이 프로토콜은 높은 분해 잠재력을 가진 곰팡이 균주를 생물 정화 목적의 후보로 간주되는 토양 샘플에서 직접 분리하기 때문에 중요합니다. 이 프로토콜은 생물 치료 잠재력을 가진 곰팡이를 찾기위한 저비용 스크리닝입니다. 또한 해석하기 쉬운 결과를 제공합니다.
이 기술은 미생물을 취급하는 것을 포함하기 때문에 오염을 피하기 위해 층류 캐비닛 또는 Bunsen 버너를 사용하여 멸균 상태로 작업하는 것이 매우 중요합니다. 시작하려면 관심있는 토양을 샘플링하고 두 밀리미터 메쉬를 사용하여 토양을 체질하여 뿌리와 식물 파편을 제거하십시오. 층류 캐비닛 아래에서 체질 된 토양 1 그램을 멸균 된 15 밀리리터 튜브에 넣으십시오.
그런 다음 멸균 탈이온수 10 밀리리터를 첨가하여 마이너스 1 희석액에 10을 만듭니다. 튜브를 수평으로 30 분 동안 흔든다. 현탁액이 침전되기 전에, 멸균 피펫으로 마이너스 1 희석액에 10 밀리리터를 취하여 9 밀리리터의 탈이온수 블랭크로 옮겨 마이너스 두 희석액으로 10을 만듭니다.
서스펜션을 철저히 소용돌이치십시오. 유사하게, 마이너스 세 희석액을 10에서 마이너스 두 희석 튜브로 10으로 만든다. 선택적 매체에 토양 희석액을 도금하려면 멸균 점이있는 마이크로 피펫을 사용하여 마이너스 세 희석액에 10 마이크로 리터의 100 마이크로 리터를 모으고 휴믹 한천 페트리 접시에 옮깁니다.
멸균, 일회용, L자형 세포 살포기를 사용하여 희석액을 접시 표면에 고르게 분배하십시오. 그런 요리를 네 개에서 다섯 개까지 준비하십시오. 마찬가지로, 리그노셀룰로오스 접시를 10에서 마이너스 세 희석 튜브로 준비하십시오.
접시를 10 ~ 15 분 동안 공기 건조시킨 다음 어둠 속에서 섭씨 25도에서 15 일 동안 배양하십시오. 유사성에 대해 존재하는 모든 곰팡이 식민지를 확인하십시오. 필요한 경우 광학 현미경으로 관찰 할 슬라이드를 준비하십시오.
층류 캐비닛 아래 또는 Bunsen 버너에서, 멸균 접종 바늘로 콜로니에서 균사체의 작은 부분을 부드럽게 제거하여 선택된 각 곰팡이 균주를 분리하십시오. 분리된 콜로니를 새로운 맥아 추출물 한천 또는 MEA, 디쉬로 옮긴다. 20 밀리리터의 Bushnell Haas 또는 BH 매체를 50 밀리리터 유리 바이알로 옮깁니다.
7 밀리리터의 탈 이온수를 15 밀리리터 바이알로 옮기고 깨진 유리 커버 슬립 조각을 각 바이알에 넣으십시오. 바이알을 섭씨 121도에서 20분 동안 오토클레이빙하여 살균하십시오. 바셀린의 성장을 테스트하려면 층류 캐비닛 아래의 멸균 피펫을 사용하여 각 50 밀리리터 BH 바이알에 한 밀리리터의 페트롤라툼을 추가하십시오.
음성 대조군으로 BH 만 함유 한 바이알을 보관하십시오. 멸균 바늘을 사용하여 선택된 곰팡이 균주로 MEA 플레이트에서 배지 표면의 균사체를 제거하고 깨진 커버 슬립이있는 15 밀리리터 유리 바이알로 옮깁니다. 바이알을 소용돌이 믹서에서 두 분 동안 교반하여 깨진 덮개가 곰팡이 식민지의 큐브를 자르고 현탁액을 만들 수있게하십시오.
각 페트롤라툼 바이알에 200 마이크로리터의 현탁액을 접종하십시오. 각 곰팡이 균주에 대해 두 번의 반복실험을하십시오. 음성 대조군의 경우, 200 마이크로리터의 진균 현탁액을 BH 배지만을 함유하는 바이알에 첨가한다.
또한, 배지의 오염을 확인하기 위해 곰팡이 접종없이 페트롤라툼으로 바이알을 보관하십시오. 암흑에서 섭씨 25도에서 바이알을 배양하고 접종 후 15 및 30 일 후에 관찰하십시오. 중고 엔진 오일의 성장을 테스트하려면 사용 된 엔진 오일 500 마이크로 리터를 BHA 페트리 접시에 옮기고 오일을 고르게 분배하십시오.
이어서, MEA 플레이트로부터 균사체를 수집하여 진균 균주로 플레이트를 접종한다. 플라스틱의 성장을 테스트하려면 200 마이크로 리터의 곰팡이 현탁액을 96 마이크로 웰 플레이트로 옮깁니다. 곰팡이 균주 - 플라스틱 조합의 세 가지 복제물을 만드십시오.
곰팡이 현탁액으로 각 웰에 10 밀리그램의 다른 플라스틱 분말을 넣으십시오. 음성 대조군의 경우, 200 마이크로리터의 BH 배지를 곰팡이 현탁액으로 웰에 첨가한다. 또한 각 플라스틱 분말에 대해 200 마이크로 리터의 BH 용액과 10 밀리그램의 각 플라스틱 먼지로 우물을 채워 오염을 검사하십시오.
플레이트를 어둠 속에서 섭씨 25도에서 배양하고 15 일과 30 일 후에 관찰하십시오. 정성적 laccases 열량 측정을 위해, 감자 덱스트로스 한천 또는 PDA 한 리터를 준비하고 20 분 동안 오토클레이브하십시오. 오토클레이빙 후, 배지가 냉각되었지만 여전히 액체가 될 때, 층류 후드 아래에 400 마이크로 리터의 guaiacol을 넣고 페트리 접시에 접시에 넣습니다.
PDA guaiacol 플레이트를 진균 균주로 접종하여 MEA 플레이트로부터 균사체를 수집하였다. 음성 대조군의 경우, 각 곰팡이 균주와 PDA 및 guaiacol로 하나의 플레이트로 PDA 플레이트를 준비하십시오. 어둠 속에서 섭씨 25도에서 플레이트를 배양하고 칠일 후에 관찰하십시오.
정성적 에스테라제 테스트를 위해, Tween 80 배지 한 리터를 준비하십시오. 이어서, 배지를 가열하지 않고 자기 교반기 상에 놓고 배지 내부에 교반 막대를 가한다. 10 분 후, 모든 것이 녹을 때, 다섯 밀리리터의 배지를 20 밀리리터의 멸균 바이알과 오토클레이브에 옮깁니다.
200 마이크로 리터의 곰팡이 현탁액을 Tween 80 중간 멸균 바이알에 넣으십시오. 음성 대조군의 경우, 오토클레이브 BH 배지 다섯 밀리리터를 20밀리리터 바이알에 넣으십시오. 그런 다음 200 마이크로 리터의 곰팡이 현탁액을 바이알에 첨가하십시오.
바이알을 어둠 속에서 섭씨 25도에서 21 일 동안 배양하고 칠일마다 관찰하십시오. 바셀린에서 자랄 수있는 곰팡이 균주의 비율, 엔진 오일 및 플라스틱 분말을 다른 정도의 성공을 가진 유일한 탄소 공급원으로 사용했습니다. 페트롤라툼을 이용하는 진균의 능력은 조절된 BH와 바셀린을 함유하는 것 사이의 콜로니 성장의 차이로서 평가되었다.
시험된 균주의 거의 75%가 석유를 유일한 탄소원으로 사용할 수 있었고 21%는 최대 성장을 보였다. BHA만을 함유하고 엔진 오일이 있는 상태에서 플레이트의 성장도 모니터링되었습니다. 균주의 거의 90 %가 중고 엔진 오일에서 자랐으며 39 %는 최대 성장을 보였습니다.
곰팡이 식민지 주위에 적갈색 후광이 형성되면 laccases 및 기타 ligninolytic 효소의 생산량이 높아졌습니다. 곰팡이의 약 60 %가 laccase를 생산할 수있었습니다. 또한, 균주의 17 %는 guaiacol 배지의 식민지 주위에 강렬한 어두운 후광을 생성했습니다.
에스테라제 활성은 Tween 80 배지에서 백색 침전물의 형성에 의해 평가되었다. 거의 60%의 균주가 에스테라제 활성을 보였고 13%는 더 높은 침전물 형성을 보였다. 이 프로토콜은 최소한의 배양 배지에 관심있는 석회화 물질을 추가하여 모든 오염 물질을 분해 할 수있는 곰팡이를 선별하도록 조정할 수 있습니다.
