사이드로포어는 저분자, 금속 킬레팅 생체 분자로, 환경에서철 사이클링에 관여합니다. 이 프로토콜을 사용하면 토양 및 식물 샘플에서 측측 활성에 대한 신속한 높은 처리량 평가를 수행할 수 있습니다. 측측 검출을 위한 이전 방법은 미생물 지역 사회의 중요한 환경을 제거했습니다.
우리의 기술은 상대적으로 손상되지 않은 미생물 커뮤니티와 관련된 서식지 내에서 검출할 수 있게 합니다. 철 가용성은 농업 생산성에 매우 중요 하기 때문에, 그래서이 프로토콜에서 식물에 철의 가용성을 변조에 미생물의 역할을 조사 하는 데 사용할 수 있습니다. 또한,이 방법은 토양 건강과 사이드 로포어 생산 지역 사회에 농장 관리 관행의 영향뿐만 아니라 시간이 지남에 따라 이러한 지역 사회의 개발을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
시작하려면, 산성 세척 모든 유리 제품을 100 밀리머 염산 100 밀리머 질산은 CAS 분석에서 활용하기 전에 최소 2 시간 동안. 실험실급 모래로 채워진 알루미늄 베이킹 팬을 준비하고 알루미늄 호일로 덮습니다. 섭씨 121도에서 30분 간 오토클레이브를 따로 둡니다.
0365 그램을 이중 증분 수의 20 밀리리터에 추가하여 HDTMA를 준비하고 용해화를 촉진하기 위해 섭씨 37도의 수조에 용액을 배치하십시오. 0302 그램의 CAS를 이중 탈이온 수의 25 밀리리터에 넣고 멸균 마그네틱 스터디 바로 부드럽게 저어줍니다. 그런 다음 1개의 어금기 철 염화물 육수형 5밀리리터를 CAS 용액의 25밀리리터에 넣고 부드럽게 저어줍니다.
이제 20밀리리터의 HDTMA 용액을 철 CAS 복합 용액에 천천히 추가하면서 부드럽게 저어줍니다. 15.12 그램의 PIPES를 부드럽게 교반하여 이중 디온화 된 물의 375 밀리리터로 용해하여 완충액을 준비하십시오. 5개의 어금니 나트륨수산화물로 pH를 6.8로 조정합니다.
그런 다음 물을 추가하여 450 밀리리터에 볼륨을 가져옵니다. 이제 5 그램의 아가로즈를 솔루션에 추가합니다. PIPES 버퍼 용액과 철 CAS 복합 용액을 섭씨 121도에서 30분 동안 오토클레이브합니다.
각 철 CAS 복합 솔루션 전체를 생체 안전 캐비닛의 전체에 신중하게 추가하여 각 용광을 자동화한 후. 혼합 용액을 수조에 50°C로 놓습니다. 이제 멸균 시약 보트를 생물 안전 캐비닛 내에 멸균 모래에 놓고 섭씨 50도까지 가열하십시오.
철 CAS 복합 식기를 보트로 옮은 다음 100 마이크로 리터를 투명한 평평한 바닥 멸균 96 웰 마이크로 플레이트의 각 우물에 신속하게 알리쿼트합니다. 이전에 준비된 수정된 M9 배지에서 800 마이크로몰러 피버딘 표준을 준비한다. 용액을 400, 200, 100, 50, 25, 12.5 및 6.25 마이크로몰라 솔루션으로 희석합니다.
EDTA를 이전에 준비한 수정 된 M9 배지의 500 밀리리터에 추가하여 3.2 밀리머 EDTA 표준을 준비하십시오. 이 솔루션을 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12.5 및 6.25 마이크로몰러 솔루션으로 희석합니다. 표준 곡선을 생성하려면 각 피오버딘 및 EDTA 농도의 100 마이크로리터를 추가하여 철 CAS 복합 식기 100마이크로리터를 포함하는 96웰 마이크로플레이트의 웰을 분리합니다.
각 농도의 중복 기술 복제를 만듭니다. 또한 M9만으로 빈 우물을 추가합니다. 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 섭씨 22도에서 1, 6 및 24 시간 배양 후 흡광도를 측정하고 흡수성 측정을 사용하여 표준 곡선을 생성합니다. 샘플링 장비를 22마이크론 필터 더블 디온화 물로 씻은 다음 70%에탄올을 만들고 종이 타월로 닦습니다.
샘플링 전과 시료 사이에 세척을 수행하여 멸균 기술을 유지하고 교차 오염을 줄입니다. 식물 조직을 절제하고 현장의 식물에서 작은 루트 볼을 발굴 한 후 실험실 환경에서 샘플 분리를위해 별도의 라벨이 붙은 비닐 봉지에 루트 볼을 놓습니다. 모든 샘플을 얼음에 직접 놓고 사이드로포어 생산 분석용 시료가 처리될 때까지 섭씨 4도에 보관하십시오.
뿌리 관련 토양 샘플을 대량으로 분리하고, 느슨하게 결합된 뿌리 권토양과 단단히 결합된 뿌리권 토양으로 분리한다. 이렇게하려면, 가방에서 루트 볼을 가지고 부드럽게 루트 볼에서 토양을 흔들어. 토양을 흔들어 가방에 남아있는 토양과 함께 벌크 토양을 구성합니다.
이것은 느슨하게 결합 된 뿌리 권 토양입니다. 단단히 결합 된 샘플로 뿌리를 가져 와서 원심 분리 튜브에 넣어 단단히 바운드 된 rhizopshere 토양을 생성합니다. 2~3분 동안 30밀리리터의 이중 분해물과 소용돌이를 추가합니다.
뿌리를 제거하여 단단히 결합된 뿌리권 토양 슬러리 희석을 가져옵니다. 봉투를 열지 않고 토양을 가능한 한 많이 혼합하고 돌리면 샘플 백 내의 각 토양 샘플을 균질화합니다. 각 시료가 철저히 혼합된 후, 알리쿼트 및 멸균 50 밀리리터 원심분리기 관 내의 수정된 M9 배지 20밀리리터에서 각 토양 샘플의 2그램을 일시 중단한다.
샘플을 희석한 다음 멸균 폼 플러그로 튜브를 밀봉하여 식기를 허용합니다. 단단히 결합된 뿌리근체 스피어 샘플을 위해, 멸균 50 밀리리터 원심분리기 관 내에 변형된 M9 배지의 20 밀리리터에 뿌리근스피어 토양 슬러리의 2밀리리터를 추가한다. 샘플을 희석한 다음 멸균 폼 플러그로 튜브를 밀봉하여 식기를 허용합니다.
조직 샘플을 준비하려면 표면을 70%에탄올로 뿌리, 싹 및 곡물을 살균합니다. 30초 동안 블렌더를 사용하여 수정된 M9 배지의 20 밀리리터에서 2그램의 신선한 티슈를 마세이트합니다. 이어서, 시료를 멸균 50밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고, 희석하고, 멸균 폼 플러그로 튜브를 밀봉한다.
철 제한을 통해 사이드로포어 생산을 농축하려면 실온에서 50 밀리리터 원심분리기 튜브를 배양하고 160 RPM에서 흔들어줍니다. 농축 배양을 개시한 후 24, 48 및 72시간 후에 멸균 기술을 사용하여 농축 관으로부터 1밀리리터 서브샘플을 제거합니다. 10, 000회 G에서 1분간 2밀리리터 원심분리기 튜브에서 1분간 서브샘플을 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다.
멸균 기술을 사용하여, 마이크로 플레이트 내에서 중복 또는 삼중판에 철 CAS 복잡한 창고의 100 마이크로 리터 용액에 상체100 마이크로 리터를 추가합니다. 또한 멸균 M9 배지 100마이크로리터를 공백으로 추가합니다. 그런 다음 섭씨 28도에서 접시를 배양합니다.
각 플레이트는 인큐베이터에 배치되기 전에 호일로 밀봉되고 덮어야합니다. 각 샘플에 대한 나머지 상체및 펠릿을 자체 멸균 2 밀리리터 원심분리기 튜브로 중단합니다. 각 샘플 상피 튜브에 멸균 글리세롤 400 마이크로리터를 추가하고 글리세롤 주식을 만들기 위해 펠릿을 다시 중단합니다.
나중에 분석을 위해 주식을 영하 80도에서 동결하십시오. 420 나노미터의 파장에서 6, 24, 48 및 72 시간에서 흡광도를 측정합니다. 슈도모나스 형광에 의해 생체합성된 피오버딘 혼합물은 마이크로몰라의 피오버딘 동등성 샘플에서 시료의 흡수력을 해석하고 정량화하는 표준으로 사용되었다.
420 나노미터에서의 흡광도와 피버딘의 시작 농도 사이의 관계가 여기에 나와 있다. 72시간 농축의 사이드로포어 활성은 48시간 배양시 측측분리에 대한 유전자형 및 시료 유형의 영향을 결정하였다. 벌크 토양 샘플에서의 사이드로포어 활성은 상대적으로 낮았으며 벌크 토양이 샘플링된 밀 유전자형 간의 차이를 나타내지 않았다.
그러나 725개의 유전자형으로부터 분리된 느슨하게 결합된 토양의 농축은 Madsen과 727의 느슨한 경계 토양과 비교하여 더 큰 사이드로포어 생산을 보였지만 Lewjain에서 는 그렇지 않았습니다. 반대로, 단단히 묶인 토양으로부터 농축된 사이드로포어 생산은 유전자형에 의해 크게 영향을 받지 않았다. 곡물 조직의 농축 배양은 유전자형에 관계없이 상대적으로 낮은 사이드로포어 생산을 산출했다.
Lewjain 촬영 조직의 농축은 다른 유전자형보다 현저히 낮은 측측측생산이 있었고, 725회 는 조직 배양으로 인해 더 가변적인 사이드로포어 생산이 초래되었다. 사이드로포아르 활동의 가장 큰 차이는 725가 다른 모든 유전자형보다 200% 이상 더 큰 사이드로포어 활성을 가진 루트 조직 농축 배양에서 관찰되었다. 프로토콜을 실행하는 가장 과세측면 중 하나는 CAS 철 천 마이크로 플레이트를 생성하고 사이드로포어 활성을 위한 샘플을 테스트하는 많은 단계를 완료하는 동안 무균 상태를 유지하는 것입니다.
크로마토그래피 배양 기반 또는 DNA 기반 기술의 넓은 배열은 실제 마이크로티터 웰 또는 글리세롤 보존 문화에 적용하여 추가 생화확적인 검사 또는 유전적 특성화 및 대사 모델링을 위한 것입니다. 이 프로토콜 측로포어 활성을 사용 하 여 나중에 그 활동에 대 한 책임 특정 유기 체와 연결 될 수 있습니다 또는 이후 더 큰 생태 적 영향에 대 한 메커니즘으로 대상으로. 이 프로토콜은 공기, 물 및 퇴적물을 포함한 다른 환경 구획에서 수집된 샘플에서 생성된 농축 배양에서 사이드로포어 생산을 평가하기 위해 쉽게 수정될 수 있습니다.
