이 프로토콜은 다양한 효모 종에서 세포 저장 지질 함량의 정량적 소규모 및 대규모 분석을 용이하게하고 편견과 표준화 된 방식으로 그렇게합니다. 이 기술은 현미경 이미지의 신속한 처리를 허용하고 다양한 조건에서 재배된 다양한 돌연변이및 세포와 같은 샘플을 쉽게 비교할 수 있는 상세한 정량적 출력을 제공합니다. 먼저 함께 제공되는 텍스트 프로토콜을 따라 염색 솔루션, 배양 미디어 및 셀을 준비합니다.
실험을 실행하기 전에 세포가 건강하고 원하는 성장 단계에서 있는지 확인하십시오. 다음으로, 각 시료를 이미지화할 현미경 커버슬립을 준비한다. 슬라이드 코팅 용액 1마이크로리터를 수평 으로 배치된 파이펫 팁의 긴 면을 사용하여 깨끗한 커버슬립에 펴놓습니다.
코팅 용액이 완전히 건조한 다음 커버립을 먼지가 없는 환경에 보관할 수 있습니다. 다음으로, 세포 배양의 광학 밀도를 측정하고, 배양이 동일한 성장 단계에서 분석될 수 있도록, 비교 가능한 실험 조건을 보장하기 위해 시험된 모든 배양들 사이에서 유사한 값에 도달하려고 노력한다. 그런 다음, 1.5 밀리리터 미세 원심 분리튜브로 세포 배양의 파이펫 1 밀리리터.
S.cerevisiae 세포의 경우 슬라이드 코팅 용액 5 마이크로리터를 튜브에 추가합니다. 그런 다음 모든 미세 원심 분리기 튜브를 잠시 소용돌이쳐 5 분 동안 흔들어섭 30도에서 배양하십시오. 다음으로, 각 배양 알리쿼트에 지질 염색 용액의 마이크로리터 1개를 추가하고 잠시 소용돌이를 가합니다.
그런 다음 셀 경계 시각화 용액의 10 마이크로리터를 추가하고 두 번째로 잠시 소용돌이를 가합니다. 실온에서 3분 동안 1, 000배 의 중력으로 원심분리하여 세포를 수집합니다. 회전이 완료되면, 상체에서 950 마이크로 리터를 제거하고 파이펫을 사용하여 나머지 상체에 있는 세포를 다시 중단합니다.
다음으로, 조밀한 셀 서스펜션의 피펫 2마이크로리터가 렉틴 코팅 커버슬립에 들어있습니다. 그런 다음, 커버슬립을 깨끗한 현미경 슬라이드에 놓고 세포 단층층을 형성하고 가능한 한 빨리 현미경 검사로 진행하여 이미징의 아티팩트를 최소화합니다. 현미경을 설정하려면 시료에 손상을 입히고 결과를 왜곡할 수 있는 강력한 광원에 긴 노출이 필요합니다.
따라서, 지질 적물 정량화에 더 이상 사용되지 않는 전용 샘플 슬라이드를 사용하여 이미징 조건을 설정합니다. 전용 샘플을 위상 대조 또는 차동 간섭 대비 현미경 설정의 단계에 배치하고 세포에 집중합니다. 현미경의 소프트웨어에서 Z 스택 설정을 설정하여 전체 셀 볼륨에 걸쳐 있습니다.
총 수직 거리는 셀 크기에 따라 달라지며 광학 슬라이스 수는 목표의 숫자 조리개에 따라 다릅니다. 다음으로 중앙 초점 평면을 기준으로 이동하는 초점을 설정합니다. 지질 방울을 이미지화하기 위해 녹색 채널에서 빛의 강도와 노출 시간을 실험적으로 설정합니다.
BODIPY는 빠르게 표백 될 수있는 매우 밝은 불소크롬이기 때문에 이미징 시주의하십시오. 또한 노출 시간을 최소화하여 과포화를 방지합니다. 모바일 지질 방울을 흐리게 하지 않도록 파란색 채널로 전환하기 전에 전체 녹색 채널 Z 스택을 먼저 캡처합니다.
셀 경계를 이미지화하려면 파란색 채널에서 광 강도 및 노출 시간을 실험적으로 설정합니다. 가능하면 현미경 제어 소프트웨어에 자동화된 실험 워크플로우를 설정하고 사용하여 표준화된 조건에서 여러 샘플의 이미징을 용이하게 합니다. 중요한 것은 모든 이미지를 동일한 설정을 사용하여 수집해야 샘플을 적절히 비교할 수 있어야 합니다.
이미징 조건이 최적화되면 세포에 초점을 맞추고 녹색 채널과 파란색 채널 모두에서 이미지합니다. 샘플당 여러 뷰 필드를 이미지하여 강력하고 대표적인 데이터를 얻습니다. 파란색 및 녹색 채널 Z 스택 이미지를 16비트 다층 TIFF 파일로 저장합니다.
해당 파일 이름에 녹색 또는 파란색 단어를 포함해야 합니다. ImageJ에서 현미경 이미지를 열고 획득 하는 동안 이동 하는 셀의 상당수를 포함 하는 이미지 스택을 제거 합니다. 이러한 위치는 개별 Z 섹션의 다른 위치에 나타납니다.
다음으로, 파란색 채널에서 형광이 높은 비세포 입자를 포함하는 이미지 스택을 제거합니다. 이것은 수시로 재배 매체에 있는 화상 진찰 표면에 먼지 또는 불순물로 기인하고 그들의 부근에 있는 세포의 검출을 방해할 수 있습니다. 또한 죽은 세포의 큰 비율을 포함하는 이미지 스택을 제거합니다.
이러한 이미지는 살아있는 세포에 비해 증가 된 청색 형광을 가진 세포를 표시합니다. 샘플에 있는 몇몇 죽은 세포의 존재는 전형적으로 문제가 되지 않으며 이러한 세포는 분석 도중 자동으로 버려지는 동안, 몇몇 죽은 또는 죽어가는 세포는 때때로 분할 알고리즘에 의해 살아있는 세포로 인식될 수 있고 그러므로 보고된 결과를 왜곡할 수 있습니다. MATLAB에서 분석을 시작하려면 먼저 메인 폴더를 만들고 모든 MATLAB 스크립트를 이 위치에 복사합니다.
다음으로 다양한 효모 종의 이름이 있는 하위 폴더를 만들고 각 TIFF 이미지를 이러한 위치에 복사합니다. 이제 MATLAB을 시작하고 스크립트 메인을 엽니다. m, 스크립트를 실행합니다.
메뉴에서 분석할 효모 종을 선택하고 이미지 처리를 시작합니다. 스프레드시트 편집기 또는 통계 패키지를 사용하여 필요에 따라 출력 파일을 검사하고 처리합니다. 워크플로는 세미콜론 분리 CSV 파일과 감지된 셀 개체및 지질 물방울이 있는 세그먼트TIFF 파일을 생성합니다.
여기에 도시된 야생형 S.pombe 세포는 복잡한 YES 배지 또는 정의된 EMM 배지에서 재배되었다. YES 배지에서 자란 세포에 비해, EMM 배지에서 세포 부피의 단위당 지질 방울과 더 높은 염색 강도가 검출되었다. 더욱이, EMM 배지에서 형성된 개별 지질 방울은 더 크고 총 염색 강도가 증가하였다.
이것은 EMM에서 자란 세포에 있는 증가한 저장된 지질 함량의 이전 사실 인정과 일치합니다. 다음으로, 이러한 이미지는 YES 배지에서 자란 기하급수적이고 초기 고정 된 배양에서 S.japonicus 세포를 보여줍니다. 정지 된 단계를 입력 하는 세포 는 볼륨 정규화 된 지질 방울 형광 강도 두 조건 사이 약간 감소 하는 동안 세포 볼륨의 단위 당 지질 물방울의 현저 하 게 감소 수를 보였다.
초기 고정 형 지질 물방울은 일반적으로 적당히 크기가 적당히 더 크고 기하급수적으로 성장하는 세포에서 물방울에 비해 적당히 더 높은 총 형광 강도를 가졌다. S.cerevisiae 세포에서 기하급수적으로 성장 하는 세포대 고정 된 단계 대 기하 급하 성장 세포에 비해 부피의 단위 당 다소 적은 지질 방울을 포함. 그러나, 그들의 볼륨 정규화된 물방울 형광 강도는 거의 두 배로 증가했습니다.
전반적인 지질 방울 함량의 이러한 급격한 증가는 고정 된 단계에서 개별 지질 방울의 훨씬 더 높은 형광 강도와 부피 때문이었습니다. 이 절차에 따라 출력 데이터를 R과 같은 통계 패키지에 집계하여 요약된 결과 플롯을 만들고 지질 방울 함량의 관찰된 차이점에 대한 통계 테스트를 실행할 수 있습니다. 원칙적으로, 이미지 처리 파이프라인은 다른 미생물의 지질 방울 함량을 분석하거나 다른 점과 같은 세포극 구조를 분석하는 데 사용될 수 있다.
