우리의 방법은 평균 생화학자가 고정 금속 친화성 크로마토그래피를 사용하여 격리된 시료가 전이 금속으로 오염되는지 신속하게 결정할 수 있기 때문에 중요합니다. 가장 큰 장점은 분석이 수행 될 수있는 용이성입니다. 분석법은 대부분의 생화학 실험실에 공통적인 계측및 기술을 사용하며 쉽고 신속하게 구현할 수 있습니다.
이 문서에서는 니켈-NTA 열로 격리된 샘플에 대해 이 방법을 적용하지만, 이 방법은 다른 금속 친화성 수지와 함께 사용할 수 있습니다. 처음 사용자는 알려진 농도의 니켈 재고 솔루션으로이 방법을 시도해야합니다. 이렇게 하면 스펙트럼 변경에 표시된 워크플로, 샘플 색상 및 수지를 숙지합니다.
절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 기술자 인 Cole Swain이 될 것입니다. 시작하려면 UV-Vis 분광포토미터를 켜고 따뜻하게 합니다. 단백질을 정량화하기 위해 280 나노미터의 광학 흡광도를 가진 다이오드 어레이 UV-Vis 분광계를 사용하여 분석할 크로마토그래피 분획을 결정합니다.
트리스, HEPES, MOPS 및 인산염 버퍼와 같은 7 및 12 사이의 PH를 사용하여 10 에서 100 밀리머 샘플 버퍼를 가져옵니다. 준비된 스톡 솔루션의 각 밀리리터에 대해 120밀리그램의 HNB 시약을 사용하여 샘플 버퍼에서 HNB 분산의 부피 용액으로 12%의 중량을 준비합니다. 647 나노미터에서 데이터를 수집하도록 분광계를 설정합니다.
샘플 버퍼로 채워진 석영 큐벳을 사용하여 분광계를 비워 둡니까. 총 분석 부피의 밀리리터 당 HNB 주식의 50 마이크로 리터를 포함하는 큐벳에서 제어 솔루션을 준비합니다. 제어가 실온에서 최소 3분 동안 인큐베이션하도록 허용합니다.
제어 시료에 대해 647 나노미터에서 흡광도를 측정하고 기록합니다. 적절한 희석 단백질 분획 2850 마이크로리터와 HNB 스톡150 마이크로리터를 샘플 버퍼와 혼합하여 분석 샘플을 준비합니다. 샘플이 실온에서 최소 3분 동안 인큐베이션하도록 허용합니다.
측정할 각 분획에 대한 스펙트럼 기록을 반복합니다. 희석이 부족한 경우 647 나노미터의 전체 스펙트럼 대역이 사라집니다. 너무 강한 희석을 가진 동안, 견본은 대조군에서 구별할 수 없습니다.
각 샘플에서 금속의 농도를 결정하기 위해 먼저 HNB 제어에서 647 나노미터에서 각 시료 흡광도의 차이를 찾습니다. DF가 분석 분획에 대한 희석인인 공식을 이용하여 마이크로몰라의 금속 농도를 결정하고, 델타 A-B-S 647은 647나노미터에서 흡광도 변화, 3.65배 내지 음수 2는 HNB의 소멸 계수를 나타내며, l은 큐벳의 광학 경로가 센티미터에 있다. 본 연구에서는, MSP1E3D1의 분리로부터 니켈 이온에 대해 분석된 분획의 대표적인 스펙트럼에서 중립 PH에서 자유 HNB의 스펙트럼이 여기에 나와 있다.
HNB 대조군대비 647나노미터에서 감광도가 감소하여 전이 금속이 있는 HNB 복합체의 형성에 대응하는 것으로 관찰되었다. 이 분석법의 적용을 입증하기 위해, 그의 태그된 막 비계 단백질, MSP1E3D1, MSP2N2, 및 지질박터 황감소제로부터 의 소설, 3헴, c형 사이토크롬 GSU0105, 분석하였다. GSU0105에 대한 각 분획의 단백질 및 니켈 이온 함량은 서로 크게 이동되었으며, 가장 많은 단백질을 함유한 MSP1E3D1 및 MSP2N2의 분획도 니켈 함량이 가장 높았다.
또한 금속 함량이 동원된 금속 친화성 크로마토그래피를 사용하여 수집된 분수 들 사이에서 균등하게 분포되지 않을 수 있음을 보여준다. 모든 샘플에서 빈 칸을 적절하고 일관되게 혼합하고 모든 샘플의 빈 에 대해 동일한 인큐베이션 시간을 허용하는 것이 가장 중요합니다. 특별한 관심의 단백질 분획은 금속 오염을 확인하고 화학화 또는 강하게 결합된 단백질 금속 이온을 시험하기 위해 원자 흡수 분광법 또는 ICPMS로 추가로 분석될 수 있었다.
전이 금속 침출 검출 외에도 이 기술은 단백질에 전이 금속 이온의 결합 친화성을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 샘플에 존재하는 HNB 및 임의의 니켈은 각각 눈과 피부에 자극제입니다. 장갑과 눈 보호를 포함한 표준 PPE는 방법 중에 사용되어야합니다.
