미토콘드리아는 신경 건강에 필수적입니다. 많은 신경 퇴행성 질환에서 축삭 미토콘드리아가 가장 먼저 고통을 겪지 만 축삭 미토콘드리아를 특별하게 만드는 것은 분명하지 않습니다. 이 프로토콜에 사용 된 챔버의 유체 압력 구배는 미토콘드리아 축삭의 선택적 처리를 허용합니다.
이것은 세포체 과정을 방해받지 않고 축삭 생물학에 집중할 수있게합니다. 여기서는 막 전위에 민감한 염료를 사용한 미토콘드리아의 탈분극을 보여 주지만이 방법은 다양한 신경 세포 유형 및 형광 판독에 적용 할 수 있습니다. 시작하려면 코딩 된 6 웰 플레이트를 멸균 후드에 넣고 멸균 이중 증류수로 두 번 세척하십시오.
플레이트를 기울인 위치에서 3-5분 동안 건조시키십시오. 진공 흡입 또는 피펫팅으로 과도한 물을 제거합니다. 그런 다음 미세 유체 챔버를 80 % 에탄올에 담그십시오.
다시, 미세유체 챔버를 기울어진 위치에서 3 내지 5분 동안 건조시키고, 피펫 팁으로 과량의 에탄올을 제거한다. 완전히 건조되면 미세 유체 챔버를 웰과 플레이트의 중앙에 놓습니다. 유리판에 적절하게 부착하기 위해 경계와 중간의 미세 홈 섹션에서 미세 유체 챔버를 부드럽게 두드립니다.
먼저, 1.5 밀리리터 반응 튜브에서 원하는 수의 해리 된 해마 뉴런을 수집합니다. 튜브를 실온에서 4 분 동안 1000 배 G로 원심 분리합니다. 상청액을 버리고 펠릿을 8 마이크로 리터의 B-27 신경 기저 배지에 재현 탁하십시오.
이어서, 세포 용액을 미세유체 챔버의 채널 입구로 분배한다. 플레이트 뒷면을 탭하여 채널을 통한 흐름을 돕습니다. 피펫을 사용하여 채널 출구에 남아 있는 세포 현탁액을 흡인합니다.
세포와 함께 미세유체 챔버를 섭씨 37도 및 5%이산화탄소에서 15 내지 20분 동안 배양한다. 다음으로, 상단 축삭 웰을 50 마이크로 리터의 B-27 신경 기저 매체로 채우고 플레이트 뒷면을 두드려 흐름을 돕습니다. 소마 쪽의 각 웰을 150 마이크로 리터의 B-27 신경 기저 배지로 채우고 위에 장력 거품을 만듭니다.
또한 축삭 쪽의 두 웰을 각각 100 마이크로 리터의 B-27 신경 기저 매체로 채 웁니다. 7-8일의 시험관 내 배양 후, 축삭이 마이크로홈을 통해 성장하고 축삭 구획으로 확장되었는지 확인하십시오. B-27 신경 기저 배지를 제거하고 축삭 및 소마 채널의 상단 웰에 100 마이크로 리터의 예열 된 이미징 배지를 추가하여 장치를 세척하십시오.
매체가 하부 우물로 흐르도록하십시오. 하부 웰에서 배지를 제거하고 상단 웰에서 남은 배지를 제거하고 세척이 끝날 때 웰을 비워두고 새 배지로 반복합니다. 그런 다음 체세포 및 축삭 상단 웰 모두에 100 마이크로 리터의 5 나노 몰 TMRE 희석액을 첨가하십시오.
모든 우물에 동일한 부피가 될 때까지 매체가 두 구획을 통해 흐르도록하십시오. TMRE 함유 매체로 채웁니다. 체세포 구획에서 관심 영역을 선택하고 미세 홈을 통해 축삭 구획으로 따라갑니다.
체세포 구획과 축삭 구획에서 이미징된 미세 홈이 서로 일치하는지 확인합니다. 파일 이름을 변경한 후 561나노미터 여기 및 625나노미터 방출 파장을 사용하여 적색 형광 이미지를 획득합니다. 체세포면에 장력 기포가 있는지 확인하여 체세포와 축삭 챔버 사이의 부피 차이를 확인하십시오.
그런 다음 채널 내부의 매체를 제외한 축삭 측의 양쪽 웰에서 이미징 매체를 제거합니다. 미토콘드리아 탈분극을 유도하려면 이미징 매체에 희석 된 160 마이크로 리터의 20 마이크로 몰 항 마이신 A를 상단 축삭 웰에 첨가하십시오. 두 축삭 우물에 동일한 부피가 될 때까지 채널을 통해 흐르게하십시오.
이미징을 반복하여 마이크로홈을 식별하여 베이스라인 획득 동안과 동일한 위치가 이미징되도록 합니다. 이 프로토콜을 사용하여 일차 해마 뉴런을 미세 유체 장치에서 성장시킨 다음 막 민감성 염료 TMRE로 미토콘드리아 염색을 수행했습니다. 미토콘드리아의 균질 염색은 마이크로 홈의 양쪽에서 관찰되었지만 중간에서는 관찰되지 않았습니다.
축삭 측에 안티마이신 A를 첨가하면 소멀 미토콘드리아는 TMRE 신호를 유지하는 반면 축삭 미토콘드리아에서 형광이 손실되었습니다. 장치를 조립하기 전에 우물이나 장치에 수분이 남아 있지 않은지 확인하십시오. 그렇지 않으면 챔버가 밀봉되지 않습니다. 이 방법을 사용하여 축삭 및 국소 기능에서 미토콘드리아 기능의 상실 효과뿐만 아니라 역행 신호 전달 및 글로벌 세포 생존에 미치는 영향을 연구 할 수 있습니다.
미토콘드리아 생물 발생은 오랫동안 세포체에서만 발생하는 것으로 생각되어 왔습니다. 이 방법을 통해 우리는 축삭 미토콘드리아 손상이 단백질 PINK1의 짧은 국소 번역을 필요로한다는 것을 밝힐 수있었습니다.
