이 프로토콜은 앱타머를 처음 사용하는 연구원이 프로젝트에서 앱타머를 사용하고 프로토콜을 완료하는 데 필요한 개별적인 작은 단계를 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 압타머는 매우 다재다능하며 이 프로토콜은 면역표현형 분석에서 얼마나 쉽고 간단한지를 보여줍니다. 압타머는 진단 및 치료 응용 분야 모두에 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜은 특이성과 민감도를 확인하기 위해 수행되는 첫 번째 단계입니다. 이 특정 분석은 하나의 세포 표면 수용체의 염색을 입증하지만, 앱타머는 다중 파라미터 유세포분석에 매우 쉽게 사용되어 높은 수준의 표현형 지식을 제공할 수 있습니다. 압타머 작업의 중요한 측면은 사용하기 전에 올바르게 접혀 있는지, 완충액과 이온 강도 조건이 선택되었을 때와 동일한지 확인하는 것입니다.
플라스크에서 배지를 수집하여 버린 후 PBS 3 밀리리터를 넣고 세포 위에 뿌립니다. 각 플라스크에 0.25 %의 트립신 -EDTA 1 밀리리터를 첨가 한 후 섭씨 37도에서 5-10 분 동안 배양하고 현미경으로 세포의 분리를 시각화합니다. 다음으로, 1밀리리터의 완전 배지를 세포에 추가하고 세포를 위아래로 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 만듭니다.
세포를 적절한 튜브에 피펫팅하고 200G에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 버린 후, 세포를 1 밀리리터의 새로운 배지에 재현 탁시키고 일정 부피의 세포 현탁액을 트리판 블루로 희석하여 트리판 블루 염색을 사용하여 세포를 계수합니다. 약 15 마이크로 리터의 혼합물을 혈구 측정기와 커버 글라스 사이에 분배하여 세포를 계산합니다.
필요한 수의 세포를 수집하여 테스트 샘플 당 십만 개의 세포가 있는지 확인하십시오. 그런 다음 세포를 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양하여 효소 분리 후 세포막에서 관심 단백질이 안정화되도록 합니다. 2시간 인큐베이션 후, 세포를 500 G에서 5분 동안 원심분리한다.
상청액을 버린 후, 세포를 500 마이크로리터의 블로킹 완충액에 재현탁시킨다. 간헐적 혼합으로 세포를 섭씨 4도에서 30 분 동안 배양합니다. 이 30분 배양 동안, 원고에 기재된 압타머의 두 배 농도를 준비하여 압타머 폴딩을 수행한다.
그런 다음 압타머를 빛으로부터 보호하면서 필요한 접힘 조건에 따라 압타머를 열순환기 기계와 혼합하고 배양합니다. 30분 인큐베이션 후, 이전에 입증된 바와 같이 세포를 원심분리하고 상청액을 제거하였다. 그런 다음 1 밀리리터의 세척 버퍼를 넣고 세포를 다시 원심 분리하십시오.
상청액을 제거한 후, 세포를 결합 완충액의 적절한 부피에 재현탁시킨다. 다음으로, 50 마이크로리터의 재현탁된 세포를 얼음처럼 차가운 96 웰 검정 플레이트의 각 웰에 피펫팅한다. 그런 다음 50 마이크로리터의 압타머를 50 마이크로리터 부피의 세포에 피펫팅하고, 혼합하고 섭씨 4도의 어둠 속에서 30분 동안 배양한다.
원심분리하고 상청액을 제거한 후, 펠릿을 세척 완충액에 조심스럽게 재현탁시키고 다시 500G에서 5분 동안 원심분리한다. 이어서 유세포분석 분석을 위해 100 마이크로리터의 세척 완충액에 재현탁시키면서 세척 단계를 2회 반복한다. 먼저 유세포 분석기를 켠 다음 컴퓨터를 켭니다.
그런 다음 유세포 분석 소프트웨어를 열고 프로그램에 로그인 한 다음 세포 분석기 탭에서 유체 시작을 실행하십시오. 새 실험을 만들려면 실험 탭에서 새 폴더를 클릭하고 폴더 이름을 슬래시 실험으로 적절하게 지정합니다. 새 폴더를 클릭하여 강조 표시합니다.
그런 다음 실험 탭에서 새 실험을 다시 클릭하고 실험 이름을 적절하게 지정합니다. 첫 번째 샘플 슬래시 표본을 추가하려면 실험 탭에서 새 표본을 클릭하고 표본의 이름을 적절하게 지정합니다. 튜브 샘플을 추가하려면 표본을 강조 표시하고 실험 탭에서 새 튜브를 클릭합니다.
그런 다음 적절한 수의 튜브와 이름을 추가하십시오. 필요한 그래프를 준비하려면 워크시트 탭에서 새 워크시트를 엽니다. 새 워크시트 창이 나타나면 측면 분산과 전방 분산의 도트 블롯 그래프를 준비하여 관심 모집단을 선택합니다.
전방 산란 높이 대 전방 산란 영역의 도트 블롯 그래프를 준비하여 단일 세포 집단을 선택합니다. 다음으로, 관심있는 형광단에 대한 사건 수의 히스토그램을 준비하십시오. 유세포분석을 시작하기 전에 전압 파라미터를 조정하기 위한 샘플 수집, 검사기 및 세포분석기를 제어하기 위한 수집 대시보드와 모든 그래프가 포함된 워크시트가 열려 있는지 확인하십시오.
먼저 처리되지 않은 세포를 실행합니다. 튜브를 가리키는 화살표가 녹색인지 확인하십시오. 이 화살표가 녹색이 아닌 경우 화살표를 클릭하여 녹색으로 만듭니다.
피펫을 사용하여 각 샘플을 96웰 블랙 플레이트에서 유세포분석 튜브로 옮깁니다. 획득 대시보드에서 기록할 적절한 이벤트 수를 선택하고 유속을 낮음으로 변경한 다음 데이터 수집을 클릭합니다. FSC 및 SCC 파라미터의 전압을 조정하여 셀 모집단이 점도표 내에 집중되고 관심 있는 셀이 손실되지 않도록 그래프의 어느 축에도 닿지 않도록 합니다.
전방 및 측면 산란 밀도 플롯에서 관심 모집단을 식별하고 선택하고 전방 산란 신호가 가장 낮은 모집단을 구성하는 파편을 제외하여 첫 번째 게이트를 정의합니다. 이중항 세포 집단을 제외하여 두 번째 게이트를 정의하면 이중항 세포가 결과와 결론에 상당한 영향을 미치므로 두 번째 게이트를 정의합니다. 샘플을 더 빠르게 분석하려면 수집 속도를 중간 또는 높음으로 높이되 초당 200-300개 이벤트를 초과하지 마십시오.
그런 다음 데이터 기록을 클릭합니다. 전압을 조정하고 게이팅하고 데이터를 기록한 후 샘플을 꺼내고 Next Tube를 클릭합니다. 다음 샘플을 삽입하고 모든 제어 및 테스트 샘플에 대해 기록 데이터를 반복합니다.
모든 데이터가 수집되면 50% 표백제, FACSRinse 및 초순수로 구성된 3개의 튜브를 각각 높은 유속으로 5분 동안 실행하여 유세포분석기를 세척합니다. 그런 다음 세포분석기 드롭다운 메뉴에서 유체 시스템 종료를 클릭합니다. 결과를 fsc 파일로 USB 드라이브로 내보내 전송합니다.
새로 만들기 버튼을 눌러 분석 소프트웨어를 사용하여 분석하여 분석을 처리할 새 문서와 창을 만들고 샘플 파일을 새 창으로 드래그합니다. 두 번 클릭하여 염색되지 않은 샘플을 엽니다. 단일 세포 모집단을 게이트하려면 P1 모집단을 선택하고 P1 모집단을 두 번 클릭하여 FSCH 대 FSCA 그래프를 생성합니다.
제어된 단일 셀을 두 번 클릭하여 사용된 형광 색소에 대한 이벤트의 히스토그램을 만듭니다. 원래 창에서 P1 및 단일 셀을 선택하고 모든 샘플로 드래그하여 모든 샘플에 동일한 게이팅이 포함되도록 합니다. 그런 다음 레이아웃 편집기 버튼을 클릭하여 레이아웃 창을 열고 두 샘플을 서로 드래그하여 오버레이 히스토그램을 만듭니다.
EpCAM 양성 MDA-MB-231 세포에서, TEPP 및 TENN으로 처리된 세포를 나타내는 히스토그램을 오버레이하는 것은 TEPP 처리된 세포가 TENN 처리된 세포와 비교하여 오른쪽으로 이동한다는 것을 보여주며, 이는 TEPP 앱타머의 결합이 관심 단백질에 발생한다는 것을 입증한다. 음성 대조군에서, TEPP 및 TENN의 히스토그램을 오버레이하는 HEK 293T 세포는 EpCAM 발현 세포에서 TEPP가 그의 수용체에 부착된 EpCAM 압타머임을 나타내는 어떠한 이동도 반영하지 않는다. 또한, EpCAM 음성 세포에서는 결합이 관찰되지 않았으며, 이는 개발된 앱타머의 선택성 및 특이성을 확인시켜준다.
압타머가 빛으로부터 보호되고 압타머와 세포가 플레이트에 혼합되고 유세포분석기에 올바른 전압이 설정되어 있는지 확인합니다. 이것은 압타머에 대한 향후 응용 분야에 크게 의존합니다. 예를 들어, 우리는 약물 전달에 중점을 둡니다.
따라서 다음 단계는 압타머가 형광 현미경을 사용하여 내재화되었는지 평가하는 것입니다. 이 프로토콜은 앱타머가 면역표현형 분석에서 단클론 및 다클론 항체를 대체하는 것이 얼마나 쉬운지를 보여주었습니다.
