이 프로토콜은 비교적 빠르고 비용 효율적인 방법뿐만 아니라 자동화된 획득 및 분석을 제공하여 일반적인 후성유전학적 바이오마커인 5-메틸시토신의 저감도 스크리닝을 생성합니다. 이 기술의 주요 장점은 사용자가 모델 및 개발 단계에 맞게 최적화 할 수있는 실험 설계를 제공하는 유연성에 있습니다. 이 기술은 화학 물질 노출이 일반적으로 시퀀싱과 같은 값 비싼 높은 trpA 방법을 통해서만 수행 할 수있는 개발 유기체 내에서 5- 메틸 시토신의 상대적 풍부도를 어떻게 변화시키는 지 감지하는 데 사용할 수 있습니다.
이 방법은 환경 자극에 대한 반응으로 5- 메틸 시토신의 후성 유전 적 변화를 이해하기 위해 NCG 방법을 활용하는 것을 목표로하는 모든 연구에 유용합니다. 수집 아침에 신선한 노출 용액을 준비하는 것으로 시작하십시오. 60mm 유리 페트리 접시에 미립자가 없는 시스템 물 5밀리리터를 추가합니다.
그런 다음 10 마이크로리터 마이크로 모세관 유리 피펫을 사용하여 10 마이크로리터의 디메틸 설폭사이드 또는 화학 원액을 시스템 용수로 옮깁니다. 유리 페트리 접시를 소용돌이 치면 저장 용액이 사라집니다. 유리 페트리 접시에 5 밀리리터의 시스템 수를 더 넣고 접시를 소용돌이 치며 노출 용액을 균질화합니다.
증발을 최소화하기 위해 유리 뚜껑으로 유리 접시를 덮으십시오. 다음으로 RO 물이 채워진 분출 병을 사용하여 어망에서 배아를 100mm 접시로 옮깁니다. 수정 후 0.75 시간에 50 개의 살아있는 배아를 무작위로 분류하고 과도한 RO 물을 제거합니다.
노출 기간이 끝나면 인큐베이터에서 배아를 제거하십시오. 모든 살아있는 배아를 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮깁니다. 배아를 흡인하지 않고 잔류 노출 용액을 흡인합니다.
500 마이크로 리터의 냉장 된 4 % 파라 포름 알데히드를 넣고 배아를 반전시켜 여러 번 혼합하십시오. 배아가 섭씨 4도에서 밤새 고정되고 4%파라포름알데히드가 되도록 합니다. 배아를 고정한 후 4% 파라포름알데히드를 흡인하고 배아를 1X PBS에 다시 보내고 30초 동안 부드러운 피펫팅으로 혼합합니다.
유리 피펫을 사용하여 고정 된 배아를 RO 물이 채워진 유리 접시에 조심스럽게 옮깁니다. 30초 동안 부드럽게 소용돌이치고 이 세척을 한 번 반복합니다. 5배 배율로 설정된 실체 현미경으로 주사기 바늘을 사용하여 배아를 디코레이트합니다.
바늘 끝을 사용하여 chorion을 뚫고 노른자와 세포 덩어리에서 부드럽게 떼어냅니다. 배아를 장식한 후 유리 마이크로 모세관 피펫을 사용하여 최대 25개의 온전한 배아를 하나의 면역조직화학 바구니에 옮깁니다. IHC 바스켓을 24웰 플레이트에 넣습니다.
그런 다음 각 우물에서 물을 흡입하십시오. 배아를 웰당 500마이크로리터의 블로킹 버퍼에 재현탁하고 플레이트를 파라폼과 알루미늄 호일로 감싸 빛으로부터 보호합니다. 플레이트를 섭씨 4도에서 100rpm의 오비탈 쉐이커 상에서 4시간 동안 배양한다.
배양 후, 각 웰로부터 블로킹 완충액을 흡인한다. 500 마이크로 리터의 1 차 항체 용액으로 교체하십시오. 배경 소음을 설명하기 위해 차단 버퍼와 함께 차량 제어 배아의 하위 집합을 배양하는 것을 잊지 마십시오.
플레이트와 파라폼 및 알루미늄 호일을 다시 감싸고 플레이트가 궤도 셰이커에서 밤새 섭씨 4도에서 배양되도록 합니다. 다음날 각 웰에서 1차 항체 용액을 제거하고 1x PBST로 교체합니다. 오비탈 셰이커에서 세척할 때마다 5분 동안 1x PBST로 각 웰을 세 번 세척합니다.
각 웰에서 1x PBST를 흡입하고 IHC 바스켓을 RO 물로 채워진 유리 페트리 접시에 넣습니다. 표준 실체 현미경에서 손상되지 않은 배아를 무작위로 96웰 플레이트로 분류하여 웰당 하나의 배아를 보장합니다. 그런 다음 개별 웰에서 모든 RO 물을 제거하고 200 마이크로 리터의 1x PBS를 추가하십시오.
플레이트를 투과광 및 FITC하에서 2배 목적물로 배아를 하나의 G.Image 에서 3분 동안 원심분리한다. 자동 초점을 선택하여 카메라의 초점이 플레이트 하단에 있고 하단 두께만큼 오프셋되도록 합니다. 노출 지속 시간이 100밀리초인 FITC 파장을 선택하고 Z 오프셋이 있는 레이저로 자동 초점을 설정합니다.
플레이트 획득을 시작하기 전에 적절한 이미지 획득과 여러 웰을 관찰하고 확인합니다. 이미지 획득 후 고함량 스크리닝 시스템과 맞춤형 자동 이미지 분석 절차를 사용하여 데이터 분석을 수행합니다. 96웰 플레이트에서 각 배아를 선택하여 형광의 전체 면적 및 통합 강도를 분석합니다.
그런 다음 데이터 포인트를 표로 만들고 측정으로 이동하고 오픈 데이터 로그를 선택하여 데이터를 스프레드시트로 내보내는 고함량 스크리닝 시스템에서 내보냅니다. 내보낸 스프레드시트를 배치자 패키지에 업로드하여 각 웰에 대한 데이터를 정렬 및 합산하고 웰 번호별로 필터링합니다. 그런 다음 올바른 Excel 패키지를 사용하여 합산 된 데이터를 스프레드 시트로 내 보냅니다.
5- 메틸 시토신 특이적 총 면적의 분포 및 통합 강도는 수정 후 6 시간에 제브라 피쉬 배아에 대해 평가되었습니다. x축은 DMSO를 비히클로 또는 TDCIPP를 양성 대조군으로 노출한 것을 보여줍니다. Y축은 상대 형광을 나타냅니다.
역치는 배아 내에서 검출된 5-메틸시토신의 총 면적과 최대 신호 대 잡음비를 나타내는 동일한 영역 내의 통합 강도로 표시된 바와 같이 비히클 처리된 배아와 유의하게 달랐습니다. 적절한 IHC 검출을 위해 요크 및 세포 질량의 무결성을 유지하는 것이 매우 중요합니다. 이 방법은 상대적으로 둔감하며 상대적인 풍부한 RFU 데이터만 제공합니다.
정량화가 필요한 경우 보다 표적화된 접근 방식으로 후속 조치를 취할 수 있습니다.
