뇌 단백질 합성의 지역 속도의 측정 개발 및 신경 가소성 동안 발생 하는 장기 변화에 뇌의 반응을 추적할 수 있습니다. 우리의 방법은 측정이 완전히 정량적이라는 장점이 있으며 깨어있는 행동 동물에서 만들어집니다. 정량적 자동 방사선 기술은 동시에 모든 뇌 영역에서 측정을 허용합니다.
절차를 시연하는 것은 아니타 토로시안, 내 실험실에서 바칼로레아 후 동료, 그리고 천지안 황, 우리의 동물 외과 의사가 될 것입니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 수술 준비와 함께 이 절차를 시작합니다. 일단 수술 단계에, 대퇴 동맥과 정맥을 드러내는 중간선을 향해 좌측 허벅지의 상부 내측 부분에서 1 센티미터 절개를 만들기 위하여 외과 가위를 이용합니다.
절개 위와 양쪽에 수술 피부 후크로 느슨한 피부를 철회하십시오. 수술 단계에 테이핑하여 피부 후크를 고정합니다. 적절한 수분을 유지하기 위해 노출 부위에 염화 나트륨 0.9%를 바르습니다.
대퇴 동맥과 정맥의 작은 부분 의 주위에 결합 조직을 분리, 무딘 해부에 집게를 사용합니다. 동맥과 정맥을 조심스럽게 분리합니다. 이제 집게를 사용하여 절개의 가장 측면 지점에서 대퇴 정맥과 동맥 모두에서 흡수 가능한 봉합사의 한 가닥을 스레드합니다.
봉합사를 중간쯤 당겨 끝이 고르게 됩니다. 사타구니에 더 근접 지점에서, 만 대퇴 정맥에서 두 번째 봉합사를 스레드 집게를 집게 하는 집게를 사용합니다. 혈액 흐름을 제한하는 데 사용할 반 매듭을 부드럽게 묶습니다.
가닥 A와 가닥 B 사이의 지점에서, 대퇴정맥에서만 세 번째 봉합사를 스레드하는 집게를 사용합니다. 혈액 흐름을 제한하는 데 사용할 전체 매듭을 부드럽게 묶습니다. 정맥을 찢지 않도록 주의하십시오.
가닥 B를 부드럽게 잡아 당겨 혈류를 제한합니다. 혈액 제한을 유지하기 위해 가닥 B를 부드럽게 잡아 당기기 위해 hemostat을 사용합니다. 이제 PE 튜브의 비컷 끝을 32 게이지 바늘과 1밀리미터 주사기에 연결하여 분리된 식염수로 채워져 있습니다.
카테터를 플러시하여 기포를 제거합니다. 마이크로 가위로 대퇴 정맥의 제한된 영역에 작은 구멍을 잘라 조심스럽게 삽입 B.일단 삽입, 가닥 B의 긴장을 해제하고 정맥을 더 카테터를 안내, 플러시 PE 8 튜브의 각진 끝을 삽입. 카테터를 포함하는 정맥 주위에 가닥 B를 조입니다.
가닥 C를 사용하여 카테터 주위에 매듭을 추가로 묶습니다. 이 매듭이 대퇴 동맥을 포착하지 않는지 확인하십시오. 주사기 배럴을 부드럽게 뒤로 당겨 튜브를 혈액으로 부분적으로 채우기 위해 동일한 절차를 사용하여 PE 10 카테터를 왼쪽 대퇴 동맥에 삽입하기 전에 카테터가 제대로 이식되었는지 확인합니다.
대퇴 정맥과 동맥 카테터가 모두 확보되면, 두 카테터 주위에 매듭에 가닥 A를 묶어. 모든 여분의 봉합사를 자르고 피부 갈고리를 제거 한 후, 응고를 방지하기 위해 헤파리니화 식염수로 동맥 카테터를 플러시하십시오. 두 카테터의 끝을 코터화하여 씰을 만듭니다.
마우스를 경향이 있는 위치에 놓고 노출된 부위에 식염수를 적용하는 목 의 바닥에 작은 절개를 합니다. 목 절개에서 대퇴절에 이르는 중공 금속 막대를 피하로 삽입합니다. 중공 막대를 통해 목 절개에서 카테터를 뱀.
중공 막대를 제거 한 후, 수술 후 진통에 의해 봉합사와 대퇴 절개를 닫습니다. 30센티미터 의 유연한 중공 튜브를 통해 카테터를 뱀으로 만들어 스프링 테더를 만들고 피부 아래 스프링 밧줄의 버튼을 봉합한 다음 수술 후 진통제를 만듭니다. 회수 기간 동안 마우스를 보관하기 위해 회전 마운트와 팔을 가진 명확한 원통형 용기로 마우스를 이동합니다.
용기를 따뜻하게 하여 마우스를 따뜻하게 유지합니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 샘플을 채취하여 실험 초기에 마우스가 정상적인 생리 상태에 있는지 확인합니다. 추적기를 정맥내 투여하려면 한 팔에 연결된 C 14 라벨류핀 트레이서를 들고 있는 주사기가 있는 Y 커넥터와 멸균 식염수 100~200마이크로리터가 있는 주사기를 사용하여 다른 팔에 연결된 정맥 선을 플러시합니다.
Y 커넥터를 정맥 선에 연결합니다. 동시에 스톱 워치를 시작하고, 추적자를 주입하고, 시간 조정된 동맥 혈액 샘플을 수집하여 연구를 시작하십시오. 주입 직후 식염수로 정맥 라인을 플러시하십시오.
실험의 처음 2분 동안 연속으로 혈액 샘플을 1~7개 까지 수집합니다. 7개의 견본을 수집한 후에, 각 나머지 견본 의 앞에 죽은 공간 혈액의 30마이크로리터를 수집합니다. 샘플 8~14개는 각각 3분, 5, 10, 15, 30, 45 및 60분으로 수집됩니다.
실험 중 어느 시점에서 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 트리티아드 류신과 norleucine을 포함하는 내부 표준에 대해 세 개의 튜브를 처리합니다. 플라즈마 류신 농도를 정량화하려면 나트륨 양이온 교환 컬럼이 있는 HPLC 시스템을 사용하고 기장 발동 및 밀가루 측정 검출을 통해 포스트 컬렉션을 사용하십시오. 류신 곡선 아래 영역은 샘플에서 류신의 농도에 비례한다.
샘플에서 류신 농도를 정량화하기 위해 표준과 비교를 사용합니다. 그런 다음 액체 신자극 카운터를 사용하여 플라즈마 샘플에서 트리튬 및 C 14의 분당 분해를 정량화합니다. 이러한 농도를 사용하여 순환으로부터 표기된 류신C 14의 클리어런스 곡선과 동맥 혈장에서의 특정 활성의 시간 과정을 구성한다.
그래프로부터, 동맥 플라즈마에서 통합 C 14 표지류 특이활성을 계산한다. 정량적 사인 방사선 을 수행하려면 두께20 미크론의 뇌 섹션을 준비하십시오. 영하 20도에서 극저온을 통해 뇌를 절제합니다.
젤라틴 코팅 슬라이드의 해동 마운트 섹션. 슬라이드를 고정한 후 이전에 보정된 C 14 라벨이 붙은 메틸 메타크릴레이트 표준 세트와 함께 X선 필름 카세트에 슬라이드를 정렬합니다. 어두운 방과 안전한 빛 아래, 측면과 표준 에멀젼 측면, X 선 필름의 조각을 배치합니다.
카세트를 밀봉하고 검은 색 교환 가방에 넣습니다. 제조업체의 지침에 따라 필름을 개발합니다. 배경이 고르지 않을 수 있고 정량화에 영향을 줄 수 있으므로 자동화된 필름 개발은 권장되지 않습니다.
필름상 교정 기준 세트의 광학 밀도 값에 기초하여 광학 밀도 대 조직 C 14 농도의 보정 곡선을 구성한다. 이러한 데이터를 다항식 방정식에 맞춥시게 합니다. 두 번째 또는 3도 다항식 방정식은 매우 잘 맞습니다.
특정 뇌 영역을 분석하려면 뇌 아틀라스와 비교하여 6~8개의 섹션에서 관심 영역 또는 ROI 영역을 찾습니다. 모든 섹션에서 ROI 내에서 픽셀의 광학 밀도를 기록합니다. 교정 곡선을 기반으로 각 픽셀에서 조직 C 14 농도를 계산합니다.
마지막으로, ROI의 평균 조직 C 14 농도로부터 대뇌 단백질 합성의 지역적 비율을 계산하여 라벨이 부착되지 않은 류신과 라벨이 부착된 류신의 농도의 분면에서 때때로 t와 람바에 라벨이 부착되지 않은 류신농도를 계산한다. 혈장에서 오는 조직 전구체 풀에서 류신의 분수. 여기에 표시된 것은 단백질 합성억제제인 애니소마이신으로 치료된 동물과 비교하여 치료된 동물의 대표적인 이미지입니다.
단백질 합성의 비율은 이미지에 있는 어둠의 수준에 비례합니다. 애니소마이신은 이 방법의 특이성을 나타내는 뇌 단백질 합성의 측정 된 비율을 크게 감소시킵니다. 여기서, 디지털화된 자동 방사선 사진은 해마와 시상 하부의 수준에서 깨어있는 행동 마우스에서 표시됩니다.
어두운 지역은 대뇌 단백질 합성의 더 높은 지역 비율이 있습니다. 여기에 표시된 것은 등쪽 해마의 수준에서 깨어있는 행동 제어 마우스에서 디지털화된 자동 라디오그램입니다. 대뇌 단백질 합성의 비율은 색상 바에 따라 이미지에 색상 코팅된다.
이 절차를 시도하는 동안, 동물이 측정 하는 동안 정상적인 생리 상태에 있는지 확인 하는 것이 중요 하다. 우리의 방법론은 이미 깨지기 쉬운 X 증후군과 같은 신경 발달 장애에서 단백질 합성의 규제 완화를 입증했습니다. 그것은 또한 퇴행성 변경 및 알 츠 하이 머 병 같은 조건에 대 한 유용한 마커 수 있습니다.
단백질 합성 방법은 단백질 합성의 변화와 특정 단백질의 지역적 변화와 상관 관계를 맺는 교대 섹션에서 면역 조직화학과 함께 사용할 수 있습니다. 요약하자면, 정량적 자동방사선형 L-1 C 14 류신 방법은 생체내에서 단백질 합성의 지역적 비율을 정확하게 판단하는 데 이상적입니다. 그것은 생체 조건에서 정확성과 적용 의 측면에서 상당한 이점을 제공합니다.
