핀홀과 렌즈 Y 노브를 사용하여 정렬을 반복합니다. 눈사태 포토다이오드 렌즈의 정렬을 위해 녹색 눈사태 포토다이오드로 시작하여 녹색 신호가 최대일 때까지 X 노브를 이동합니다. Y 노브에 대한 신호 수정을 반복합니다.
X 노브로 돌아가 신호를 내리기 시작하는 임계값을 앞뒤로 이동합니다. 이 두 점 사이의 중간에 신호를 둡니다. Y 노브의 중간 위치를 찾아 빨간색 눈사태 포토다이오드의 정렬을 반복합니다.
첫 번째 샘플을 분석하기 전에 메탄올에 젖은 렌즈 세정 조직으로 무대를 청소하고 한쪽 끝에서 다른 쪽 끝까지 부드럽게 닦아 내고 목표의 중앙에 3~4방울의 침지 오일을 바르십시오. 10종의 마이크로리터를 깨끗한 커버 글래스 중앙에 추가하고 물 흔적을 모니터링하여 형광 신호가 관찰되지 않는지 확인합니다. 그런 다음 고무 형 핀셋을 사용하여 커버 유리를 조심스럽게 제거하고 필요한 경우 침지 오일을 보충하십시오.
단일 분자 데이터가 얻어지도록 하기 위해, 샘플을 희석한 후, 라이브 추적 패널에서 초당 1~5회 버스트가 관찰되는 농도를 선택한다. 적절한 농도가 결정되면, 새로운 커버 글래스의 중앙에 8~9mm 직경의 실리콘 이졸거를 누르고 조심스럽게 10 마이크로리터의 시료를 중앙에 추가하여 실리콘과의 접촉을 피하십시오. 두 번째 커버 글래스를 씰이 형성될 때까지 개졸라기에 단단히 놓습니다.
샘플이 예상대로 작동하는지 여부를 관찰하기 위해 FRET 효율 히스토그램 대 라이브 스토이치오메트리를 확인하십시오. 저장 설정 패널에서 샘플 이름 및 세부 정보, 기증자 및 수락자 라벨, 버퍼, 기증자 및 수락자 여기 파장, 검출 파장 및 레이저 파워, 최종 사용자 및 사용자 소속에 대한 정보를 입력합니다. 획득 패널에서 실험 길이를 몇 분 만에 입력하고 적절한 저장 간격을 선택하여 오류 발생 시 잠재적인 데이터 손실을 완화합니다.
필요한 경우 레이저 전원 저장을 선택한 다음 시작하여 데이터 수집을 시작합니다. 긍정적인 결과, 초당 5~1회 버스트가 얻어진다. 부정적인 결과에서 동일한 기간 내에 너무 많거나 너무 적은 버스트가 관찰됩니다.
수집 및 분석에 따라 교대 플롯은 실험 설정의 ALEX 기간과 일치해야 합니다. 시간 추적은 샘플 농도가 합리적이라는 것을 질적으로 평가하는 데 사용됩니다. 배경 플롯은 배경 속도를 추정하기 위해 더 긴 시간에 선형 에 맞는 광자 간 지연 기간의 분포를 보여줍니다.
배경 추적을 사용하여 실험 기간 동안 샘플에 변경 사항이 있었는지 확인할 수 있습니다. 프렛 효율 히스토그램 대 스토이치오메트리가 생성되어 모든 종과 이중 으로 표시된 종을 선택합니다. 1D FRET 효율 히스토그램은 데이터의 가우시안 피팅으로 생성됩니다.
그래서 여기에 샘플의 농도가 중요합니다. 너무 높으면 단일 분자 실험을 더 이상 수행하지 않는 반면 너무 낮으면 데이터를 얻는 데 너무 오래 걸릴 것입니다. 그것은 NMR 또는 결정학 같이 그밖 방법에 의해 결정될 수 없었던 동적 생체 분자의 구조물의 측정을 가능하게 했습니다.
