이 프로토콜은 동일한 뇌 영역에서 두 단백질의 정량화를 허용하기 때문에 중요합니다. 이것은 실험자가 팬과 인포단백질을 속여 뇌 지구에 있는 분자 신호 통로에 있는 활동을 보는 것을 허용합니다. 그것은 또한 다른 인지 현상의 마커 인 단백질을 분석하는 데 사용할 수 있습니다.
우리는 면역 히스토케와 같은 비교적 간단한 기술을 사용하여 전형적으로 더 많은 관련 기술을 필요로하는 질문에 대답하고 있습니다. 분자 신호 경로의 활성을 검사하는 것을 포함하여 AMPA/NMDA 비율을 검사합니다. 영하 9도에서 영하 12도 사이 유지된 저온을 사용하여, 30-50 마이크로미터에서 관심 지역에서 이전에 고립되고 냉동된 쥐 뇌를 슬라이스합니다.
유리 슬라이드에 슬라이스를 직접 장착하고 면역 세포 화학이 될 때까지 영하 80도에서 보관하십시오. 냉동실에서 유리 슬라이드를 제거하고 30 분 동안 실온에 평형 할 수 있습니다. 연기 후드 아래에서 작업, 조직 고정을위한 실온에서 1 ~ 2 시간 동안 0.1 어금반 PBS에 4 %의 파라 포름 알데히드에 슬라이드를 배치합니다.
그런 다음 슬라이드를 0.1 어금니 TBS에서 각각 10분 동안 세 번 헹구십시오. 세포막을 과소화하려면 슬라이드를 30-60 분 동안 가벼운 세제로 배양하십시오. 그리고 TBS에서 각각 15분 동안 세 번 다시 헹구십시오.
원고에 기재된 바와 같이 올바른 농도에서 PBS에 관심이 있는 단백질을 위한 1차 항체를 희석시. 파이펫 1 차 적인 항체 용액은 뇌 조직에 직접. 슬라이드에 덮개 전표를 놓고 실온에서 1-2 시간 동안 1 차적인 항체 희석에 있는 두뇌 조직을 배양합니다.
인큐베이션 후 커버 슬립을 제거하고 소량의 세제가 첨가된 TBS의 슬라이드를 각각 15분 동안 4회 세척합니다. TBS, 세제 및 숙주 혈청의 1.5%를 포함하는 희석제에서 이차 항체를 희석시. 슬라이드에 이차 항체를 추가하고 커버 슬립으로 덮고 실온에서 2 시간 동안 배양하십시오.
인큐베이션 후, TBS-T에서 슬라이드를 각각 20분 동안 4회 헹구고 TBS에서 각각 20분 동안 4회 헹구십시오. 밤새 어둠 속에서 실온에서 슬라이드를 건조시다. 슬라이드를 근적외선 스캐닝 인터페이스에 배치하여 조직이 아래를 향하도록 합니다.
선택 도구를 사용하여 한 번에 여러 슬라이드를 이미지합니다. 21 마이크로미터의 해상도로 최고 품질의 설정을 사용하여 슬라이드를 이미지합니다. 0 나노미터의 오프셋에서 이미지를 이미지 분석 소프트웨어로 가져와 반정성 단백질 분석을 보고 표시합니다.
이미지 분석 소프트웨어를 연 후 이미지가 검색된 작업 영역을 선택합니다. 그런 다음 이미지 분석 소프트웨어에서 스캔된 이미지를 열어 원시 이미지 또는 총 정량화 방출을 변경하지 않고 표시된 파장, 대비, 밝기 및 배율을 조정합니다. 정량화에 대한 키 영역을 식별한 후 페이지 상단을 따라 분석 탭을 선택한 다음 그리기 사각형을 선택하여 정량화될 영역에 사각형을 그립니다.
사각형 크기를 보려면 화면 왼쪽 하단을 따라 셰이프를 선택합니다. 그런 다음 오른쪽 하단을 따라 열을 선택합니다. 그런 다음 높이와 너비 열을 추가하여 셰이프 크기를 식별합니다.
마지막으로 셰이프의 이름을 지정하고 반복합니다. 모든 영역이 샘플링되면 열 탭에서 사용할 수 있는 데이터의 결합 및 분석을 진행합니다. 이 프로토콜이 작동하는지 확인하기 위해 뇌 섹션은 1 차 및 이차 항체, 이차 항체 단독으로 또는 1 차 또는 이차 항체로 배양되었습니다.
즉각적인 초기 유전자 c-jun 발현은 뇌 조직에 1차 및 이차 항체가 모두 적용될 때만 등막 해마와 편도체에서 검출되었다. AMPA 수용체의 GluR1 서브 유닛 및 NMDA 수용체의 NR2A 서브 유닛은 편도체 핵에서 대변 단백질 검출에서 분석되었다. 이것은 학습과 기억의 신경 생물학 서명인 편도체의 서브 핵에 있는 AMPA NMDA 수용체의 비율을 검토하는 것을 허용했습니다.
단백질 발현의 평균 및 정규화 측정은 복부 해마에서 고해상도 스캔으로부터 얻어졌다. 영상 분석 소프트웨어를 이용하여, 직사각형은 관심 영역에 배치되고 형상으로부터의 빛의 평균 강도는 단백질 발현의 척도인 형광발현의 척도로서 사용되었다. 정규화된 곡선을 얻기 위해, 곡선 아래 영역에서 높은 신호와 낮은 신호를 표현하는 영역에 걸쳐 형상을 단백질 발현의 척도로 사용하였다.
이 절차와 함께 가장 큰 투쟁은 항체를 찾아서 그것이 작동하는지 확인하는 것입니다. 응용 프로그램은 간단합니다. 내 충고는 먼저 정기적 인 면역 히스토케미컬 절차를 시도한 다음이 기술을 시도하는 것입니다.
항상 먼저 유효성 검사 분석작업을 수행합니다. 기억해야 할 가장 중요한 것은 항체 희석을 확인하고 올바르게 적용되었는지 확인하는 것입니다. 이러한 단계가 없으면 프로시저가 실패합니다.
