저자는 NINDS / NIH, R00-NS064197 및 NINDS / NIH, R01NS083897 (DLS에 모두)에서 자금을 인정합니다.

미디어 1. 준비 (그림 1, 1 단계) <ol><li> 슬라이스 문화 매체 <ol><li> 슬라이스 배지 25 ㎖를 잘 당 2 조각을 5 유리 바닥 요리를 준비하기에 충분하다. </li><li> 50 ML 원뿔 관에서 100 배 N2 용액 250 μL와 비타민 A 22.5 ML의 볼륨에 DMEM/F12를 추가하지 않고 50 배 B27 솔루션 500 μl를 추가합니다. </li><li> 필터 솔루션을 살균 이후에 열 불 활성화 된 말 혈청 1.25 ㎖ 및 소 태아 혈청 1.25 ㎖를 추가합니다. </li><li> 조각의 준비 기간 동안 37 ° C에서의 물을 욕조에 솔루션을 품어. </li><li> 성장 인자 (FGF와 EGF, 10의 최종 농도 추가 NG / ML 20 직전 문화의 시작 부분에) 각각 / ㎖를 겨. 이 배지의 조성은 배양에서 세포의 생존을 촉진하고, 신경 전구 세포의 증식 속도를 높이기 위해 최적화되었다. 이는 이와에 확률을 최대화 할 것이다슬라이스의 유사 분열 세포를 관찰합니다. </li></ol></li><li> 전체 HBSS 해부 솔루션 <ol><li> , 0.9 M 탄산 수소 나트륨 2.2 ML 1 M 헤 페스 1.25 ㎖ (산도 7.4, FC 2.5 ㎜), 2.5 M D-포도당 6 ㎖ (FC 30 mm)를 10 배 HBSS 50 ㎖를 추가하여 전체 HBSS 500 ㎖를 준비 500 ML의 최종 볼륨에 DIH 2 O 오토 클레이브 (FC 4 MM) 및. </li><li> 임신 한 마우스에서 자궁 뿔의 컬렉션까지 4 ° C에서 소독 필터 솔루션 및 저장. 이 솔루션은 주 4 ° C로 유지 될 수있다. </li><li> 전체 해부 절차를 수행하는 동안 얼음에 HBSS를 유지합니다. </li></ol></li><li> 솔루션을 포함하기 <ol><li> 4 배아 두뇌의 매립의 경우, 전체 HBSS 용액에서 3 % 저 융점 아가로 오스 30 ㎖를 준비합니다. 50 ML 원뿔 관에 30 ml의 아가로 오스 저 융점 및 전체 HBSS의 0.9 g을 추가합니다. </li><li> 와류 믹서 솔루션을 혼합, 튜브 서 및 모자를 오픈과 함께 전자 레인지에 녹아. </li><li> 전자 레인지에서, P의 해결책을 모니터링하면서과도한 비등에 의한 못하 오버 플로우. 시작 비등 할 때, 전자 레인지를 중지하고 솔루션을 소용돌이. </li><li> 모든 아가로 오스가 녹을 때까지이 단계를 반복합니다. </li><li> 42 ℃에서 수욕 튜브를 저장할 </li></ol></li></ol> 태아의 2. 해부 (그림 1, 2 단계) <ol><li> 임신 한 쥐의주의 안락사 후, 자궁 뿔을 수집하고 차가운 전체 1X HBSS를 포함하는 10cm 2 페트리 접시에 그들을 전송합니다. 배아의 나이는 연구 결과에 따라 달라질 수 있습니다. 이 프로토콜은 E17.5에 배아 일 E12.5에서 뇌 조각을 배양하기 위해 성공적으로 사용되어왔다. 크기 때문에, 젊은 두뇌가 작동하기 어려운 경향이있다. </li><li> 배아를 수집하고 두 대뇌 반구와 후뇌와 전뇌를 포함한 전체 배아 뇌를 얻을 때까지, 쥐, 마우스 (26, 27)에서 설명한 바와 같이 태아의 뇌를 해부하다. 이들은이 될 수 있습니다모든 뇌 해부 될 때까지 실온에서 보관. </li><li> 배아를 수집하고 두 대뇌 반구와 후뇌와 전뇌를 포함한 전체 배아 뇌를 얻을 때까지, 쥐, 마우스 (26, 27)에서 설명한 바와 같이 태아의 뇌를 해부하다. 모든 뇌 해부 될 때까지이 실온에서 유지 될 수있다. </li></ol> 3. 배아 두뇌의 포함 (그림 1, 3 단계) <ol><li> 양동이 포함하는 얼음에 삽입 금형에 삽입 얼음에 구멍을 만들 수 있습니다. </li><li> 플라스틱 금형에 3 % 아가로 오스 매체를 붓고 얼음에서 제조 된 구멍에 그 형을 배치합니다. </li><li> 온도가 35 ° C.에 도달 할 때까지 디지털 온도계의 끝이 아가로 오스 매체를 저어 </li><li> 즉시 삽입 매체로 뇌를 전송합니다. </li><li> 중요한 단계 :주의 깊게, 뇌와 아가로 오스 사이의 인터페이스에서 초과 HBSS를 제거하고 부드럽게 반복 / 두뇌를 회전 공중제비집게로 매립 솔루션. </li><li> 아가 로스 겔의 쿠션 얼음과 접촉 금형의 아래쪽에 형성된다. 뇌를 교반하면서 쿠션 집게의 끝으로 느낄 수 있습니다되면, 지느러미 쪽이 위로 머리를 놓습니다. 뇌는 금형의 맨 아래에 가라 앉지한다. </li></ol> 아가로 오스 블록 4. 준비 (그림 1, 4 단계) <ol><li> 아가로 오스는 적어도 5 분 동안 얼음에 굳어하자. </li><li> 면도날을 사용하여, 부분 금형의 모서리. </li><li> 정중 면도날을 사용하여 뇌 주위 아가 블록을 새긴다. 포함 된 두뇌를 교란 방지하기 위해 상처의 수를 최소화하려고합니다. </li><li> 장절 받침대에 블록의 안정성을 높이기 위해 (그림 1, 4 단계를 참조 주동이의 지역 대) 블록은 뇌의 꼬리 지역에서 더 큰 표면적을 가지고 있는지 확인합니다. </li><li> 마지막 컷은 뇌의 꼬리 쪽의 하나가 될한다이 컷은 vibratome와 올바른 단면 평면을 정의합니다. </li><li> 뇌의 rostro - 꼬리 축과 아가로 오스 블록에 수직 블레이드를 정렬하여 이렇게. 꼬리 쪽 rostro - 꼬리 축을 따라 칼날을 아래로 밀어 약 5 ㎜ 떨어져 뇌의 가장 꼬리 영역에서 최종 컷을합니다. </li><li> 옆 아가로 오스 / 뇌 블록을 설정하고 다른 뇌의 매립을 반복합니다. </li></ol> Vibratome의 트레이에 포함 된 두뇌의 5. 전송 ​​(그림 1, 5 단계) <ol><li> vibratome 트레이의 바닥에 접착제 한 방울을 추가합니다. 아가로 오스 블록 진동 블레이드의 범위 내에 위치 될 수 있도록 접착제를 놓습니다. </li><li> 주걱의 가장자리에 블록 팁의 약 50 %로, 주걱의 가장자리에 아가로 오스 / 뇌 블록 꼬리 쪽을 아래로 놓습니다. </li><li> 접착제에 아가로 오스 블록의 꼬리의 얼굴을 적용하고의와 트레이의 바닥에 아가로 오스 블록을 유지, 멀리 주걱을 밀어핀셋의 houlder. 주걱 직접 접착제를 문의하게하지 마십시오. </li><li> 접착제는 5 분 동안 실온에서 고화하자. </li></ol> 임베디드 두뇌의 6. 단면 (그림 1, 6 단계) <ol><li> HBSS와 vibratome 트레이를 기입하십시오. </li><li> vibratome 블레이드의 시작과 끝 위치를 정의합니다. </li><li> 250 μm의 조각 - (200)를 생성합니다. - 4, 주파수 8 속도 2 : VT1000s의 vibratome으로, 다음과 같은 매개 변수를 사용합니다. </li><li> 그들이 잘리는으로 조심스럽게 vibratome에서 조각을 제거합니다. 전체 HBSS로 채워진 12 잘 접시에 주걱 및 핀셋의 백 엔드와 조각을 전송합니다. 또는 일부 연구자들은 핀셋 대신 붓을 사용하고 키 포인트 :. 전송하는 동안 뇌 조각이 주변의 아가로 오스에 부착 남아주의하십시오. </li></ol> 조각 7. Syto11 염색 (그림 1, 7 단계) <ol><li> 최종 농도에 Syto11 희석0.5 - 슬라이스 배양 배지에서 1 μM가 성장 인자로 보충. </li><li> 12 - 웰 플레이트의 우물에서, 37 ℃에서 1 시간 동안 염색 용액 2.5 ㎖에 하나의 머리에서 조각을 품다 </li><li> 20 분을위한 솔루션을 얼룩없이 슬라이스 배지 2.5 ㎖에 조각을 씻으십시오. </li></ol> 8. 유리 바닥 접시에 조각 설치 (그림 1은, 단계 8, 9) <ol><li> 조각 당 콜라겐 솔루션을 내장의 15 μl를 준비합니다. 배 DMEM, 1 M NaOH를 9.4 μL, 그리고 H 2의 290 μL O.의 75 μL로 3 ㎎ / ㎖ 콜라겐 I 형 솔루션 375 μl를 혼합하여 1.5 ㎎ / ㎖ 콜라겐 솔루션을 준비합니다 얼음에 보관합니다. </li><li> 35mm 유리 바닥 마이크로 웰 접시의 바닥에 콜라겐 솔루션 15 μl의 드롭 놓습니다. 슬라이스의 크기와 일치하는 피펫 팁으로 깔아. </li><li> 족집게 주걱과 쌍 콜라겐의 드롭에 조각을 이동 키 포인트 :. 다른 여러 조각을 설치엔트 요리 영상에 적합한 조각을 획득 할 수있는 확률을 증가시킨다. 화면의 다른 조각을 통해 최고 &quot;대표 결과&quot;절에서 아래에 설명 된 조건에 맞는 사람을 선택합니다. </li><li> 슬라이스 5 % CO 2와 37 ° C 배양기에 그들을 전송하기 전에 실온에서 10 분 동안 품어 보자. </li><li> 20 분 후, 유리 바닥 마이크로 웰 접시에 슬라이스 문화 매체의 1.2 ML를 추가합니다. 한 번에 매체 600 μl를 추가하고 피펫 팁으로 확산. </li><li> 슬라이스의 해부학 레벨 및 무결성을 기록하는 뇌 슬라이스의 저배율 이미지를 캡처. </li></ol> 조각의 9. 라이브 영상 (그림 1, 10, 11 단계) <ol><li> 조각 라이브 영상 전에 5 % CO 2와 37 ° C에서 최소 1 시간 30 분 동안 인큐베이터에서 복구 할 수 있습니다. </li><li> Syto11가 photobleaching에 매우 경향이 있음을 염두에두고 선택의 현미경 이미지 조각. 인버 여기에테드 회전 디스크 공 초점 현미경 (도르 XD 혁명 회전 디스크 공 초점 현미경)을 사용합니다. 대안 적으로 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 사용할 수있다. 다음 매개 변수는 회전 디스크 현미경 셋업에 대한 것입니다. </li><li> 전체 라이브 영상 세션 동안, 37 ° C, 현미경에 부착 된 가습 배양 챔버에서 5 % CO 2에서 조각을 유지한다. </li><li> 300 ㎛의 작동 거리와 60X 실리콘 오일 목적 및 1.3의 개구와 이미지 세포 (예도 3B, 3C, 3E, 3F, 4A를 참조하십시오 4B). 130 ㎛의 작동 거리 및 1.4의 개구 수 100X 유 목적 (예를 들어도 4C 참조)를 사용할 수도있다. 카메라의 해상도는 512 X 512입니다. </li><li> 약 40 μm의 조각의 표면 아래에있는 Z-스택의 센터와 30 μM의 Z-스택의 이미지 세포. 조직에 깊이 이미지에 노력하는 것은 목적이 추가 될 수 있습니다슬라이스 기계적인 압력. 이것은 뇌 조각의 무결성에 영향을 미칠 수 있습니다. 계획은 세포의 3 차원 복원을 할 경우, 더 이상 2 ㎛ 이하의 Z-간격을 사용합니다. </li><li> 광표백을 제한하기 위해, 레이저 파워 및 노출 시간을 조정한다. 30 Syto11 신호의 강도에 따라 200 밀리 초에 이르기까지 노출 시간을 사용합니다. </li><li> 자동화 된 단계로, 여러 조각을 통해 이미지를 여러 위치는 1 접시에 장착. 1 하나의 접시에 4 개의 조각에 흩어져있는 20 위치로 예를 들어, 이미지까지. </li><li> 라이브 영상의 경우, 유사 분열의 다른 단계의 식별을 가능하게하여 5 분 이하의 시간 해상도를 사용합니다. Syto11 및 / 또는 히스톤 H2B-EGFP를 사용하여, 4 - 실시간 이미징 5 시간은 유사 분열 세포의 상당수를 관찰하기에 충분하다. 영상은 띄엄 띄엄 (예 : 자궁 일렉트로에 의해 달성 된 것과 같은) 유사 분열 세포를 표시하는 경우에는, 다음, 더 이상 이미징 매개 변수 (야간) 적절한 지와 우리 작품LL. 참고 :이 프로토콜을 사용하여, 우리는 일반적으로 위치 당 평균 10 유사 분열 세포에서 관찰합니다. 전술 한 바와 같이, 영상 여러 조각을 설치는 성공적인 실험을 갖는 확률을 증가시킨다. 이 방법으로 우리는 일반적으로 Syto11 또는 히스톤 H2B-EGFP 수행 거의 모든 실험에서 유사 분열 세포를 식별합니다. </li></ol> 10. 유사 분열의 인수 후 분석 (그림 2) 이 단원의 모든 절차는 무료 오픈 소스 소프트웨어이기 때문에 유리하다 피지 (ImageJ에)에 최적화되었습니다. 기타 소프트웨어 솔루션은 Metamorph의, Imaris 및 아미라과 같은 작업을 수행 할 수 있습니다. <ol><li> 유사 분열의 식별 피지 피규어 <ol><li> &quot;hyperstack&quot;와 같은 하나의 위치에 대한 데이터 집합을 연 후, 조직과 세포를 건강하게 보이는 곳 (토론 섹션에서 기준을 참조) (스크롤 막대의 위치를 그림 2A 참조) 하나의 Z-평면을 선택합니다.그것을 확인하는 가장 쉬운 유사 분열 단계이기 때문에, anaphase를 통과 세포를 식별 할 시간적 차원에 걸쳐 이동합니다. </li><li> 세포가 유사 분열 (DNA의 응축을) 진입 시점을 확인하는 시간을 거슬러 이동합니다. 세포는 Z-평면을 가로 질러 이동할 수 있지만, 시간 해상도 앞에서 설명한 Z-스택 매개 변수는이 과정을 수 있도록 최적화되었다. </li><li> 스프레드 시트에서, 유사 분열을 입력으로 (피지 인터페이스에서 이러한 수치의 위치를 시각화하기 위해 그림 2a 참조, X, Y, Z 및 시간) 4D가 hyperstack 셀의 좌표를 기록한다. 이러한 좌표를 알고있는 것은 동일한 셀을 여러 번 계산하는 것을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 시간을 앞으로 이동하고 셀이 하나의 단계에서 다른 진행 할 때 시간을 기록. 하나의 특정 셀에 대한 각각의 유사 분열 단계의 기간을 문서화합니다. </li><li> 전체 데이터 집합을 통해 다른 세포 (내부 및 위치에서 여러 세포)를 진행합니다. </li></ol></li><li> 3D 재구성세포의 이온 메타 페이즈 동안 회전의 정량 (하이다르 등 2003에서 적응) (그림 2B). <ol><li> 중기의 시작까지 여러 유사 분열 세포를 식별 한 후, 셀의 좌표를 사용하여 시간에 순방향 스크롤. </li><li> 심실 테두리 ( &quot;이미지 / 변환 / 회전 ...&quot;명령을 사용하여) 평면이되도록 전체 &quot;hyperstack&quot;을 돌립니다. 이 회전을 적용 할 각도를 결정하기 위해 &quot;각도&quot;도구를 사용합니다. </li><li> 그 세포가 가장 눈에 띄는 곳은 z 평면을 확인합니다. 비행기에서 전체 셀을 포함하는 선택 영역을 그릴 &quot;사각형 선택&quot;도구를 사용합니다. </li><li> 관심의 세포를 포함하는 Z-평면을 확인합니다. &quot;하위 스택&quot;을 만들기 위해 &quot;이미지 / 중복&quot;명령을 사용하십시오. 대화 상자에서 확인 &quot;중복 hyperstack&quot;남긴다. &quot;슬라이스 (Z)는&quot;파라미터를 포함한 전체 CE Z-평면에 상당LL 및 &quot;액자 (t)가&quot;파라미터는 현재의 시점에 대응한다. </li><li> 해상도가 불량 인 경우, &quot;이미지 / 조정 / 크기 ...&quot;명령을 사용하여 &quot;서브 - 스택&quot;의 크기를 증가시킨다. </li><li> &quot;Image/Stacks/3D 프로젝트&quot;명령을 이용하여 현재 시점에서 셀의 3D 재구성을 생성한다. 이 명령에 대한 매개 변수는 그림 (b)에 표시됩니다. &quot;조각의 간격은&quot;Z-평면 이미지 (μm의)의 각 사이의 간격에 해당합니다. 중요 : 하위 스택의 물리적 치수 (μm의)가 보존되어 있는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 Z 차원의 화소 보간은 잘못 될 것이며, 3D 재구성은 부정확 할 것이다. </li><li> 중기 판의 가장자리를 볼 수 있도록 스크롤 막대를 사용하여 생성 된 3 차원 재구성을 돌립니다. 프레임의 수는도 3b에 설명 된 베타 각도에 대응하고,이 번호를 기록한다. 사용&quot;각도&quot;도구 &quot;분석 / 측정은 ...&quot;명령, 수평 (그림 2B) 수직 중기 판을 양분하는 선 사이의 각도를 측정합니다. 이 각도 (α)이다. </li><li> 그 셀의 모든 중기 시점에 이러한 각도를 기록한다. 시점 (t) 및 (t-1) 사이의 회전 각도 (t-1)에서 (t)에서의 각도와이 각도의 차이의 절대 값과 동일하다. </li></ol></li><li> 절단 평면의 방향을 측정 <ol><li> 중기 판의 3 차원 재구성에 대해 설명 된 지침에 따라 anaphase 동안 한 시점에서 그 셀을 재구성 3D. </li><li> 분리하는 염색체에 의해 형성되는 두 접시의 가장자리가 보일 때까지 재건을 돌립니다. </li><li> 수평 사이의 각도 (심실 단) 및 편석 염색체에 의해 형성된 두 개의 플레이트에 평행 한 선을 측정하기 위해 각 공구를 사용. 이 벽개면 (도 2c)의 각도이다. </li></ol></li><li> 영화의 생성 <ol><li> 셀은 종종 상이한 Z-평면을 가로 질러 이동함에 따라, 실시간 영상 세션 동안 셀에 의해 점유 Z-평면을 식별한다. &quot;이미지 / 스택 / Z 프로젝트 ...&quot;명령을 사용하여 이러한 Z-평면의 &quot;최대 강도 투사&quot;를 생성합니다. &quot;. TIF &#39;파일로 생성 된 스택을 저장합니다. </li><li> 피지. &quot;MOV&quot;또는 &quot;. AVI&quot;파일의 생성을위한 안정적인 플러그인을 포함하지 않는 ImageJ에의 1.45 버전에서이 파일을 엽니 다. </li><li> 당신의 다운 스트림 응용 프로그램과 호환되는 형식으로 동영상을 생성하는 ImageJ에의 명령 &quot;... /로 파일 / 저장&quot;을 사용합니다. </li></ol></li></ol>

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	<li>Gal, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+morphological+heterogeneity+of+neural+precursors+in+the+mouse+neocortical+proliferative+zones.">Molecular and morphological heterogeneity of neural precursors in the mouse neocortical proliferative zones.</a> J Neurosci. 26, 1045-1056 (2006).</li><li>Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+ventricular+zone+neural+precursors+contributes+to+neuronal+fate+diversity+in+the+postnatal+neocortex.">Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex.</a> Journal of Neuroscience. 30, 7028-7036 (2010).</li><li>Konno, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroepithelial+progenitors+undergo+LGN-dependent+planar+divisions+to+maintain+self-renewability+during+mammalian+neurogenesis.">Neuroepithelial progenitors undergo LGN-dependent planar divisions to maintain self-renewability during mammalian neurogenesis.</a> Nat Cell Biol. 10, 93-101 (2008).</li><li>LoTurco, J. J., Manent, J. -. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex.">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb Cortex. 19 Suppl 1, (2009).</li><li>Shimogori, T., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+application+with+in+utero+electroporation+in+mouse+embryonic+brain.">Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain.</a> Dev Growth Differ. 50, 499-506 (2008).</li><li>Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evolution+of+the+human+neocortex.">Development and evolution of the human neocortex.</a> Cell. 146, 18-36 (2011).</li><li>Englund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+Tbr1+are+expressed+sequentially+by+radial+glia,+intermediate+progenitor+cells,+and+postmitotic+neurons+in+developing+neocortex.">and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex.</a> Journal of Neuroscience. 25, 247-251 (2005).</li><li>Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+derived+from+radial+glial+cells+establish+radial+units+in+neocortex.">Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex.</a> Nature. 409, 714-720 (2001).</li><li>Wang, X., Tsai, J. -. W., Lamonica, B., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+subtype+of+progenitor+cell+in+the+mouse+embryonic+neocortex.">A new subtype of progenitor cell in the mouse embryonic neocortex.</a> Nat Neurosci. 14, 555-561 (2011).</li><li>Haydar, T. F., Ang, E., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+spindle+rotation+and+mode+of+cell+division+in+the+developing+telencephalon.">Mitotic spindle rotation and mode of cell division in the developing telencephalon.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 2890-2895 (2003).</li><li>Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+cycle+of+the+pseudostratified+ventricular+epithelium+of+the+embryonic+murine+cerebral+wall.">The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall.</a> J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).</li><li>Pilaz, L. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forced+G1-phase+reduction+alters+mode+of+division,+neuron+number,+and+laminar+phenotype+in+the+cerebral+cortex.">Forced G1-phase reduction alters mode of division, neuron number, and laminar phenotype in the cerebral cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 21924-21929 (2009).</li><li>Calegari, F., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inhibition+of+cyclin-dependent+kinases+that+lengthens,+but+does+not+arrest,+neuroepithelial+cell+cycle+induces+premature+neurogenesis.">An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis.</a> J Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).</li><li>LaMonica, B. E., Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+spindle+orientation+predicts+outer+radial+glial+cell+generation+in+human+neocortex.">Mitotic spindle orientation predicts outer radial glial cell generation in human neocortex.</a> Nature Communications. 4, 1665 (2013).</li><li>Postiglione, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Inscuteable+Induces+Apical-Basal+Spindle+Orientation+to+Facilitate+Intermediate+Progenitor+Generation+in+the+Developing+Neocortex.">Mouse Inscuteable Induces Apical-Basal Spindle Orientation to Facilitate Intermediate Progenitor Generation in the Developing Neocortex.</a> Neuron. 72, 269-284 (2011).</li><li>Silver, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exon+junction+complex+component+Magoh+controls+brain+size+by+regulating+neural+stem+cell+division.">The exon junction complex component Magoh controls brain size by regulating neural stem cell division.</a> Nat Neurosci. 13, 551-558 (2010).</li><li>Pulvers, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+mouse+Aspm+(abnormal+spindle-like+microcephaly+associated)+cause+not+only+microcephaly+but+also+major+defects+in+the+germline.">Mutations in mouse Aspm (abnormal spindle-like microcephaly associated) cause not only microcephaly but also major defects in the germline.</a> Proc Natl Acad Sci USA. , 107-16595 (2010).</li><li>Feng, Y., Walsh, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+spindle+regulation+by+Nde1+controls+cerebral+cortical+size.">Mitotic spindle regulation by Nde1 controls cerebral cortical size.</a> Neuron. 44, 279-293 (2004).</li><li>Megraw, T. L., Sharkey, J. T., Nowakowski, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdk5rap2+exposes+the+centrosomal+root+of+microcephaly+syndromes.">Cdk5rap2 exposes the centrosomal root of microcephaly syndromes.</a> Trends Cell Biol. 21, 1-11 (2011).</li><li>Bond, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+centrosomal+mechanism+involving+CDK5RAP2+and+CENPJ+controls+brain+size.">A centrosomal mechanism involving CDK5RAP2 and CENPJ controls brain size.</a> Nat Genet. 37, 353-355 (2005).</li><li>Shu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doublecortin-like+kinase+controls+neurogenesis+by+regulating+mitotic+spindles+and+M+phase+progression.">Doublecortin-like kinase controls neurogenesis by regulating mitotic spindles and M phase progression.</a> Neuron. 49, 25-39 (2006).</li><li>Nelson, B. R., Hodge, R. D., Bedogni, F., Hevner, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Interactions+between+Intermediate+Neurogenic+Progenitors+and+Radial+Glia+in+Embryonic+Mouse+Neocortex:+Potential+Role+in+Dll1-Notch+Signaling.">Dynamic Interactions between Intermediate Neurogenic Progenitors and Radial Glia in Embryonic Mouse Neocortex: Potential Role in Dll1-Notch Signaling.</a> Journal of Neuroscience. 33, 9122-9139 (2013).</li><li>Hu, D. J. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+recruitment+to+nuclear+pores+activates+apical+nuclear+migration+and+mitotic+entry+in+brain+progenitor+cells.">Dynein recruitment to nuclear pores activates apical nuclear migration and mitotic entry in brain progenitor cells.</a> Cell. 154, 1300-1313 (2013).</li><li>Noctor, S. C., Mart&#237;nez-Cerde&#241;o, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases.">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nature Publishing Group. 7, 136-144 (2004).</li><li>Tyler, W. A., Haydar, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Genetic+Fate+Mapping+Reveals+a+Novel+Route+of+Neocortical+Neurogenesis,+Which+Is+Altered+in+the+Ts65Dn+Mouse+Model+of+Down+Syndrome.">Multiplex Genetic Fate Mapping Reveals a Novel Route of Neocortical Neurogenesis, Which Is Altered in the Ts65Dn Mouse Model of Down Syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 33, 5106-5119 (2013).</li><li>Noctor, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Lapse+Imaging+of+Fluorescently+Labeled+Live+Cells+in+the+Embryonic+Mammalian+Forebrain.">Time-Lapse Imaging of Fluorescently Labeled Live Cells in the Embryonic Mammalian Forebrain.</a> CSH Protoc. , (2011).</li><li>Elias, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+culture+of+E18+rat+brains.">Organotypic slice culture of E18 rat brains.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).</li><li>Shitamukai, A., Konno, D., Matsuzaki, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oblique+radial+glial+divisions+in+the+developing+mouse+neocortex+induce+self-renewing+progenitors+outside+the+germinal+zone+that+resemble+primate+outer+subventricular+zone+progenitors.">Oblique radial glial divisions in the developing mouse neocortex induce self-renewing progenitors outside the germinal zone that resemble primate outer subventricular zone progenitors.</a> Journal of Neuroscience. 31, 3683-3695 (2011).</li><li>Hadjantonakis, A. -. K., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+in+vivo+imaging+and+cell+tracking+using+a+histone+fluorescent+protein+fusion+in+mice.">Dynamic in vivo imaging and cell tracking using a histone fluorescent protein fusion in mice.</a> BMC Biotechnol. 4, 33 (2004).</li><li>Higginbotham, H., Bielas, S., Tanaka, T., Gleeson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mouse+line+with+green-fluorescent+protein-labeled+Centrin+2+allows+visualization+of+the+centrosome+in+living+cells.">Transgenic mouse line with green-fluorescent protein-labeled Centrin 2 allows visualization of the centrosome in living cells.</a> Transgenic Res. 13, 155-164 (2004).</li><li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos.">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240, 237-246 (2001).</li><li>Yang, Y. -. T., Wang, C. -. L., Van Aelst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOCK7+interacts+with+TACC3+to+regulate+interkinetic+nuclear+migration+and+cortical+neurogenesis.">DOCK7 interacts with TACC3 to regulate interkinetic nuclear migration and cortical neurogenesis.</a> Nat Neurosci. 15, (2012).</li><li>Siegenthaler, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+Acid+from+the+meninges+regulates+cortical+neuron+generation.">Retinoic Acid from the meninges regulates cortical neuron generation.</a> Cell. 139, 597-609 (2009).</li><li>Schenk, J., Wilsch-Br&#228;uninger, M., Calegari, F., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+II+is+required+for+interkinetic+nuclear+migration+of+neural+progenitors.">Myosin II is required for interkinetic nuclear migration of neural progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 16487-16492 (2009).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해가없는 선언합니다.

우리가 기술 한 프로토콜의 주요 장점은 신경 전구 세포의 유사 분열의 동적 시간 해상도를 제공하는 것입니다. 일반적으로, 두뇌 개발에 유사 분열을 시각화 분석은 고정 된 조직 절편의 면역을 사용하여 수행됩니다. 그러나이 방법은 한 시점에서 유사 분열의 스냅 샷을 제공한다. 뇌 조각의 유사 분열 이미징을위한 가장 중요한 몇 가지 단계가 있습니다 : 1) 뇌 조각은 전송...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 배아 뇌 조각에 신경 전구 세포의 유사 분열의 라이브 영상을 수행하는 방법을 설명하는 것입니다. 문화 뇌 조각의 라이브 영상을 사용하여,이 프로토콜은 생체 설정에 매우 유사한 환경에서 신경 전구 세포에서 유사 분열의 여러 측면을 검정하는 간단한 방법을 제공한다. 그것은) 자궁 일렉트로에 1-5을 조작 한 돌연변이 동물 및 / 또는 뇌의 두뇌에 적용 할 수 있습니다. 이 기술은 단순히 배지에 제를 첨가함으로써, 신경 전구체 &#39;에 유사 분열되는 약물의 효과를 시험하는 것이 이상적이다. 결론적으로,이 문서가 신경을 공부하는 사람들에게 기술적으로 도전적인 프로토콜에 액세스 할 수 있도록합니다. 신경 동안 별개의 신경 전구 인구는 결국 6-8 신피질 성인의 여섯 대뇌 피질의 층에 기여하는 신경 세포를 생성하는 정확한 분열을 받다. neuroepithelial (NE) 세포가 자기 갱신에 대칭 적 분할로 초기 대뇌 피질의 개발, 신경 전구체 풀을 확장합니다. NE 세포는 레이디 얼 glial 세포 (망막 신경절)로 변환합니다. 초기 망막 신경절 그러나 신경의 대부분 동안, 분열의 망막 신경절의 주요 모드 비대칭, 두 개의 새로운 망막 신경절을 생산하기 위해 대칭 적으로 나눕니다. 비대칭 부문에서 1 RGC는 새로운 RGC와 하나 후 유사 분열 신경 세포, 또는보다 전문적인 전구 (하나 짧은 신경 전구체 (SNP), 바깥 지​​름의 아교 (ORG), 또는 중간 전구 (INP)에 상승을 제공합니다 2,3,7,9. INPS, SNP를, 그리고 개 기관은 다음 하위 심실, 심실에 신경을 생성 할 수 있고, 대뇌 피질의 기초 영역은 각각. 따라서, 전구 세포의 세포 분열은의 신경 세포를 생성하는 기본 과정이다 신피질. 많은 연구는 특정 유사 분열 망막 신경절의 특성과 딸 세포의 운명 사이의 상관 관계를 가리 킵니다. 하이다르 등.와 다카하시 외 여러분.RGC의 유사 분열의 기간과 신경이 진행됨에 따라 세포주기의 길이 증가, 발견은 연구 10-13를 따라있는 에코 것으로 나타났습니다. 연구의 수는 심실에 방추사 방향의 상대는 각각 뇌에서 생성 된 신경 세포의 종류와 자손의 위치, 3,10,14-16 등의 신경과 corticogenesis의 측면을, 영향을 미치는 것을 제안했습니다. 절단 평면 방향이 직접 세포의 운명에 영향을 미치는 여부는 논란의 여지가 있지만, 결론은이 유사 분열 매개 변수의 영향을 신경 남아있다. 또한 유사 분열의 중요성을 강조하는 것은 유사 분열의 메커니즘에 관련된 많은 유전자가 신경에 대한 적절한 뇌 발달에 중요한 17-20 있다는 관측이다. 유사 분열은 역동적 인 과정입니다, 아직 날짜에 신경 전구 세포의 유사 분열을 자세히 대부분의 연구는 체외 세포 배양을 통해 고정 된 조직 절편 또는 신경 전구 세포의 이미지 분석을 이용. 따라서, 유사 분열을 평가하는 주류의 방법은이 프로세스의 스냅 샷을 제공하고 세포 조직에서 행동하는 방법을 발견하지 못한다. 신경 전구 세포의 유사 분열의 라이브 영상은 점점 더 신경 전구의 기능을 이해하기위한 중요한 도구가되고있다. 예를 들어 이러한 참조를 참조하십시오 4,8,10,21-25. 몇 가지 눈에 띄는 프로토콜은 준비와 뇌 조각 (26, 27)의 영상에 발표되었다. 그러나 현재까지, 이미징 및 유사 분열의 분석을위한 포괄적 인 프로토콜은 설명되지도 비디오에서 보여 주었다. 이 기술은 뇌 부분의 고정 분석을 통해 몇 가지 중요한 이점을 제공합니다. 뇌 조각의 시간 경과 분석은 유연한 방식으로 분석 할 수있는 훨씬 더 많은 데이터 포인트의 생성을 가능하게한다. 첫째, 데이터는 몇 분 또는 몇 시간의 과정을 통해 각각의 시점에서 수집됩니다. 하나는 각각의 시점 (정적 몽타주를 만들려면) 또는 분석 할 수 있습니다영화로 서로 다른 시간의 포인트를 결합 할 수 있습니다. 둘째, 조각 공 촛점 이미징은 뇌 조각의 다른 Z 섹션에서 데이터의 생성을 가능하게한다. 결과적으로, 각각의 섹션은 분석 될 수있다. 또한, 개별 섹션의 스택은 최대 강도 투사로 결합 할 수 있습니다. 셋째, 분석 세포는 이웃 세포와 구조를 기준으로 분할하는 방법을 공개, 조직의 맥락에서 이루어집니다. 넷째, 이상적으로 유사 분열 결함의 증거를 보여 돌연변이의 분석에 적합합니다. 함께이 프로토콜은 자신의 실험실에서 신경 전구 세포의 유사 분열의 라이브 영상을 수행하고자하는 연구자를 지원하기 위해 중요한 단계를 명확히하는 데 도움이 될 것이다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:739px;" width="738">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:143px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:261px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100X N2</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>17502048</td>
			<td style="width:261px;">for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50X B27 without vitamin A</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>12587010</td>
			<td style="width:261px;">for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11320033</td>
			<td style="width:261px;">for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heat-inactivated horse serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H1138-500ml</td>
			<td style="width:261px;">for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heat-inactivated calf serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F4135-500ML</td>
			<td style="width:261px;">for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FGF</td>
			<td>R&#38;D Sytems</td>
			<td>3139-FB-025</td>
			<td style="width:261px;">for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:261px;">for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10X HBSS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14065-056</td>
			<td style="width:261px;">for the dissection of the embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hepes Free Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;H4034</td>
			<td style="width:261px;">dilute to 1M (pH7.4)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2.5M D-Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8769</td>
			<td style="width:261px;">for the dissection of the embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.9M NaHC03</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>25080-094</td>
			<td style="width:261px;">for the dissection of the embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">low-melting agarose</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>BP165-25</td>
			<td style="width:261px;">for generating slices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Loctite 404 glue</td>
			<td>Loctite 404</td>
			<td>46551</td>
			<td style="width:261px;">keep at 4&#730;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">syto11</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>S7573</td>
			<td style="width:261px;">Make 5&#181;l aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3 mg/ml collagen type I&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A1048301</td>
			<td style="width:261px;">for culturing slices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td style="width:261px;">for culturing slices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:261px;">for dissection of the embryos</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">digital thermometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:261px;">to measure the temperature of the agarose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:261px;">to transfer brains</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">paintbrush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:261px;">alternative to transfer brains</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000s</td>
			<td style="width:261px;">for generating slices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:261px;">dissecting out embryos</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">imaging microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:261px;">A confocal microscope is required, it needs to be equipped with an incubation chamber</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex

짧은 기간이지만, 유사 분열은 뇌를 포함한 장기의 개발을위한 기초 복잡하고 역동적 인 여러 단계의 프로세스입니다. 개발 대뇌 피질에서 신경 전구 세포의 비정상적인 분열이 뇌의 크기와 기능에 결함을 일으킬 수 있습니다. 따라서, 신경 전구 세포의 유사 분열의 메커니즘을 이해하는 도구를위한 중요한 필요가있다. 쥐의 대뇌 피질의 발달 과정을 연구하기위한 뛰어난 모델입니다. 신경 전구 세포의 유사 분열은 일반적으로 고정 된 뇌 부분에서 검토된다. 이 프로토콜은 자세히 생체 배아 뇌 조각의 유사 분열의 라이브 영상에 대한 접근 방법을 설명합니다. 뇌 추출, 뇌 매립, 뇌 조각의 vibratome 절편, 염색과 조각의 배양 및 시간 경과 영상 : 우리는 포함하는이 절차의 중요한 단계를 설명합니다. 우리는 그 입증하고 유사 분열의 취득 후 분석을 수행하는 방법에 대해 자세히 설명합니다. 우리는 대표적인 결과의 fr을톰 중요한 염료 Syto11, 형질 전환 마우스 (히스톤 H2B-EGFP와 centrin-EGFP), 및 자궁 일렉트로에 (mCherry-α-튜 불린)를 사용하여이 분석. 우리는이 방법이 가장 최적화 할 수있는 방법과 유사 분열의 유전자 규제의 연구를 위해 수정하는 방법을 설명합니다. 뇌 조각에서 유사 분열의 라이브 영상은 제어 된 환경에서 연령, 해부학 적 및 유전 적 교란의 영향을 평가하기 위해, 높은 공간적 해상도를 가진 많은 양의 데이터를 생성하는 유연한 방법이다. 따라서이 프로토콜은 신경 전구 세포의 유사 분열의 분석을 위해 기존 도구를 보완합니다.

이 분석의 성공과 하나의 라이브 영상 세션 동안 여러 유사 분열 세포의 관찰은 크게 무결성 및 인수가 만든 조각의 해부학 적 수준의 양에 따라 다릅니다. 아래에 설명 된 바와 같이, 슬라이스의 해부학 적 수준은 중요한 요소입니다. 그림 3a는 rostro - 꼬리를 보여줍니다 내측 - 외측 우리가 가장 성공적이었다 위치. 이 주제의 자세한 설명은 Noctor 26를 참조하십시오. 슬라이스?...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex at JoVE.com

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

신경 전구 세포의 유사 분열은 신경의 중요한 매개 변수입니다. 신경 전구 세포의 유사 분열에 대한 우리의 이해의 대부분은 고정 된 조직의 분석을 기반으로합니다. 배아 뇌 조각의 라이브 영상은 통제 된 환경에서 높은 공간적 해상도로 유사 분열을 평가하기 위해 다양한 기술입니다.

개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

live-imaging-of-mitosis-in-the-developing-mouse-embryonic-cortex

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.2K 조회수.  Duke University Medical Center.  신경 전구 세포의 유사 분열은 신경의 중요한 매개 변수입니다. 신경 전구 세포의 유사 분열에 대한 우리의 이해의 대부분은 고정 된 조직의 분석을 기반으로합니다. 배아 뇌 조각의 라이브 영상은 통제 된 환경에서 높은 공간적 해상도로 유사 분열을 평가하기 위해 다양한 기술입니다. 

비디오: Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Thinned - 해골 준비를 사용하여 마우스 시각 피질의 만성 이미징

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

연구

신경과학

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

여러 마우스 Neuroanatomical 자기 공명 영상

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

개발 Zebrafish Forebrain에 Clonally 관련 신경 전구 세포의 시간 경과 라이브 영상

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

개발 Neuroepithelium의 세포 문제의 고해상도 라이브 영상

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 시닝 두개골 준비를 사용하여 마우스 피질 돌기 쪽의 영상

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various neurological deficits. The current ex vivo live imaging of motile ependymal cilia technique allows for a detailed study of ciliary dynamics following several steps. These steps include: mice euthanasia with carbon dioxide according to protocols of The University of Toledo&#8217;s Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC); craniectomy followed by brain removal and sagittal brain dissection with a vibratome or sharp blade to obtain very thin sections through the brain lateral ventricles, where the ependymal cilia can be visualized. Incubation of the brain&#8217;s slices in a customized glass-bottom plate containing Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)/High-Glucose at 37 &#176;C in the presence of 95%/5% O2/CO2 mixture is essential to keep the tissue alive during the experiment. A video of the cilia beating is then recorded using a high-resolution differential interference contrast microscope. The video is then analyzed frame by frame to calculate the ciliary beating frequency. This allows distinct classification of the ependymal cells into three categories or types based on their ciliary beating frequency and angle. Furthermore, this technique allows the use of high-speed fluorescence imaging analysis to characterize the unique intracellular calcium oscillation properties of ependymal cells as well as the effect of pharmacological agents on the calcium oscillations and the ciliary beating frequency. In addition, this technique is suitable for immunofluorescence imaging for ciliary structure and ciliary protein localization studies. This is particularly important in disease diagnosis and phenotype studies. The main limitation of the technique is attributed to the decrease in live motile cilia movement as the brain tissue starts to die.

Using high-resolution differential interference contrast (DIC) microscopy, an ex vivo observation of the beating of motile ependymal cilia located within the mouse brain ventricles is demonstrated by live-imaging. The technique allows a recording of the unique ciliary beating frequency and beating angle as well as their intracellular calcium oscillation pacing properties.

마우스 뇌의 좌우 심실의 뇌실막 섬모의 라이브 영상

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

동시에 두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 마우스 Retrosplenial 코어 텍스에서 시냅틱 입력의 이미징 및 시냅스 대상

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

2D 문화 시스템을 사용 하 여 기본 대뇌 피 질 세포의 영상 라이브

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate tangentially from their place of origin in the ventral telencephalon (including from the medial and caudal ganglionic eminences (MGE, CGE)) to the dorsal cortical plate in response to a variety of intrinsic and extrinsic cues. Different methodologies have been developed over the years to genetically manipulate specific pathways and investigate how they regulate the dynamic cytoskeletal changes required for proper IN migration. In utero electroporation has been extensively used to study the effect of gene repression or overexpression in specific IN subtypes while assessing the impact on morphology and final position. However, while this approach is readily used to modify radially migrating pyramidal cells, it is more technically challenging when targeting INs. In utero electroporation generates a low yield given the decreased survival rates of pups when electroporation is conducted before e14.5, as is customary when studying MGE-derived INs. In an alternative approach, MGE explants provide easy access to the MGE and facilitate the imaging of genetically modified INs. However, in these explants, INs migrate into an artificial matrix, devoid of endogenous guidance cues and thalamic inputs. This prompted us to optimize a method where INs can migrate in a more naturalistic environment, while circumventing the technical challenges of in utero approaches. In this paper, we describe the combination of ex utero electroporation of embryonic mouse brains followed by organotypic slice cultures to readily track, image and reconstruct genetically modified INs migrating along their natural paths in response to endogenous cues. This approach allows for both the quantification of the dynamic aspects of IN migration with time-lapse confocal imaging, as well as the detailed analysis of various morphological parameters using neuronal reconstructions on fixed immunolabeled tissue.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Here, we provide a low-cost and reliable method to generate electroporated brain organotypic slice cultures from mouse embryos suitable for confocal microscopy and live-imaging techniques.

전 Utero Electroporation 및 마이그레이션 GABAergic 수의 라이브 이미징 배아 마우스 두뇌의 Organotypic 조각 문화

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...

Non-Invasive Modulation and Robotic Mapping of Motor Cortex in the Developing Brain

Mapping the motor cortex with transcranial magnetic stimulation (TMS) has potential to interrogate motor cortex physiology and plasticity but carries unique challenges in children. Similarly, transcranial direct current stimulation (tDCS) can improve motor learning in adults but has only recently been applied to children. The use of tDCS and emerging techniques like high&#8211;definition tDCS (HD-tDCS) require special methodological considerations in the developing brain. Robotic TMS motor mapping may confer unique advantages for mapping, particularly in the developing brain. Here, we aim to provide a practical, standardized approach for two integrated methods capable of simultaneously exploring motor cortex modulation and motor maps in children. First, we describe a protocol for robotic TMS motor mapping. Individualized, MRI-navigated 12x12 grids centered on the motor cortex guide a robot to administer single-pulse TMS. Mean motor evoked potential (MEP) amplitudes per grid point are used to generate 3D motor maps of individual hand muscles with outcomes including map area, volume, and center of gravity. Tools to measure safety and tolerability of both methods are also included. Second, we describe the application of both tDCS and HD-tDCS to modulate the motor cortex and motor learning. An experimental training paradigm and sample results are described. These methods will advance the application of non-invasive brain stimulation in children.

We demonstrate protocols for the modulation (tDCS, HD-tDCS) and mapping (robotic TMS) of the motor cortex in children.

개발 뇌에서 모터 피질의 비 침습적 변조 및 로봇 매핑

Mapping the motor cortex with transcranial magnetic stimulation (TMS) has potential to interrogate motor cortex physiology and plasticity but carries ...