우리의 프로토콜은 과학자들이 개별 상피 세포에서 세포 전균 성 악수 망을 분석하는 데 도움이되며 곡선상피 조직에서 다세포 척도에서 유사한 분석을 수행 할 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 피지 응용 프로그램의 좋은 예입니다. 직관적인 그래픽 사용자 인터페이스를 가지고 있으며 스크립팅에 대한 지식이 필요하지 않습니다.
따라서 현장의 초보 사용자에게도 매우 적합합니다. 우리의 방법은 Drosophila 계란 챔버를 위해 개발되었지만, 그것은 또한 Drosophila 상피 외부에 적용 할 수 있습니다. 우리는 과학자들이 모델 시스템에서 프로토콜을 테스트할 것을 권장합니다.
동반된 테스트 파일을 사용하여 이 프로토콜에 익숙해. 이 프로토콜의 어느 부분이 개별 연구 질문에 적합한지 결정하는 데 도움이 됩니다. 프로토콜의이 부분은 사용자가 시간 경과 영화에서 상피 세포를 분할하고 이후 Surface Manager를 사용하여 시간이 지남에 따라 개별 세포에서 actomyosin 펄스를 분석 할 수 있습니다.
시작하려면 피지를 열고 매크로 티슈셀세그먼트무비(TissueCellSegmentMovie)를 가져옵니다. 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 ijm입니다. 그런 다음 표백제 수정 TIFF 파일을 열고 메뉴 모음으로 이동하여 이미지를 선택하고 색상 다음에 색상을 선택하고 분할 채널을 선택하여 표백제 수정 된 파일의 채널을 분할합니다.
아이콘 실행은 열린 스크립트에서 실행아이콘을 눌러 선택한 시간 경과 영화의 활성 셀 멤브레인 채널에서 업로드된 스크립트를 실행합니다. 좋은 세포 마스크를 얻으려면 Gaussian 블러를 2.500으로 설정하고 셀 검출 감도를 뺀 값으로 설정하고 확인을 클릭합니다. 그런 다음 63x 목표로 획득한 시간 경과 영화의 경우 10~20개의 예상 노이즈 허용 오차를 설정하고 확인을 클릭합니다. 생성된 셀 마스크가 분석된 시간 경과 동영상에 나타나고, ParticleStack이라는 새 창이 나타나고, 작업 필요라는 작은 창도 나타납니다. 타임랩스 영화의 셀 마스크에서 중앙의 셀에만 초점을 맞추고 시간 경과 영화 전반에 걸쳐 완전하고 잘 정의된 윤곽선을 제공할 수 있는 간략하게 선택합니다.
중앙에 있는 선택된 셀이 실제 세포막에 잘 대응하는 경우, ParticleStack을 TIFF 파일로 저장합니다. 피지에서 해당 ParticleStack TIFF 파일을 엽니다. 피지에 설치된 표면 관리자 플러그인으로, 플러그인을 엽니 다.
Surface Manager에서 읽기 개요 이미지 단추를 클릭하고 Jaccard 인덱스를 60%로 설정하면 윤곽선을 셀 수에 따라 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다. 로드되면 각 셀에 S 번호가 할당되고 Surface Manager 창의 왼쪽 부분에 나타납니다. 선택한 S 번호를 클릭하여 ParticleStack1에서 가져온 셀 윤곽선을 클릭합니다.
티프는 타임랩스 영화에 나타납니다. 가져온 각 S 번호를 동영상 전체의 셀 윤곽선 품질에 대 한 확인 하 고 잘못 된 셀 윤곽을 표시 하는 원치 않는 셀을 제거 합니다. 원치 않는 셀을 제거하려면 셀 윤곽선을 강조 표시하고 삭제 버튼을 클릭합니다.
브러시 도구를 사용하여 셀 윤곽선을 수정합니다. 완료되면 수정된 셀을 RoiSet으로 저장합니다. 지퍼 파일.
actomyosin 펄스가 분석된 조직에 존재하는지 확인하고 상세한 행동, 뿐만 아니라 actomyosin 신호의 방향성을 이해하기 위하여, 피지를 여는 것으로 시작합니다. 시간 경과 동영상을 열고 저장된 ParticleStack1을 로드합니다. 티프 셀 마스크와 표백제 보정 된 시간 경과 영화, 다음 표면 관리자 플러그인 및 RoiSet에서 관심의 해당 영역을로드합니다.
지퍼 파일. 다음으로 Surface Manager에서 관심 있는 신호가 있는 채널을 활성화합니다. 통계 버튼을 클릭하여 평균 회색 값 슬라이스라는 창을 슬라이스별로 가져옵니다.
actomyosin 신호의 평균 및 중앙값 은 셀의 영역 및 모양과 관련된 다른 매개 변수뿐만 아니라 임의 단위로 시간이 지남에 따라 표시됩니다. 통계 창으로 이동하여 값을 스프레드시트 파일로 저장하고, 파일을 클릭하고, Save As.Similarly를 선택하고, 셀 마스크를 생성하고, 조직 척도에서 actomyosin 펄스를 분석하기 위해 Surface Manager에 로드합니다. 프로토콜의이 부분은 사용자가 선택적으로 시간이 지남에 따라 곡선 상피 조직에서 actomyosin의 얇은 층을 추출 할 수 있습니다.
이러한 단계는 사용자 친화적이며 직관적인 그래픽 인터페이스를 기반으로 합니다. 피지를 열고 타원지대 표면 프로젝션 플러그인이 설치되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 타임랩스 영화를 열고 플러그인을 클릭하고 BigDataViewer로 이동하여 XML/HDF5 파일로 내보내기 현재 이미지를 XML/HDF5 파일로 선택하여 XML/HDF5 파일로 내보냅니다.
다음으로 플러그인으로 이동하여, 빅데이터뷰어를 클릭하고, 타원지대 표면 프로젝션을 클릭하고 XML 파일을 선택하여 타원성 표면 프로젝션에서 내보낸 파일을 엽니다. 이렇게 하면 계란 챔버의 면각이 있는 새 창이 열리고 처리를 통해 사용자를 안내하는 대화 상자가 나타납니다. 난소 투영이라고 하는 대화 창에는 여러 탭이 있습니다.
경계 상자라고 하는 첫 번째 대화 상자 탭에서 타임랩스 동영상의 계란 챔버의 x 및 y 테두리를 경계 상자의 z 너비와 함께 정의하고 세트를 누릅니다. 계란 챔버의 선택한 부분은 분홍색으로 강조 표시됩니다. 다음으로 난소 투영 창에서 Blob 찾기라는 대화 상자 탭에서 신호 Blob의 크기를 정의합니다.
시그마와 최소 피크 값을 정의합니다. 그런 다음 컴퓨팅을 눌러 녹색 Blob으로 나타나는 actomyosin 신호를 식별합니다. 약 100개의 반점이 발견될 때까지 다른 매개 변수로 이 단계를 다시 시도합니다.
actomyosin 신호를 식별하는 것은 중요한 단계입니다. 신호 품질과 감지된 Blob의 정확한 크기에 따라 달라집니다. 이미지에 표시녹색 반점이 없는 경우 다음 단계가 작동하지 않습니다.
타원을 디자인하려면 핏 타원이라고 불리는 탭을 계속 합니다. 임의 샘플을 10, 000으로 설정하고 외부/내부 차단 거리를 1대 10으로 설정한 다음 계산을 클릭합니다. 이 후 프로젝션이라는 탭이 자동으로 열리고 표면 추출의 정의를 허용합니다.
투영 탭에서 원하는 타원의 너비로 최소 및 최대 투영 거리를 설정합니다. 최소한의 최대 투영 거리가 적합해야 하며 분홍색 정의 타원 영역은 계란 챔버의 전체 외부 층을 포함합니다. 그런 다음 슬라이스 거리를 하나로 정의합니다.
알챔버에 정의된 타원의 분홍색 영역이 계산을 누르기 전에 볼 수 있는지 확인합니다. 그것은 새로운 타원 적합의 품질을 평가하는 데 도움이됩니다. 다음으로 타원성의 출력 폭을 800보다 크거나 같고 400보다 크거나 동일한 높이를 설정합니다.
그런 다음 표면 추출 의 지속 시간을 설정하고 구형 또는 원통 투영중 하나를 선택합니다. 필요한 경우 Z를 뒤집고 Y.Press 계산을 정렬하여 이미지라는 새 창의 두 채널에 대한 표면 추출을 얻습니다. 이미지를 클릭하고 조정하고 밝기/대비를 선택하여 투영된 actomyosin 신호를 볼 수 있도록 획득한 이미지 창의 밝기와 대비를 조정합니다.
표면 추출이 좋으면 두 채널을 TIFF 파일로 별도로 저장합니다. 또한 이 특정 계란 챔버의 표면이 추출된 방법에 대한 향후 참조를 위해 로그 창 파일을 저장합니다. 그런 다음 피지에서 선호하는 색상 코드로 채널을 병합하고 결과를 TIFF 파일로 저장합니다.
이 프로토콜은 과학자들이 상피 조직에서 actomyosin 네트워크의 행동을 조사 할 수 있습니다. 이것은 국소 세포 규모에 있는 actomyosin 행동의 상세한 분석이 조직 규모에 유사한 분석과 결합될 때만 가능합니다. 여기에 는 국소 세포 척도및 지방 2 돌연변이 Drosophila 계란 챔버에 대한 조직 척도에서 동적 myosin II 행동의 대표적인 예입니다.
기저 단일 평면에서, 미오신 II 신호의 녹색 변형 된 조절 광 체인은 제어 계란 챔버의 전방 후방 축에 수직이동합니다. 이러한 극성은 fat2 돌연변이 계란 챔버에서 손실되고 anisotropic myosin II 펄스, 조직 수준에서 진동, 대조군 샘플에서 myosin II의 녹색 변형 된 조절 광 사슬로 이어지는 상피 회전을 촉진하는 데 필요한 동기화 된 힘을 생성한다. 대조적으로, fat2 돌연변이 계란 챔버의 여포 상피는 기저측에서 강하게 펄스하고 상피 회전을 촉진하는 데 필요한 동기화 된 힘을 생성하지 못합니다.
Drosophila 계란 챔버의 얇은 apical 영역에서, fat2 돌연변이는 또한 myosin II의 녹색 수정 된 규제 라이트 체인의 변경 된 동적 거동 행동을 제시.이 비디오를 시청 한 후, 당신은 피지를 사용하여 드로소필라 계란 챔버에서 로컬 및 조직 규모에서 actomyosin 네트워크를 분석하는 방법의 좋은 아이디어를 가져야한다. 보다 실용적인 팁과 문제 해결을 위해 프로토콜 후 토론 부분을 참조하십시오. 당신은 피지 또는 우리의 플러그인과 관련된 질문이있는 경우, 각각의 웹 페이지를 참조하거나 저희에게 연락.
