이 작품은 NIH 그랜트 1R21AG031965 - 01A1에 의해 지원되었다. MK는 노화에 엘리슨 의료 재단 신규 장학생입니다.

1 부 : 노화 문화의 작성 <ol><li> YEPD 한천 플레이트에 냉동 주식 (1 % 효모 추출물, 2% bacto - 펩톤, 2 %의 한천, 2 % 포도당)에서 관심 스트 리크 변종. </li><li> 30 ˚ C 48 시간 단일 식민지가 나타날 때까지 전지를 품어. </li><li> 테스트 튜브에 YEPD 액체 매체 5 ML (1 % 효모 추출물, 2% bacto - 펩톤, 2 % 포도당)로 하나의 식민지와 예방을 선택하십시오. </li><li> 30 밤새 문화 ˚ C 쉐이크 또는 롤러 드럼을 사용하여 지속적인 교반을 유지하면서. 그로 </li><li> 숙박 문화의 50 μL와 합성 전체 (SC) 중간 5 ML (표 1)을 예방. 일반적으로 세 SC 문화는 검사되는 각 변형에 대한 수명 분석 세중의 생물 학적 복제를 제공하기 위해 각 변형에 대한 준비가되어 있습니다. </li><li> 30 문화를 유지 ˚ C 전체 실험 (일반적으로 2 개 이상 주) 대한 롤러 드럼에 대한 끊임없는 동요와 함께. </li></ol> 2 부 : 생존 연령 지점을 촬영 SC 미디어 문화의 두 일 후에, 세포는 정지 단계에서해야하고 나이 지점 첫 촬영 준비가 된 것입니다. 이후 나이 지점은 두 개의 주 최소 2-3 일마다 이동해야합니다. 각 연령 포인트 : <ol><li> YEPD 145 μL와 각각 잘 작성하여 접종에 대한 Bioscreen 100 잘 허니콤 접시를 준비합니다. 전용 데이터 분석에 대한 세포 나중에 YEPD과 잘 채워진 적어도 하나를 남겨주십시오. </li><li> 인큐베이터에서 노화 문화를 제거합니다. </li><li> 간단히 와동 문화 중 하나를 누설하지 않도록주의하면서, 허니콤 접시에 주사하는 최초의 문화. </li><li> 혼합 문화의 5 μL를 제거하고 허니콤 판의 첫 ​​우물에 그것을 피펫. 이전과 5 μL 나누어지는을 제거한 후 각 시험관의 입으 불꽃. </li><li> 각 문화에 해당하는 위치를 잘 참고해야되는 각 고령화 문화에 대해이 절차를 반복합니다. 동일한 물론 순위는 전체 실험에​​ 걸쳐 연령 이후의 각 지점에 대해 사용해야합니다. </li><li> 예방 접종이 완료되면 30 ˚ C 배양기에 문화를 교체합니다. </li></ol> 파트 3 : Bioscreen C MBR 시스템을 로딩 <ol><li> 뚜껑을 리프팅하여 보육의 구획을 노출하고 샘플 트레이 덮개를 제거합니다. </li><li> 샘플 트레이 (하나만 번호판을 읽을 경우 왼쪽 슬롯 사용)에 새로 주사 허니콤 플레이트를 삽입합니다. </li><li> 샘플 트레이 덮개를 교체하고 보육 구획에 뚜껑을 낮추십시오. </li><li> 열전달 유체가 최소 입력 레벨 이상 있는지 확인하십시오. 낮은 경우, 제공되는 열전달 유체로 1000 μL 피펫을 사용하여 더 추가합니다. </li><li> Bioscreen 소프트웨어 &quot;EZExperiment&quot;를 사용하여, Saccharomyces cerevisiae의에 적합한 성장 곡선을 얻으려면 다음 매개 변수를 설정합니다 : <ul><li> 샘플 개수 : 미디어 또는 200 우물의 숫자를 입력 </li><li> 필터 : 420 - 580nm, 광대역 </li><li> 온도 : 30 ˚ C </li><li> 실험 기간 : 1 일, 0 시간, 0초 </li><li> 측정 간격 : 30 분 </li><li> 떨고 : 연속 떨고에, 하이 </li></ul></li><li> 수치를 시작하려면 &quot;시작&quot;을 클릭하십시오. </li></ol> 4 부 : 데이터 분석 일반적으로, 여섯 나이에 포인트는 두 주 과정을 점령하고 있습니다. 나이 포인트는 일 2, 4, 6, 9, 11, 13에서 찍은 있습니다. 실험 설계 및 테스트중인 종자에 따라서는 나이 점을 더 많거나 적은 자주 또는 2 주 이상 오래 걸릴하는 것이 바람직하다 수 있습니다. 이것은 데이터 분석 훨씬 쉽게되므로 각 노화 문화, 모든 연령 시점에서 같은 잘 위치에 해당하는 그러한 모든 연령 포인트에 대해 같은 순서로 허니콤 판재를로드하는 것이 중요합니다. <ol><li> Bioscreen C MBR 시스템의 출력 파일을 구합니다. 소프트웨어 &quot;EZExperiment는&quot;마이크로 소프트 엑셀뿐만 아니라 다른 소프트웨어와 호환되는 탭으로 구분된 파일로 Bioscreen 데이터를 출력합니다. 첫 번째 열에는 프로그램은 어떤 시간에 OD 측정은 Bioscreen 허니콤 플레이트 (그림 1) 각 잘 나타내는 이후 열, 실험 기간 동안 찍은. </li><li> 모든 칼럼에서 첫 번째 OD 읽기를 삭제합니다. 이 독서는 &quot;노이즈&quot;입니다. </li><li> 각 열에있는 모든 OD 값에서 혼자 YEPD와 우물의 OD 값을 빼서하여 데이터를 정상화. 이것은 미디어에 의해 배경 흡광도를 제거합니다. </li><li> 가지의 곡선을 플롯. 곡선은 나이의 기능 (그림 2)로 이동합니다. 예를 들어, 여섯 시간 동안 열 포인트 1 (허니콤 판 잘 1)에서 가지 곡선을하려하여 시간이 지남에 따라 곡선의 독특한 rightward 변화가 있습니다. </li><li> 각 잘 2 일 나이 지점의 성장 반응 속도론에 기반 복제 시간 (δ)을 계산. 공식 복제 시간을 계산하는 데 사용 IS : <img src="/files/ftp_upload/1156/equat.png" alt="방정식" /> OD 1 OD 2 연속 OD 측정 및 t 1과 t 2 측정 사이의 시간을 대표하는 곳. 0.5-0.2의 OD 값 사이의 시간만을 배로 계산합니다. 이러한 가치의 평균은 잘 대해 배로 시간입니다. 0.5-0.2의 OD 값 사이의 시간만을 배로 계산합니다. 이러한 가치의 평균은 잘 대해 배로 시간입니다. 대부분의 야생 형 효모 계통 85~90분 사이의 복제 시간 값을 제공해야합니다. </li><li> 각 연령 포인트 (2 일) 연령 지점 초기에 상대적으로 가지 곡선의 시간 변화 (Δt) 계산합니다. 이 작업을 수행하는 쉬운 방법은 연령 지점 초기 시대 이후의 각 점 사이에 0.3의 OD에 도달 각에 대해 잘했습니다 시간의 길이의 차이를 결정하는 것입니다. 특정 잘 0.3의 OD에 도달하는 시간은 두 시간 포인트 bracketing OD = 0.3 사이의 시간의 함수로 아까에 해당하는 선형 회귀 방정식 (OD)에서 계산하실 수 있습니다. </li><li> 생존 곡선 (그림 3)를 생성하기 위해서는 각 연령 시점에서 살아남은 소수를 계산합니다. 100 % 생존하는 최초의 세 점 (2 일)을 정의합니다. 세 점 각각의 연속에 대한 방정식을 사용하여 %의 생존을 계산 : <img src="/files/ftp_upload/1156/equat2.png" alt="둘째 등식" width="245" height="115" /> S n은 생존 비율이고, Δt n은 시간 근무이며, δ n은 복제 시간입니다. </li><li> 시대의 함수로 가능한 세포의 분율 (또는 퍼센트)하려하여 생존 곡선 (그림 3B)로 각각 잘 (또는 복제 웰스)을 원하는를 생성합니다. </li><li> 각 잘 대해 생존을 통합 (SI)를 계산합니다. SI는 생존 곡선 아래의 면적으로 정의되며 수식으로 추정 수 있습니다 : <img src="/files/ftp_upload/1156/equat3.png" alt="방정식 3" width="400" height="79" /> 어디 연령 n은 세 점 (예 : 2, 4, 6, 9, 11, 13)이며 S N 그 연령 시점에서 생존의 가치입니다. </li><li> SI 및 생존 데이터 복제 웰스의 통계적 매개 변수를 확인합니다. 관심 일반 통계 매개 변수는 말은, 중간, 그리고 복제 생물의 각 집합에 대한 편차를 포함합니다. T - 테스트 또는 유사한 분석은 다른 실험 및 제어 그룹에 대한 SI의 pairwise 비교에 사용될 수 있습니다. 그것은 또한 생물학은 복제 평균에서 4.8에 설명되어있는 생존 곡선을 생성하는 것이 바람직하다 수 있습니다. </li></ol> 제 5 부 : 대표 결과 실험의 완료에, 당신은 여러 가지 변종이나 조건에 대한 연대기 노화 가능성을 결정하기 위해 충분한 생존 곡선 및 수행 데이터 분석을 해본 것입니다. 제대로 수행한 경우, Bioscreen C MBR 시스템에서 얻은 성장 곡선은 그림 2에 표시된 것과 비슷하게해야하고 그 결과 생존 곡선은 그림 3과 같이 사람과 유사합니다. 일반적으로, 여기에서 설명한 조건 교양 야생 형 전지 7 일의 순서에 중간 연대기의 수명을해야합니다. 생존에 상당한 변화가 다른 변종과 같은 0.05 % 포도당 미디어의 성장과 같은 몇 가지 조건 하에서 관찰이며, 평균 생존은 30 일 초과할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig1.png" alt="" /> Bioscreen 프로그램 &quot;EZExperiment&quot;에서 그림 1. 데이터 출력. 열 A는 흡광도 읽기가 찍은되는 시간을 표시합니다. 연속 열은 노화 문화에서 가져온 세포와 주사 허니콤 접시의 우물을 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig2.png" alt="" /> 그림 2. 실험 과정을 통해 하나의 생물 학적 복제에서 가지 곡선. 노화 문화에 세포가 생존을 잃게으로 시간이 지남에 따라 곡선에 뚜렷한 변화가 있습니다. 초기 시점 (2 일)와 연속 시점 사이의 시간은 특정 나이에 생존을 결정합니다. <img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig3a.png" alt="" /><img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig3b.png" alt="" /> 그림 3. A) 그림 1에서 가지 데이터를 사용하여 생성 생존 곡선. 2 일 시점은 100 % 생존 지점으로 설정됩니다. B) 2 계통의 최종 생존 곡선이 같은 실험에서 테스트. 이러한 생존 곡선은 생물 각 변형에 대한 복제 세 평균 viabilities을 나타냅니다. 오류 막대는 생물은 복제 시간 표준 편차를 나타냅니다. 생존 곡선 아래에있는 회색 영역은 스트레인 1 생존 통합 (SI)를 나타냅니다. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> 표 1. 연대순 노화 연구에 사용 합성 정의된 중간 (변형 backgrouND BY4743) </td></tr><tr><td> 구성 요소 </td><td> 농도 (g / L) </td></tr><tr><td> D - 글루코오스 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> 효모 질소베이스 (-AA/AS) </td><td> 1.7 </td></tr><tr><td> (NH 4) 2 SO 4 </td><td> 5.0 </td></tr><tr><td> 아데닌 </td><td> 0.04 </td></tr><tr><td> L - 아르기닌 </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L - Aspartic 수 소산 </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> L - 글루탐산 </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> L - 히스티딘 </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> L - 류신 </td><td> 0.3 </td></tr><tr><td> L - 라이신 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> L - 메티오닌 </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L - 페닐알라닌 </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> L - 세린 </td><td> 0.375 </td></tr><tr><td> L - 트레오닌 </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L - 트립토판 </td><td> 0.04 </td></tr><tr><td> L - 티로신 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> L - 발린 </td><td> 0.15 </td></tr><tr><td> 유라실 </td><td> 0.1 </td></tr></tbody></table> 참고 :이 제조법은 diploid BY4743 변형에 auxotrophies를 차지하고 있습니다. 아미노산 auxotrophies은 합성 전체 매체 배 최종 농도를 추가하여 보상하여야한다.

<ol>
	<li>Steinkraus, K. A., Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+aging+in+yeast:+the+means+to+the+end.">Replicative aging in yeast: the means to the end.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 29 (2008).</li><li>Kaeberlein, M., Conn, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of models for human aging. , 109 (2006).</li><li>Fabrizio, P., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae.">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae.</a> Aging Cell. 2 (2), 73 (2003).</li><li>Murakami, C. J., Burtner, C. R., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high-throughput+quantitative+analysis+of+yeast+chronological+life+span.">A method for high-throughput quantitative analysis of yeast chronological life span.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63 (2), 113 (2008).</li><li>Piper, P. W., Harris, N. L., MacLean, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preadaptation+to+efficient+respiratory+maintenance+is+essential+both+for+maximal+longevity+and+the+retention+of+replicative+potential+in+chronologically+ageing+yeast.">Preadaptation to efficient respiratory maintenance is essential both for maximal longevity and the retention of replicative potential in chronologically ageing yeast.</a> Mech Ageing Dev. 127 (9), 733 (2006).</li><li>Fabrizio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+is+a+mediator+of+an+altruistic+aging+program+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Superoxide is a mediator of an altruistic aging program in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Cell Biol. 166 (7), 1055 (2004).</li></ol>

여기에서 설명한 높은 처리량 연대기 수명 분석은 높은 정확성과 정밀도와 변종 다수의 고령화 잠재력을 quantifying위한 효과적인 방법입니다. 식민지 - 형성 단위 (예 3 참조) 계산에 의해 생존을 결정하는 고전적인 방법을 통해이 방법의 주요 사전은 높은 해상도의 성장 곡선을 얻기 위해 같은 Bioscreen C MBR 시스템으로 쉐이크 / 보육 / 플레이트 읽기 장치의 사용이다 각 나이 가리 킵니다. ?...

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Bacto Peptone</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD</td>
<td>211677</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bacto Yeast Extract</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD</td>
<td>288620</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Difco Agar</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD</td>
<td>214530</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast Nitrogen Base w/o A.A. and A.S.</td>
<td>Reagent</td>
<td>MidSci</td>
<td>J630-500G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amino Acids</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium Sulfate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Spectrum</td>
<td>AM185</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextrose</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>D16-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bioscreen C MBR machine</td>
<td>Tool</td>
<td>Growth Curves USA</td>
<td>5101370</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bioscreen 100-well Honeycomb plate</td>
<td>Tool</td>
<td>Growth Curves USA</td>
<td>9502550</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

quantifying yeast chronological life span by outgrowth of aged cells

신진 효모<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; 노화 연구 분야에서 중요한 모델 생물로 입증되었습니다<sup&gt; 1</sup&gt;. replicative 및 연대기 생활에 걸쳐이 효모에서 노화 연구에 사용이 설립 패러다임입니다. Replicative 노화가 단일 효모 어머니 세포가 노화하기 전에 생산 딸 세포의 숫자로 정의되며 연대기 노화 시간이 세포의 길이에 의해 정의 것은 아닌 나누어, 정지 같은 상태에서 살아남을 수<sup&gt; 2</sup&gt;. 우리는 연대순 수명의 양적 측정을위한 높은 처리량 방법을 개발했습니다. 이 방법은 선동 아래 정의된 중간에서 일정한 온도에서 세포를 노화 포함됩니다. 각 연령 시점에서 세포의 하위 인구 노령화 문화에서 제거되며 풍부한 성장 매체에 주사. 고해상도의 성장 곡선은 다음 Bioscreen C MBR 시스템을 사용하는 세 세포의 하위 인구 얻을 수 있습니다. 알고리즘은 다음 각 연령 시점에서 성장 반응 속도론에 따라 각 하위 인구 가능한 세포의 상대적인 비율을 결정하기 위해 적용됩니다. 이 방법은 재현성과 정밀도를 유지하면서 다른 연대기 수명의 assays에 비해 실질적으로 더 적은 시간과 자원이 필요합니다. 이 분석의 높은 처리량 자연은 좀더 복잡한 유기체에 추가 테스트를위한 새로운 장수 수정자를 식별하는 대규모 유전 및 화학 스크린을 허용해야합니다.

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Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

효모의 연대순의 노화는 고정 단계에서 시간과 관련된 세포 생존 능력의 상실을 말합니다. 여기 양적 효모 연대기 수명을 결정하는 높은 처리량 방법을 설명합니다.

지드 셀의 파생물로 효모 연대기의 수명 Quantifying

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

quantifying-yeast-chronological-life-span-by-outgrowth-of-aged-cells

Research

JoVE Journal

Biology

16.5K 조회수.  University of Washington. 효모의 연대순의 노화는 고정 단계에서 시간과 관련된 세포 생존 능력의 상실을 말합니다. 여기 양적 효모 연대기 수명을 결정하는 높은 처리량 방법을 설명합니다.

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A Rapid Technique for the Visualization of Live Immobilized Yeast Cells

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence microscopy. The technique is equally suited for visualization of static yeast populations, or time courses experiments up to ten hours in length. My microscopy investigates epigenetic inheritance at the silent mating loci in S. cerevisiae. There are two silent mating loci, HML and HMR, which are normally not expressed as they are packaged in heterochromatin. In the sir1 mutant background silencing is weakened such that each locus can either be in the expressed or silenced epigenetic state, so in the population as a whole there is a mix of cells of different epigenetic states for both HML and HMR. My microscopy demonstrated that there is no relationship between the epigenetic state of HML and HMR in an individual cell. sir1 cells stochastically switch epigenetic states, establishing silencing at a previously expressed locus or expressing a previously silenced locus. My time course microscopy tracked individual sir1 cells and their offspring to score the frequency of each of the four possible epigenetic switches, and thus the stability of each of the epigenetic states in sir1 cells. See also  Xu et al., Mol. Cell 2006.

A rapid technique for the visualization of growing immobilized yeast cells, here applied to fluorescent reporters at the silent mating loci HML and HMR

라이브 고정화 효모 세포의 시각화에 대한 신속한 기술

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence ...

연구

생물학

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

측정 Caenorhabditis 엘레간스</em솔리드 미디어> 수명

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

버딩 효모에 Replicative 수명 측정

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

효모 세포 Mitochondria의 정화

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

측정 Caenorhabditis 엘레간스</em96 웰 플레이트에 Microtiter> 수명

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

분열 효모의 양적 라이브 세포 형광 - 현미경 분석

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

단일 효모 세포에서 MAPK 유도 표현의 시간적 정량화

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular mechanisms underlying endothelial dysfunction in these individuals. However, the recent identification of blood outgrowth endothelial cells (BOECs), generated from circulating endothelial progenitors in adult peripheral blood, may circumvent this limitation by offering an endothelial-like, primary cell surrogate for patient-derived endothelial cells. Beyond their value to understanding endothelial biology and disease modeling, BOECs have potential uses in endothelial cell transplantation therapies. They are also a suitable cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) via nuclear reprogramming, offering a number of advantages over other cell types. We describe a method for the reliable generation, culture and characterization of BOECs from adult peripheral blood for use in these and other applications. This approach (i) allows for the generation of patient-specific endothelial cells from a relatively small volume of adult peripheral blood and (ii) produces cells that are highly similar to primary endothelial cells in morphology, cell signaling and gene expression.

This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.

사람 말초 혈액에서 생성 및 문화 혈액의 파생물 내피 세포

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.