이 방법은 암세포 행동의 조절에 있는 성인 줄기 세포의 역할에 관하여 줄기 세포 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 살아있는 유기체를 사용하지 않고 체외에서 암세포 및 줄기 세포 상호 작용의 평가를 허용한다는 것입니다. 이 기술은 뼈와 같은 단단한 조직에 암 전이에 있는 성인 줄기 세포의 승진 역할을 모델로 암 전이에 대한 잠재력을 가지고 있습니다.
절차의 데모는 Huseyin Apdik에 의해 수행될 것입니다, 내 실험실에서 박사 후. 멸균 추출 포셉을 사용하여 17세에서 20세 사이의 젊은 성인에게서 얻은 사랑니의 중심에서 펄프 조직을 제거합니다. 10센티미터 조직 배양 접시에 차가운 완전 DMEM에 조직을 놓고 메스를 사용하여 샘플을 2~3mm 조각으로 다진다.
각 접시의 조각을 6웰 플레이트를 치료한 조직 배양의 개별 우물로 옮기고 200마이크로리터의 완전한 DMEM을 통해 각 우물의 조직을 덮습니다. 조직이 가습, 섭씨 37도 및 5% CO2 세포 배양 배양기에서 적어도 2 시간 배양으로 우물 바닥에 부착할 수 있도록 합니다. 인큐베이션의 끝에서, 2 -2.5 밀리리터의 신선한 완전한 배지와 추가 8 ~ 9 일 동안 세포를 배양하는 조직을 공급한다.
문화가 80 %의 합류에 도달하면 PBS의 2 밀리리터로 각각 잘 씻고 섭씨 37도에서 트립신 2 밀리리터로 세포를 분리하십시오. 2 분 후, 잘 당 완전한 DMEM의 두 밀리리터와 반응을 중지하고 원심 분리에 의해 세포를 수집합니다. 그런 다음, 세포의 두 우물 당 신선한 완전한 매체의 15 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 그들의 후속 배양을 위해 T75 플라스크로 세포를 통과.
적어도 8개의 구절 후에, 가벼운 현미경 검사법에 의해 세포를 시각화합니다. 치과 펄프 줄기 세포는 배양 접시에 부착해야하며 스핀들 같은 세포 형태를 표시해야합니다. 표면 마커 분석을 위해 트립시니화가 입증된 후, 1.5밀리리터 튜브에서 실온에서 20분 동안 4%파라포름데히드로 세포를 수정한 다음 세척당 PBS 500 마이크로리터에서 3개의 세척을 한다.
마지막 세척 후, 4섭씨에서 1시간 동안 튜브당 PBS의 100 마이크로리터에 적합한 항체로 세포를 라벨로 지정합니다. 인큐베이션의 끝에서, 입증된 바와 같이 PBS에서 세포를 세 번 세척하고 4°C에서 30분 동안 튜브당 PBS의 100 마이크로리터에서 적절한 이차 항체로 세포를 라벨로 부착한다. 그런 다음 PBS에서 샘플을 세 번 세척하고 표준 프로토콜에 따라 세포 측정을 유동하여 세포를 분석합니다.
치과 펄프 줄기 세포의 분화를 위해, 세포 배양 인큐베이터에서 24시간 배양하기 위해 완전한 DMEM 500 마이크로리터에서 24웰 플레이트의 개별 우물로 10회 10회 종자. 다음 날, 각각의 배지를 적절한 분화 배지로 교체하고 세포를 인큐베이터로 돌려보내 2주 동안 일주일에 두 번 배지를 상쾌하게 한다. 표준 프로토콜에 따라 폰 코사 및 알시안 블루 염색에 의해 차별화를 확인할 수 있습니다.
2~4개의 구절 후에, 배양된 치과 펄프 줄기 세포로부터 조건된 중형 초월제를 수집하면 배양이 80%에 도달하면. 이어서, 수집된 배지를 원심분리하여 폐기물 조직 물질및 세포 이물질을 제거하고 사용전까지 음수 20도에 배지를 저장한다. 암세포 치료를 위해, 5개의 종양 세포를 10번 종자 10번 으로 12웰 플레이트의 개별 우물로 12웰 플레이트의 개별 된 우물로 17섭씨 37도 및 5%CO2에서 배양한다.
다음 날 아침, 멸균 200 마이크로리터 팁을 사용하여 각 우물에서 스크래치 부상을 입고 각 우물의 상체를 다양한 농도의 조건부 배지를 포함하는 신선한 배지로 즉시 교체합니다. 그런 다음, 즉시 반전 현미경의 밑에 상처를 관찰하고 정규 시간 간격으로 부상당한 배양의 심상을 얻습니다. 분석이 끝나면 ImageJ에서 시간이 지남에 따라 스크래치 닫기를 측정합니다.
치과 펄프 줄기 세포 이동을 평가하기 위해, DMEM의 250 마이크로 리터에서 0.4 미칸 모공을 가진 개별 24 웰 플레이트 삽입에 4 개의 치과 펄프 줄기 세포에 첫 번째 종자 3 번 10 및 37 섭씨에서 하룻밤 삽입을 배양. 다음으로, 4개의 종양 세포를 37°C에서 하룻밤 동안 DMEM 500 마이크로리터에서 24웰 플레이트의 개별 우물로 5회 10번 시드한다. 다음날 아침, 입증된 대로 종양 세포를 긁습니다.
수퍼나티를 500마이크로리터의 신선한 DMEM으로 대체하고 치과 펄프 줄기 세포 시드 인서트 1개를 신선한 배지로 공급합니다. 그런 다음 즉시 반전 된 현미경에 세포를 관찰하고 치과 펄프 줄기 세포 이동을 평가하기 위해 정기적으로 세포를 이미지. 치과 펄프 줄기 세포의 암세포와의 직접적인 상호 작용을 평가하기 위해, 각 표지된 배양물을 시험하여 단일 세포 현탁액을 얻고 원심분리에 의해 해리된 세포를 수집합니다.
제조업체의 지시에 따라 공급되는 희석C 버퍼로 제조된 고유한 셀 링커 염료 솔루션에서 펠릿을 다시 중단하고 세포를 10분 동안 배양한다. 태아 소 혈청의 100 마이크로 리터로 염색 반응을 종료하고 원심 분리에 의해 세포를 수집합니다. 그런 다음 완전한 성장 배지를 가진 세포를 완전한 성장 배지로 원심분리한 다음, 완전한 배지의 2밀리리터에서 6웰 플레이트에서 잘 6웰 플레이트에 4개의 치과 펄프 줄기 세포 및 종양 세포를 5배 10회 도금하기 전에 세포를 원심분리한다.
원심분리에 의해 24 또는 48 시간의 배양 후 세포를 수집하고 PBS에서 세척합니다. 이어서, 표준 유량 세포 분석 프로토콜에 따라 세포를 분석하기 전에 모든 세포 응집체를 분산시키기 위해 5밀리리터 라운드-바닥 유동 세포 측정 관 및 소용돌이에서 형광 활성화 세포 선별 완충제300 마이크로리터에서 세포를 재중단한다. 치과 펄프 줄기 세포는 도금 후 섬유 아세포와 같은 세포 형태를 나타내고 중간 엽 줄기 세포 표면 항원이지만 조혈 세포 마커는 발포성 세포 마커를 발현하지 않습니다.
골, 콘드로 및 아디포겐성 분화와 관련된 형태학적 및 분자 수준에서의 변화는 또한 적절한 분화 칵테일 적용에 따라 치과 펄프 줄기 세포 배양에서 관찰된다. 10 및 20%의 조건부 배지 농도를 가진 스크래치-부상 종양 세포 배양의 치료는 대조군 중처리 종양 세포 배양에 비해 스크래치 폐쇄를 크게 증가시킨다. 치과 펄프 줄기 세포 삽입 공동 배양에서 분비 된 분자는 또한 대조 세포 공동 배양에 비해 부상당한 종양 세포에서 스크래치 폐쇄를 증가시켰다.
체외 세포 배양 내의 치과 펄프 줄기 및 종양 세포의 상호 작용에 대한 형광 현미경 분석은 종양 세포가 48 시간 후에 급속하게 증식하는 잘 조직 된 구조의 생성을 밝혀냅니다. 이 절차를 시도하는 동안, 감기 매체에 있는 2개의 조직 견본을 유지하고 세포 죽음을 극소화하기 위하여 실험실로 즉시 전송하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후, 이 기술은 인간에 있는 성인 줄기 세포 암 상호 작용을 탐구에 있는 줄기 세포 필드에 있는 연구원을 위한 도로를 포장했습니다.
이 절차에 따라, 다양한 줄기 세포 및 암 유형의 차동 표지 된 세포에 대한 면역 세포 추적과 같은 다른 방법은 성인 줄기 세포가 암세포와 상호 작용하고 암 전이를 제어하는 방법에 대한 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수 있습니다. 인간 샘플로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 전염병에 대한 환자 샘플을 분석하고 서면 환자 동의를 얻는 것과 같은 예방 조치는 이 절차를 수행 할 때 항상 구현되어야한다는 것을 잊지 마십시오.
