이 작품은 지원 SBIR 교부 금 (1R44EY027654-01A1)에 의해.

아동 병원 오클랜드 연구소 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 및 사용에 대 한 비전과 안과 (ARVO) 문에서 연구 협회 준수 프로토콜에 따라 마우스와 모든 절차 수행 했다 안과에서 동물의 연구 비전 및.
1. 조직 준비 Immunostaining
<ol><li>C57 BL/6J 생쥐 배아 하루 (E) 16, 산 후 (P)에서 안락사 0, P15와 p90 받게 이산화탄소 (CO2) 잘린 (E16와 P0 쥐)에 의해 다음에 의해.</li>
	<li>즉시 enucleate 마우스 눈 29G 1/2는 눈의 등 쪽에 바늘으로 구멍. 인산 염 버퍼 식 염 수 (1 x PBS) ph 8.0 실 온에서 5 분 (최소) 4 %paraformaldehyde (PFA)의 1 mL에 품 어.</li>
	<li>눈 컵 P0, P15, p90 받게, 각 막을 밖으로 해 부와 눈이 4%에 있는 동안 좋은 안과 위 렌즈 PFA. 참고: 건너뛰기 E16 눈은 눈으로이 단계는 너무 작은.</li>
	<li>수정 눈 컵 (P0, P15와 p90 받게)와 전체 눈 (E16) 4 %PFA에서 실 온에서 20 분. 다음 실 온에서 10 분의 1 x PBS의 1 mL에 두 번 눈 컵 및 전체 눈을 씻어.</li>
	<li>Cryoprotect 눈 컵 그리고 1xPBS, pH 8.0 포함 10% 자당 1 시간 동안에 전체 눈. 1 시간 동안 20% 자당 1 x PBS에 유지 하 고 4 ° c.에 하룻밤 1 x PBS에서 30% 자당 포화</li>
	<li>다음 날, 최적의 절삭 온도 화합물에 (10 월), (500 µ L) cryomolds에서 눈 컵 및 전체 눈을 포함, 스냅-동결 드라이 아이스/에탄올 목욕에서과-80 ° c.에 저장</li>
	<li>-80 ° C에서 임베디드 눈 컵 및 전체 눈 금형 제거과 cryosectioning 전에 1 시간 동안-20 ° C에 equilibrate 수 있습니다.</li>
	<li>잘라 망막 횡단면 (12 µ m 두께) 축에 평행 temporonasal-20 ° c.에 있는 cryostat를 사용 하 여 시 신경 머리를 통해</li>
	<li>현미경 슬라이드53 -80 ° c.에가 게에 망막 섹션을 탑재</li>
</ol>2. Immunostaining 5-엠씨 및 5-hmC 항 체와
<ol><li>소수 성 장벽 펜으로 슬라이드에 장착 된 망막 섹션을 둘러싸십시오 소수 성 장벽을 펜 얼룩 조직 하는 데 필요한 항 체의 볼륨을 줄일 수 있습니다.</li>
	<li>10 분의 1 x PBS의 200 µ L 한번 망막 섹션을 씻어.</li>
	<li>0.1%의 200 µ L로 망막 섹션 permeabilize 실 온에서 10 분의 1 x PBS (PBS-T)에 트라이 톤 X-100.</li>
	<li>변성 망막 섹션의 200 µ L 30 분 동안 37 ° C 배양 기에서 1 x PBS에 갓 2 N (HCl) 염 산을 만든. 참고: HCl 치료의 주의 적정 5mC 신호를 최적화 하기 위해 필요 합니다.</li>
	<li>항상 5mC 신호54를 최적화 하는 동안 생물 복제 (3-4)를 포함 합니다. 참고: 우리가 4 시간 포인트 (15 분, 30 분, 1 시간 및 2 시간)에서 항 원 검색 그리고 발견된 30 분 인큐베이션 5mC 신호에 대 한 최적입니다. HCl 가진 더 긴 외피 5mC 신호는 핵을 지역화 하는 무 능력으로 이어지는 핵의 구조 저하 됩니다.</li>
	<li>변성, 후 중화 망막 섹션 0.1의 100 µ L을 추가 하 여 10 분 동안 망막 부분에 트리 스-HCl (pH 8.3) M.</li>
	<li>차단 하는 솔루션의 500 µ L에 섹션을 품 어 (0.1%에서 5 %preimmune 정상 염소 혈 청 1 x PBS에 Triton X-100) 습도 챔버에 실 온에서 1 h.</li>
	<li>차단, 추가 안티-5mC; 안티-5hmC 항 체 희석 망막 섹션에 솔루션을 차단에 1: 500.</li>
	<li>망막 섹션 습도 챔버에 4 ° C에서 하룻밤을 품 어.</li>
	<li>다음 날 세척, 망막 섹션 3 0.1% (10-15 분 각 시간) 시간 PBS-T 다음 해당 보조 항 체와 함께 솔루션을 차단에 품 어 고 (염소 안티 토끼와 염소 반대로 마우스 IgG, 희석; 1:1000), DAPI (4', 6-를 포함 하 diamidino-2-phenylindole) 솔루션 (1 µ g/mL) 솔루션을 차단에 1 시간을 위한 실내 온도에. 참고: 섹션의 immunodetection의 모든 단계 동안 건조 하지 마십시오.</li>
	<li>씻어 슬라이드 1 mL의 0.1%와 3 시간 PBS.</li>
	<li>마지막 세척 후 수성 장착 매체는 coverslip 아래 섹션을 탑재 하 고 무색 매니큐어와 함께 인감.</li>
</ol>3. confocal Immunohistochemistry
<ol><li>항상 한 가지 방법 (예를 들어, 최대), 일관성에 대 한 직면 시 컵의 망막 색소 상피 면을 섹션을 방향을 정하십시오.</li>
	<li>Immunostained 망막 섹션 63 X에서 (대물 렌즈의 배율) 2 X의 이미지 캡처를 수행 또는 3 배 줌.</li>
	<li>각 선택 된 이미지의 여러 광학 섹션 생성 (z-스택) 모든 3 채널 (빨강, 녹색 및 파랑 RGB)에 0.35 µ m 단계를 사용 하 여. 참고: 견본 10-20 X에서 시각의 최종 배율 (대물 렌즈의 배율) 될 것입니다 63 X, 각각, (일반적으로 사용 되는) 10 배 눈 렌즈와 함께. 5mC와 5hmC 신호를 찾으려고 압축된 광학 스택을 시각화합니다</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

DNA 메 틸 화와 hydroxymethylation는 역동적이 고 가역 DNA 수정, modulatethe는 개발 뿐만 아니라 postmitotic 세포에서 생물 학적 메커니즘의 다양 한 범위. 여기, 우리가 설명 하는 단원의 paraformaldehyde 고정 냉동 마우스 망막의 immunohistochemical 기술 (안티-5mC와 안티-5hmC 항 체를 사용 하 여)에 의해 5mC와 5hmC DNA 수정에서 제자리에서 탐지 하기 위한 재현 기법 제공 개선 하 고 여러 다른 견본을 비교 하는 경우에 특히, 결과 표준화 지침. 우리 이전 5mC 변경 Dnmt1, Dnmt3a 및 Dnmt3b DNA methyltransferase 유전자를 망막 특정 프로세서용으로 마우스 망막에 윤곽을 그리 다이 메서드를 사용 하 고 보고 그들의 망막7에에서 5mC 마크 (예상된) 고갈 .
5mC immunohistochemical 감지에 중요 한 단계는 HCl 조직학 섹션의 처리의 최적화: HCl와 과도 한 치료는 핵을 파괴 하는 반면 15 분 전처리 재현성 결과 생산 하지 예상 보다 적은 아키텍처입니다. 우리는 HCl과 30 분 부 화 후 최상의 결과 발견. 우리는 항상 DNA 변성 및 망막 조직 고정을 위한 갓 희석된 HCl와 갓 만든된 4 %PFA 솔루션을 사용 하는 것이 좋습니다.
결과 해결 하려면 5mC 신호를 최적화 하는 동안 3 ~ 4 생물 복제를 포함 하도록 권장 합니다. 각각의 설정 하는 동안 immunohistochemical 얼룩 생성할 수 있습니다 약간 다른 결과 (다소 밝은 heterochromatic 지구를), 개별 집합 내의 immunohistochemical 방법, 5mC 및 5hmC 핵 분포에 예상 되는 섹션의 프로토콜 다음으로 재현성에 대 한 것으로 예상 된다.
이 기술은 또한 있다 제한 우리가 일관 되 게 동일한 섹션 포토 리셉터 세포 핵에 5mC 유통에서 변화 관찰. 우리는 인접 한 세포 핵 보였다 5mC 신호 하는 동안 강한 5mC 신호를 보여 일부 핵을 발견. 이것은 냉동된 섹션에서 HCl 처리에 의해 unmasking 5mC 항 한계 때문 이다.
이 기술의 중요성 DNase 및 가수분해 K 치료 chromocenters의 더 나은 보존을 선도 하지 않고 5mC 지역화를 수 있습니다. 이 기술은 모든 척추 동물의 조직, 운반 5mC, 5hmC 마크에서 어떤 섹션에 견고 하 게 작동 하는 것으로 예상 하 고 프로토콜 다음으로 뿐만 아니라 마우스 망막, 비슷한 방식으로 처리.

개발의 후 성적인 규정 및 마우스 망막의 postmitotic 항상성 retinogenesis 및 세포 운명 결정 제어 생물 학적 메커니즘에 대 한 새로운 이해를가지고 어떤 약속 셀 형식 관련 연구의 흥미로운 영역입니다. 신진 대사 기능, 세포 병 리, 세포 죽음 및 중생1,2,3,,45,6,,78 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. 스트레스, 대사 또는 세포 죽음 자극6,,1415, chromatin 가변 외부 신호에 대 한 응답에서 뿐만 아니라 개발, 동적 변화를 겪 습 16 , 17 , 18. 마우스 핵 chromatin 활성 euchromatin 및 비활성 섬으로6,,1920으로 분할 된다. Interphase 핵에 euchromatin 섬으로 라인 핵 주변 및 핵소체 반면 핵의 내부 영역에 상주 합니다. 이 패턴은 기존의 불리고 진핵생물에서 고도로 보존. 반면, 마우스와 쥐 같은 야행성 동물에 막대 핵 핵 섬으로 둘러싸인 euchromatin 바깥쪽 껍질6,18, 형성 하는 센터에 의해 점유 된다 패턴 거꾸로 있다 20. 출생 시, 로드 핵 기존의 핵 건축이 있다. 막대 핵의 반전 기존의 핵 건축 리 모델링 하 여 개발 하는 동안 발생 합니다. 이 과정 동안, 주변 섬으로 핵 주변에서 분리 하 고 chromocenters 융합 센터에서 단일 chromocenter 형태의 핵6,18.
게놈 DNA 메 틸 화 제어 로컬 chromatin 구조21에 참여 합니다. DNA 메 틸 화는 5' 풍성 하 게 CpG 디의 시 토 신 잔류물의 마우스 게놈22,23,,2425,26 에 많은 유전자의 발기인 지구에 있는 위치에서 발생 뿐만 아니라 intergenic intron 지역, 규제 요소27을 수행. 근 위 발기인21,24 에 CpG 섬 및 유전자 증강27,28 CpG 시퀀스의 메 틸 화는 포함 하는 많은 chromatin의 동적 상태를 조절에 중요 한 발달 유전자/녹음 방송 요인 개발, 암 및 노화29,30,31,32,,3334 에서 중요 한 역 . 3 DNA methyltransferases (DNMTs) 마우스 개발35동안 DNA 메 틸 화에 참여합니다. 모든 3 개의 DNMTs 마우스 망막 개발36 과 Dnmt 유전자 영향 망막 개발2,7망막 특정 변화 하는 동안 표시 됩니다. Hydroxymethylcytosine (5hmC) 5-methylcytosine (5mC) demethylation의 산화 제품 이다. 3 10-11 전 (TET) 효소 5mC demethylation37,,3839에 참여. Hydroxymethyl C 수정 발기인, 유전자 몸과 유전자 부자와 적극적으로 베낀된 지역27,40intergenic 게놈 시퀀스에 농축입니다.
다양 한 방식의 설명 셀41,,4243,44,45,46에서 DNA 메 틸 화 패턴 변화를 결정 하는 데, 그들 중 일부는 사용 DNA 메 틸 화 CpG 풍부한 지역 발기인과 증강에에서 정확한 변화에 초점을 맞추고 다른 사람들의 세계적인 변화 측정 검색 및 5hmC의 정량화 방법 또한 보고 된47, immunohistochemistry13포함 했다. 5mC와 5hmC 변화에 핵 개발의 강력한 모니터링 활성화 Immunohistochemical 기법, postmitotic 세포, chromatin 역학에서 제자리에서 외부 또는 내부 변화에 대응 묘사에 대 한 매우 유익 하지 않습니다 셀4,13,,4849에 영향을. 그러나,이 접근은 DNA 메 틸 화 및 조직학 준비에서 시 토 신 수정 감지와 관련 된 기술적인 어려움 때문에 hydroxymethylation 변화를 과소 평가 하는 경향이 있다. 이 때문에 비 극성 DNA 기초, 5mC 5hmC 수정 시 토 신 등은 이중 가닥 DNA 나선50의 센터에서 숨겨지고 unmasking 필요. 이것은 가혹한 치료 적용 되 면 원래 조직의 유익한 조직을 잃을 수 있습니다 급속 하 게 냉동된 조직학 준비에서 특히 도전적 이다.
마우스 망막 신경 개발 및 postmitotic 항상성 DNA 메 틸 화에의 기여를 해 부하는 우수한 모델입니다. 뉴런의 6 종류만 있다 (막대와 콘 대뇌, amacrine, 바이 폴라, 수평 및 신경 절 세포), glial 세포 유형 (뮬러 명과) 및 한 neuroepithelial 세포 유형 (망막 안료 상피)51. 망막 세포 유형 DNA 메 틸 화18,19, 최근 단일 기본 해상도1,,59,12공부는의 명백한 본을 보고 했다. 우리는 최근 immunohistochemistry 응용 프로그램 묘사 5mC 성인 마우스 망막, 조건부 타겟팅 하 여 제거 된 모든 3 개의 DNA methyltransferases의 핵의 망막 세포 핵 내에서 분포의 패턴을 보고 7. 보고서, 망막 세포에서 DNA 메 틸 화의 존재는 긍정적 으로만 볼 수 또는 hypermethylated에서 부정적인 신호 겪고 apoptosis 세포의 수에 비해 우리의 접근 활성화 감지 특정 chromatin 우리 여러 그룹 보고 하 고 앞에서 설명한 망막 세포 핵 내 배열5,6,7,,1819,36 , 52. 여기, 우리 뿐만 아니라 우리의 원래 보고서7에서에서 재현 수 있었습니다 데이터 설명 단원의 냉동 paraformaldehyde 고정 조직학 세부 사항에 5mC 및 5hmC를 감지 immunohistochemical (IHC) 기술을 설명 .

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>29G1/2 ULTRA-FINE</td><td>BD Biosciences</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic scissor</td><td>Fine Science tools, Inc.&amp;nbsp;</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>RPICORP.com</td><td>195505</td><td></td></tr><tr><td>Microslide Superfrost plus</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagent&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscope Science</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Optical cutting compound (OCT)</td><td>VWR</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>6 N HCl</td><td>VWR analytical&amp;nbsp;</td><td>BDH7204-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl pH 8.3</td><td>Teknova</td><td>T1083</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>5mC</td><td>Genway Biotech&amp;nbsp;</td><td>GWB-BD5190</td><td></td></tr><tr><td>5hmC</td><td>Active Motif</td><td>39791</td><td></td></tr><tr><td>LaminB1</td><td>Abcam</td><td>Ab16048</td><td></td></tr><tr><td>Cy2 AffiniPure Goat Ant-Rabbit IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-225-1444</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Goat Ant-Mouse IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-585-166</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICRM HM 550</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>388114</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

immunohistochemical detection of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine in developing and postmitotic mouse retina

Epigenetics 망막 개발의 다양 한 인간의 망막 퇴행 성 질병의 메커니즘에 대 한 이해의 새로운 수준을 약속 새로운 치료 접근을 정확 하 게 잘 공부 연구 분야 이다. 마우스 망막의 핵 아키텍처는 두 개의 서로 다른 패턴 구성: 전통과 반전. 기존의 패턴은 동안 활성 euchromatin 핵 내부에 있는 섬으로, 핵의 주변에 지역화는 보편적 이다.입니다. 반면, 거꾸로 핵 패턴은 섬으로 localizes 핵 센터 및 euchromatin 핵 주변에 있는 성인 봉 포토 리셉터 세포 핵에 고유 합니다. DNA 메 틸 화는 chromocenters에서 주로 관찰 된다. DNA 메 틸 화 CpG 디 많은 유전자의 발기인 지구에 풍성 하 게 하는 시 토 신 잔류물 (5-methylcytosine, 5mC)에 동적 공유 수정입니다. 3 DNA methyltransferases (DNMT1, DNMT3A와 DNMT3B) 개발 중 DNA의 메 틸 화에 참여합니다. Immunohistochemical 기술로 검출 5mC은 매우 도전, 결과, 다양성에 기여 하는 5mC 수정 기지를 포함 하 여 모든 DNA 기초는 이중 가닥 DNA 나선 안에 숨겨져 있습니다. 그러나, 개발 하는 동안 5mC 배포의 상세한 묘사 매우 유익 하지 않습니다. 여기, 우리 5mC와 다른 후 성적인 DNA 마커 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) 개발에 "오픈", transcriptionally 활성화 chromatin와 colocalizes는 강력한 immunohistochemical 감지에 대 한 재현 기법을 설명 하 고 postmitotic 마우스의 망막

Postmitotic 망막 및 망막 개발 하는 동안 5-methylcytosine (5mC) 및 5-hydroxymethylcytosine (5hmC)의 분포를 결정 하기 위해 우리 immunostained C57BL/6J 마우스 망막 섹션 E16, P0, P15, p90 받게에서 특정 항 체와 5mC와 5hmC.
E16 5mC 얼룩 했다 세포 핵의 chromocenters에서 강한 동안 전체 세포 핵 (그림 1a)에서 관찰 되었다 약한 얼룩. 세포 핵에 국한 되었다 5hmC 얼룩이 지 고 결 석 했다 chromocenters (그림 1b)에서.
P0 망막 5mC 신호 세포 핵과 핵 주변 (그림 2a, 화살표 및 화살표)의 chromocenters에 지역화 되었습니다. 우리는 또한 세포 핵의 chromocenters 사이 5mC의 약한 얼룩이 관찰. 5hmC 신호 chromocenters (그림 2b) 제외한 세포 핵에 강력 하 게 존재 했다. 우리는 더 많은 핵 5mC와 5hmC 내부 neuroblast 레이어 (INBL) (그림 2 c, 점선)에 묻은 게 있다 발견
P15 망막에서 우리는 5mC와 외부 핵 층 (ONL), 안 핵 층 (INL)와 신경 절 세포 층 (GCL) (그림 3)에서 5hmC의 강한 얼룩 다는 것을 발견. ONL (로드 대뇌), 5mC 신호 세포 핵과 핵 주변 (그림 3a-3 c, 3 세대)의 chromocenters에 존재 했다. 5hmC 신호는 chromocenters (그림 3-3 층)를 제외한 전체 세포 핵에 발견 되었다. P15 망막에 전송 전자 현미경 검사 법 5mC 항 체 신호 (그림 3 h 와 3i) 발견 비슷한 막대 세포 핵에 heterochromatic 도메인의 분포를 보여줍니다.
INL 및 GCL 5mC 얼룩 세포 핵의 chromocenters에 강한 고 약한 얼룩 전체 세포 핵 (수치 3j-3 l 과 3t 3r)에서 또한 관찰 되었다. 5mC, 반면 5hmC 신호 했다 INL 및 GCL (그림 3 m-3o 및 3u 3w)에서 chromocenters 제외한 전체 세포 핵에 지역화 됩니다. 우리는 강한 관찰 GCL 세포 핵의 주변에서 5hmC 신호.
성인 봉 대뇌에서 5mC 신호 5hmc 신호는 핵 주변 (그림 4 d-4 층)에 국한 되었다 하는 동안 chromocenter 및 세포 핵 (그림 4a-4 c)의 핵 주변에 제한 되었습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig1.jpg"> 그림 1입니다. 지 배아 일 16에 방화 5-methylcytosine 및 마우스 망막에 5-hydroxymethylcytosine 5mC에 항 체와 C57BL/6J 망막의 Immunostaining (빨강) 및 5hmC (녹색, b). E16, 5mC 신호 세포 핵의 chromocenters에 매우 강하고 또한 훨씬 낮은 수준에서 전체 세포 핵에 존재입니다. 5hmC 얼룩 세포 핵에 독점적으로 수감 했다. 패널 c 병합된 5mC와 5hmC 이미지를 나타냅니다. 핵은 DAPI (블루, c)와 counterstained는. 음각은 이미지에 별표와 함께 표시 하는 영역의 확대를 나타냅니다. 눈금 막대: 5 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig2.jpg"> 그림 2입니다. Immunohistochemical 출생 후 하루 0에서 5-methylcytosine 및 마우스 망막에 5-hydroxymethylcytosine의 얼룩. 5mC에 항 체와 C57BL/6J 망막의 Immunolabeling (빨강) 및 5hmC (녹색, b). P0 망막 5mC와 5hmC에서는 외부 neuroblast 레이어 (ONBL)와 내부 neuroblast 레이어 (INBL)에 있습니다. 5mC) 신호는 chromocenters (화살표)과 셀 핵 (화살촉)의 핵 주변에 강력 하 게 존재. 5mC의 약한 얼룩 세포 핵의 chromocenters 사이 관찰 됩니다. b) 5hmC 얼룩은 세포 핵에 국한 하 고 강한 신호는 INBL (패널 c에서 점선)에서 관찰 됩니다. 패널 c 병합된 5mC와 5hmC 이미지를 나타냅니다. 핵은 DAPI (블루, c)와 counterstained는. 음각은 이미지에 별표와 함께 표시 하는 영역의 확대를 나타냅니다. 눈금 막대: 5 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig3.jpg"> 그림 3입니다. 5-methylcytosine 및 5-hydroxymethylcytosine 배포 마우스 망막에서 출생 후 하루 15에서. 안티-5mC와 5hmC 항 체 (a-g, j-y)와 함께 C57BL/6J 망막의 Immunostaining. 외부 핵 층 (ONL) (막대 대뇌) 5mC 신호에에서 (빨강, 셀 핵 (화살촉, b)의 chromocenters와 일치 한) 일반적으로 고도 (화살표, b) 핵 주변에 localizes. 패널 (빨간색)와 c (회색) 이미지에 별표와 함께 표시 하는 영역의 확대를 대표 한. 5hmC 신호 (녹색, d)는 chromocenters 제외 하 고 전체 셀 핵에 국한 됩니다. 패널 (녹색)와 f (회색) g 병합된 5mC와 5hmC 이미지를 나타내는 이미지 디 패널에서에서 별표와 함께 표시 하는 영역의 확대를 나타냅니다. 핵은 DAPI와 counterstained는. 패널 h와 나는 heterochromatic 도메인의 산 후 하루 15 보여주는 배포에서 포토 리셉터 핵의 전송 전자 현미경 이미지입니다. 패널 h에 검은 화살표 빨간색 화살표 핵 주변에 있는 섬으로 가리킨 동안 로드 포토 리셉터 핵 내의 heterochromatic 도메인을 가리킨 패널에 빨간 화살촉 단일 로드 포토 리셉터 핵 패널 i. 확대를 가리킵니다. INL (j-q), GCL 세포 핵 (r-y) 5mC 신호 (적색) 주변에 chromocenters를 지역화 하 고 약한 얼룩 감지 세포 핵의 나머지에서. 패널 k 씨 (빨간색)와 (회색) 이미지 j에 별표와 함께 표시 하는 영역의 확대를 나타냅니다. 5hmC 얼룩 (녹색) INL 및 GCL 세포 핵에 전체 세포 핵에 국한 됩니다. Note 강한 5hmC GCL 셀의 핵 주변에 얼룩. 패널 p와 x 패널 q 및 y 각각 이미지 p와 x에 별표와 함께 표시 하는 영역의 확대를 대표 하는 동안 병합된 5mC와 5hmC 이미지를 나타냅니다. 핵은 DAPI와 counterstained는. 눈금 막대: 5 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig4.jpg"> 그림 4입니다. 5-methylcytosine 및 5-hydroxymethylcytosine 배포 로드 포토 리셉터 핵에 C57BL/6J 마우스 망막의 산 후 하루 90에서. 5mC 얼룩 (빨강, 한) 핵 주변에 있는 세포 핵 및 또한 약하게 현재 chromocenter에 강력 하 게 존재 하는. 패널 (빨간색)와 c (회색) 이미지에 별표와 함께 표시 하는 영역의 확대를 대표 한. 5hmC 얼룩 (녹색, d)은 독점적으로 핵 주변 패널 e (녹색)에 국한 하 고 g 병합된 5mC와 패널 h 동안 5hmC 이미지를 나타내는 이미지 디 패널에서에서 별표와 함께 표시 된 영역의 f (회색) 대표 확대 표시 영역의 확대 g. 핵 DAPI (파란색)와 counterstained는 이미지에 별표. 눈금 막대: 5 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

5-Methylcytosine 개발에 5-Hydroxymethylcytosine의 Immunohistochemical 검출 및 Postmitotic 마우스 망막

이 보고서의 목적은 강력한 immunohistochemical epigenetic 마커의 검출을 위한 프로토콜을 설명 하기 위해, 5-methylcytosine (5mC) 및 5-hydroxymethylcytosine (5hmC)을 개발 하 고 postmitotic 마우스 망막.

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

immunohistochemical-detection-5-methylcytosine-5

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.9K 조회수.  BioTime, Inc. 이 보고서의 목적은 강력한 immunohistochemical epigenetic 마커의 검출을 위한 프로토콜을 설명 하기 위해, 5-methylcytosine (5mC) 및 5-hydroxymethylcytosine (5hmC)을 개발 하 고 postmitotic 마우스 망막.

비디오: Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of enzymatic oxidation of 5mC to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) as well as detection of N6-methyladenine (6mA) in the DNA of multicellular organisms provided additional degrees of complexity to the epigenetic research. According to a growing body of experimental evidence, these novel DNA modifications may play specific roles in different cellular and developmental processes. Importantly, as some of these marks (e. g. 5hmC, 5fC and 5caC) exhibit tissue- and developmental stage-specific occurrence in vertebrates, immunochemistry represents an important tool allowing assessment of spatial distribution of DNA modifications in different biological contexts. Here the methods for computational analysis of DNA modifications visualized by immunostaining followed by confocal microscopy are described. Specifically, the generation of 2.5 dimension (2.5D) signal intensity plots, signal intensity profiles, quantification of staining intensity in multiple cells and determination of signal colocalization coefficients are shown. Collectively, these techniques may be operational in evaluating the levels and localization of these DNA modifications in the nucleus, contributing to elucidating their biological roles in metazoans.

Newly discovered oxidized forms of 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) may represent distinct DNA modifications with unique functional roles. Here a semi-quantitative workflow for visualization of oxi-mCs' spatial distribution, signal intensity profiling and colocalization is described.

DNA 수정에 대 한 Immunostaining: 공초점 이미지의 계산 분석

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

연구

유전학

High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue

DNA hydroxymethylation is a long known modification of DNA, but has recently become a focus in epigenetic research. Mammalian DNA is enzymatically modified at the 5th carbon position of cytosine (C) residues to 5-mC, predominately in the context of CpG dinucleotides. 5-mC is amenable to enzymatic oxidation to 5-hmC by the Tet family of enzymes, which are believed to be involved in development and disease. Currently, the biological role of 5-hmC is not fully understood, but is generating a lot of interest due to its potential as a biomarker. This is due to several groundbreaking studies identifying 5-hydroxymethylcytosine in mouse embryonic stem (ES) and neuronal cells. Research techniques, including bisulfite sequencing methods, are unable to easily distinguish between 5-mC and 5-hmC . A few protocols exist that can measure global amounts of 5-hydroxymethylcytosine in the genome, including liquid chromatography coupled with mass spectrometry analysis or thin layer chromatography of single nucleosides digested from genomic DNA. Antibodies that target 5-hydroxymethylcytosine also exist, which can be used for dot blot analysis, immunofluorescence, or precipitation of hydroxymethylated DNA, but these antibodies do not have single base resolution.In addition, resolution depends on the size of the immunoprecipitated DNA and for microarray experiments, depends on probe design. Since it is unknown exactly where 5-hydroxymethylcytosine exists in the genome or its role in epigenetic regulation, new techniques are required that can identify locus specific hydroxymethylation. The EpiMark 5-hmC and 5-mC Analysis Kit provides a solution for distinguishing between these two modifications at specific loci. The EpiMark 5-hmC and 5-mC Analysis Kit is a simple and robust method for the identification and quantitation of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine within a specific DNA locus. This enzymatic approach utilizes the differential methylation sensitivity of the isoschizomers MspI and HpaII in a simple 3-step protocol. Genomic DNA of interest is treated with T4-BGT, adding a glucose moeity to 5-hydroxymethylcytosine. This reaction is sequence-independent, therefore all 5-hmC will be glucosylated; unmodified or 5-mC containing DNA will not be affected. This glucosylation is then followed by restriction endonuclease digestion. MspI and HpaII recognize the same sequence (CCGG) but are sensitive to different methylation states. HpaII cleaves only a completely unmodified site: any modification (5-mC, 5-hmC or 5-ghmC) at either cytosine blocks cleavage. MspI recognizes and cleaves 5-mC and 5-hmC, but not 5-ghmC. The third part of the protocol is interrogation of the locus by PCR. As little as 20 ng of input DNA can be used. Amplification of the experimental (glucosylated and digested) and control (mock glucosylated and digested) target DNA with primers flanking a CCGG site of interest (100-200 bp) is performed. If the CpG site contains 5-hydroxymethylcytosine, a band is detected after glucosylation and digestion, but not in the non-glucosylated control reaction. Real time PCR will give an approximation of how much hydroxymethylcytosine is in this particular site. In this experiment, we will analyze the 5-hydroxymethylcytosine amount in a mouse Babl/C brain sample by end point PCR.

The EpiMark 5-hmC and 5-mC Analysis Kit can be used to analyze and quantitate 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine within a spe cific locus. The kit distinguishes 5-mC from 5-hmC by the addition of glucose to the hydroxyl group of 5-hmC via an enzymatic reaction utilizing &beta;-glucosyltransferase (T4-BGT). When 5-hmC occurs In the context of CCGG, this modification converts a cleavable MspI site to a non-cleavable site.

Balb / C 뇌 조직에 높은 민감도는 5 hydroxymethylcytosine 감지

DNA hydroxymethylation is a long known modification of DNA, but has recently become a focus in epigenetic research.   Mammalian DNA is enzymatically ...

신경과학

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

혈관을 조사하기 위해 신생아 마우스 망막의 전체 마운트 면역 형광 염색<em&gt; 생체 내</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical role in early embryonic development. Enzymatic modifications drive active methylation and demethylation of cytosine into 5-methylcytosine (5-mC) and subsequent oxidation of 5-mC into 5-hydroxymethylcytosine, 5-formylcytosine, and 5-carboxylcytosine. Epigenetic reprogramming is a critical period during in utero development, and maternal exposure to chemicals has the potential to reprogram the epigenome within offspring. This can potentially cause adverse outcomes such as immediate phenotypic consequences, long-term effects on adult disease susceptibility, and transgenerational effects of inherited epigenetic marks. Although bisulfite-based sequencing enables investigators to interrogate cytosine methylation at base-pair resolution, sequencing-based approaches are cost-prohibitive and, as such, preclude the ability to monitor cytosine methylation across developmental stages, multiple concentrations per chemical, and replicate embryos per treatment. Due to the ease of automated in vivo imaging, genetic manipulations, rapid ex utero development time, and husbandry during embryogenesis, zebrafish embryos continue to be used as a physiologically intact model for uncovering xenobiotic-mediated pathways that contribute to adverse outcomes during early embryonic development. Therefore, using commercially available 5-mC-specific antibodies, we describe a cost-effective strategy for rapid and efficient spatiotemporal monitoring of cytosine methylation within individual, intact zebrafish embryos by leveraging whole-mount immunohistochemistry, automated high-content imaging, and efficient data processing using programming language prior to statistical analysis. To current knowledge, this method is the first to successfully detect and quantify 5-mC levels in situ within zebrafish embryos during early development. The method enables the detection of DNA methylation within the cell mass and also has the ability to detect cytosine methylation of yolk-localized maternal mRNAs during the maternal-to-zygotic transition. Overall, this method will be useful for the rapid identification of chemicals that have the potential to disrupt cytosine methylation in situ during epigenetic reprogramming.

This paper describes a protocol for the rapid and efficient spatiotemporal monitoring of normal and aberrant cytosine methylation within intact zebrafish embryos.

온전한 Zebrafish 배아 내에서 정상 및 비정상적인 시토신 메틸화에 대한 신속하고 효율적인 시공간 모니터링

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical ...

발생학

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

게놈 DNA에서 도보로 5 hydroxymethylcytosine의 선택적 캡처

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

생물학

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic mechanisms have been intensively studied. 5-hydroxymethylcytosine displays dynamic features during embryonic and postnatal development of the brain, plays a regulatory function in gene expression, and is involved in multiple neurological disorders. Here, we describe the detailed methods including immunofluorescence staining and&#160;DNA dot-blot to detect 5-hydroxymethylcytosine in cultured cells and brain tissues of mouse.

Here, we present a protocol to detect 5-hydroxymethylcytosine in cells and brain tissues, utilizing immunofluorescence staining and DNA dot-blot methods.

신경 줄기 세포와 쥐의 뇌에서 5-하이드록시메틸시토신의 검출

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.

Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.

민감한 면역를 사용하여 시토신의 수정 된 형태의 검출

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. ...

Cryosectioning and Immunostaining of Mouse Retina

Tissue sectioning and immunohistochemistry are essential techniques in histological and pathological studies of retinal diseases using animal models. These methods enable detailed examinations of tissue morphologies and the localization of specific proteins within the tissue, which provide valuable insights into disease processes and mechanisms. Mice are the most widely used model for this purpose. However, because mouse eyeballs are small and mouse retinas are extremely delicate tissues, obtaining high-quality retinal sections and immunostaining images from mouse eyeballs is typically challenging. This study describes an improved protocol for cryosectioning mouse retinas and performing immunohistochemistry. An essential point of this protocol involves coating the eyeball with a layer of super glue, which prevents deformation of the eyeballs during the processes of cornea removal, lens extraction, and embedding. This step ensures the integrity of retinal morphologies is well preserved. This protocol highlights critical technical considerations and optimization strategies for consistently producing high-quality retinal sections and achieving excellent immunostaining results.

A protocol for preparing mouse retinal cryosections and performing immunostaining on photoreceptors is described. This article enables researchers to consistently produce mouse retinal frozen sections with well-preserved morphology and high-quality immunostaining results.

마우스 망막의 동결 절편 및 면역 염색

Tissue sectioning and immunohistochemistry are essential techniques in histological and pathological studies of retinal diseases using animal models. ...

5-Methylcytosine Dot Blot to Determine the Extent of DNA Methylation

Start this procedure by denaturing the isolated DNA in 0.1 molar sodium hydroxide for 10 minutes at 95 degrees Celsius. Neutralize the DNA with 1 molar ammonium acetate on ice, and then dilute two-fold with double-distilled water.
The most critical step in the dot blot is the spotting of the samples onto the membrane, do it slowly, and carefully. Try to minimize each spotted area to 3 to 4 millimeters in diameter.
Using a narrow-mouth pipette tip, carefully spot 2 microliters of the serial diluted genomic DNA onto a positively-charged nylon membrane at the center of the grid. Blot the membrane at 80 degrees Celsius for 30 minutes. Next, block the non-specific antibody binding sites by soaking the membrane in 5% BSA in TBST in a 10-centimeter Petri dish for 1 hour at room temperature with gentle shaking.
After 1 hour, wash the membrane three times in TBST for 5 minutes each time. Incubate the membrane with a mouse anti-5-methylcytosine monoclonal antibody in TBST at 4 degrees Celsius overnight. On the following day, wash the membrane three times in TBST for 5 minutes each time.
Then, incubate with a secondary antibody &#8212; horseradish peroxidase-conjugated sheep anti-mouse immunoglobulin G in TBST for one hour at room temperature. After washing the membrane in TBST as before, add the enzyme substrate to the membrane, and incubate for 5 to 10 minutes. Finally, visualize the secondary antibody signal using a chemiluminescence kit according to the manufacturer&#39;s instructions.

5-Methylcytosine 개발에 5-Hydroxymethylcytosine의 Immunohistochemical 검출 및 Postmitotic 마우스 망막

요약

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