뇌 혈관은 관통 동맥, 모세 혈관, 그리고 오름차순 의 정맥의 복잡한 네트워크입니다. 이 혈관은 알파 부드러운 근육 액틴을 표현하는 천신 pericytes와 같은 벽화 세포에 의해 싸여 있으며, 관통 동맥에서 처음 네 가지 내에서 발견된다. 우리는 Acta2-RCaMP 1.07 형질전환 마우스를 사용하여 유전적으로 인코딩된 칼슘 지표 RCaMP의 발현을 통해 이러한 세포에서 칼슘 과도를 시각화합니다.
칼슘은 이러한 세포와 혈류 조절의 수축에 강한 역할을 한다. 모세관 pericytes는 혈관 네트워크에서 더 먼 하류에서 찾아내고 그밖 형질 생성모형에 표지될 수 있습니다. 그러나, 우리는이 방법에 pericytes를 ensheathing에 초점을 맞추고 있습니다.
우리의 마우스는 화상 진찰을 위한 두뇌 혈관에 접근을 허용하는 만성 두개골 창으로 외과적으로 이식되었습니다. 여기서, 우리는 pericyte 칼슘 데이터 및 마취 동물의 혈류에 대한 정보를 획득하는 데 필요한 두 개의 광자 이미징 및 분석 방법에 따라 필요한 준비 단계와 꼬리 정맥 주입을 설명합니다. 꼬리 정맥 카테터 주입에 필요한 항목: 인슐린 주사기, PE10 튜브의 15 센티미터 조각, 30 게이지 바늘, 거즈, 식염수, 집게, 녹색 형광염, 펜치, 및 가위.
우리는 또한 케타민 자일라진 마취를 가진 바늘이 있어 혈류 측정을 위한 이소플루란보다 낫기 때문에 화상 진찰 전에 주입할 것입니다. 펜치를 사용하여 허브에서 30 게이지 바늘을 끊습니다. 식염수 채워진 주사기에 부착 된 PE10 튜브의 조각의 끝에 바늘을 조심스럽게 삽입합니다.
이것은 주입을위한 카테터입니다. 이소플루란으로 마우스를 마취하고 I-루브 젤을 바르습니다. 꼬리에 따뜻한 물이 있는 장갑장을 놓고 측면 정맥을 넓습니다.
에탄올로 꼬리를 청소한 후 바늘을 정맥에 넣고 카테터를 통해 식염수에 부드럽게 주입하여 바늘이 올바르게 배치되도록 합니다. 코테터의 주사기를 전환하여 형광제 드엑스트라인 염료로 채워진 주사기를 제거합니다. 천천히 염료를 주입하여 거품이 튜브에 들어가지 않도록 합니다.
덱스네 주사기를 식염수 주사기로 교체하고 튜브에 염료가 남지 않고 튜브를 헹굴수 있습니다. 바늘을 제거하고 거즈로 누릅니다. 화상 진찰을 위해 케타민 자일라진 마취를 주입하십시오.
가열 패드에 고정 된 마우스 헤드로 치과 어플리케이터로 두개골 창을 청소하십시오. 창에 초음파 젤을 바르고 두 개의 광자 현미경 목표를 통해 집중하십시오. 두 개의 광자 이미징의 경우, 당사는 방출 감지를 위해 형광, 여기 및 광증 증식관을 위해 튜닝 가능한 티타늄 사파이어 레이저가 있는 현미경을 사용합니다.
현미경 소프트웨어에서, RCaMP와 형광 dextran 모두를 흥분시키기 위해 파장을 990 나노미터로 설정합니다. 다음으로 포크셀 전압과 PMT 검출기 감도를 조정하여 레이저 전력을 설정합니다. 이러한 매개 변수및 고해상도, RCaMP 양성 벽화 세포 및 형광으로 표지된 혈장으로 실시간 스캐닝을 볼 수 있다.
심도 스택을 획득하여 혈관 네트워크에서 pericytes를 올바르게 찾는 것이 좋습니다. PO 혈관 근처의 조직의 상단에 초점을 맞출 때, 이것을 제드 시리즈 스택의 제로 포인트 와 상단으로 설정한 다음 조직을 원하는 깊이로 집중하고 이를 스택의 바닥으로 설정합니다. 현미경이 스택을 통해 더 깊게 이동함에 따라 레이저 전력을 조정하여 증가시켜야 합니다.
이미지 처리 소프트웨어에서 제드 시리즈를 열고 두 채널을 컬러 이미지로 병합하고 스택을 통해 관심 있는 혈관을 스캔합니다. pericytes를 포함하는 관심 영역을 선택하고 향후 이미징 세션에서 이러한 스팟을 다시 찾는 데 도움이 되는 위치를 저장합니다. 회혈 칼슘 이벤트를 수집하고 이동하려면 획득 프레임 속도를 초당 10프레임 이상으로 늘립니다.
이미징 기간을 60초로 설정하고 고유한 파일 이름으로 저장 경로를 업데이트합니다. 용기에 광학적으로 줌을 사용하여 낮은 해상도를 고려하고 회화물을 더 자세히 볼 수 있습니다. T 계열을 획득합니다.
혈관 직경과 적혈구 속도를 측정하려면, 현미경으로 1 차원 검사를 시작하기 위해 라인 스캔을 선택합니다. 먼저 스캔 기간을 밀리초 단위로 설정합니다. 그런 다음 관심있는 선박을 양분하고 선박을 따라 평행하게 움직이는 선을 그립니다.
이것은 왼쪽에 혈관 직경의 kymograph를 생성하고 오른쪽에있는 혈관을 통해 이동하는 적혈구의 줄무늬. 이 프로토콜에 사용되는 프로그램 및 패키지의 전체 목록은 재질 테이블을 참조하십시오. 먼저 이미지 처리 소프트웨어에 손으로 관심 영역을 선택합니다.
T 시리즈 파일을 로드하고 스택의 평균을 가지고 색이미지를 만듭니다. 다각형 도구를 선택하고 소마 및 프로세스와 같은 눈에 보이는 열반 페리시테 구조를 간략하게 설명합니다. 관심있는 각 영역에 고유 한 이름을 주고 프로그래밍 소프트웨어의 나중에로드 할 수있는 zip 폴더로 저장합니다.
프로그래밍 소프트웨어를 열고 이미지 처리 패키지의 폴더가 경로에 있는지 확인합니다. 칼슘 T 계열을 프로그래밍 소프트웨어로 가져오고 각 채널에 있는 것을 정의합니다. 이 경우 채널 2의 채널 1 및 혈장에 대한 세포 신호입니다.
시각화를 용이하게 하기 위해 프로그래밍 소프트웨어 내에서 데이터를 동영상으로 플롯합니다. 빨간색 RCaMP 채널로 흘러 들어가는 형광 dextran에서 녹색 형광을 제거하기 위해 이미지 처리 패키지의 채널을 혼합 취소하십시오. 먼저 이 경우 불소 1, RCaMP만 포함하는 영역을 선택합니다.
두 번째는 혈장에 형광2, 형광을 포함하는 영역을 선택한다. 마지막으로 불소가 없는 배경 영역을 선택합니다. 이렇게 하면 각 채널의 각 픽셀에 적용되는 스펙트럼 기여 매트릭스가 생성됩니다.
RCaMP 신호의 국소화를 크게 향상시켜 이러한 구조에서 칼슘 사건의 검출을 향상시킵니다. 화상 처리 패키지 내에서 칼슘 이미징 데이터를 분석할 수 있는 여러 가지 방법이 있습니다. 먼저 혼합되지 않은 칼슘 동영상상에 세포 신호 분석을 실행하고, 손으로 백혈구로부터 선택된 지퍼 폴더로부터 관심 영역을 로드한다.
영역크기를 조정할 필요가 없으므로 배율 계수를 하나로 설정합니다. 처리 후 각 ROY와 정규화된 칼슘 흔적을 다른 색상으로 생성합니다. 코드가 개별 추적에서 대부분의 칼슘 이벤트를 감지하지 못하는 경우, T 계열의 첫 30프레임인 기준 기간의 표준 편차인 단축 패스 필터링 데이터에 대한 임계값을 3배로 줄이는 등 최적화 상자 내의 기본 제공 매개변수를 수정합니다.
신호를 감지하고 분류하기 위해 정규화된 칼슘 트레이스는 긴 패스와 대역 패스 필터링되어 진폭 및 추정데이터를 원활하게 할 뿐만 아니라 신호가 단일 피크, 다중 피크 또는 고원인지 를 결정하는 데 도움이 됩니다. 추가 통계 분석을 위해 데이터를 CSV 파일로 출력합니다. 세포 신호 분석을 혼합된 칼슘 동영상에서 두 번째로 실행하고 3차원, X, Y 및 시간으로 형광의 활성 및 변화에 따라 자동 이자 식별 영역을 선택합니다.
식별된 관심 영역을 보려면 프로세스 결과를 플롯하는 것은 색상이 다릅니다. 알고리즘이 영화에서 눈으로 명확하게 보이는 ROY를 감지하지 못하면 데이터를 제 시간에 부드럽게 하는 가우시안 필터를 늘리고 기준선의 표준 편차의 표준 편차를 찾는 임계값을 줄이는 등의 기본 제공 매개 변수를 수정합니다. 추가 시각화를 위해 ROY를 영화로 플롯합니다.
추가 통계 분석을 위해 데이터를 CSV 파일로 출력합니다. 라인 스캔 kymograph 데이터 파일을 프로그래밍 소프트웨어로 가져오고 각 채널에 있는 내용을 정의합니다. 라인 스캔에서 직경 분석 함수를 실행하여 상자를 열어 kymograph의 직경에 해당하는 영역을 선택합니다.
혈관 직경에 해당하는 키모그래프 형광의 경계 바깥에 상자를 그립니다. 이 데이터 클래스를 처리하여 선박 직경의 절반 최대값으로 전체 폭을 측정하고 플롯을 생성합니다. 다음으로 변환 분석에 대한 속도 속도를 실행하고 kymograph 형광의 테두리 안에 상자를 그립니다.
적혈구의 속도, 플럭스 및 선형 밀도를 계산하기 위해 이 데이터 클래스를 처리합니다. 추가 분석을 위해 혈류 결과를 CSV 파일로 출력합니다. 손으로 세포 구조를 선택하면 정규화된 칼슘 흔적이 낮은 패스 와 대역 패스여과 같은 단일 피크 및 다중 피크와 같은 다양한 유형의 신호 피크를 포함하여 이들 영역 내의 칼슘 변동을 감지할 수 있습니다.
또한 이미지 처리 알고리즘을 사용하여 시간이 지남에 따라 형광의 강도가 변경되는 활성 픽셀을 함께 그룹화하여 관심 영역을 식별합니다. 이는 신호의 예상 크기와 모양을 포괄하는 시간, 임계값 및 공간 파라미터를 조정하여 동적 셀룰러 신호에 적용될 수 있다. 신호 식별 임계값을 줄이면 관심 영역이 더 많이 발견됩니다.
명확한, 혈역학 kymographs는 심시 백혈구 근처 혈관에 있는 직경 그리고 적혈구 속도를 측정하기 위하여 분석됩니다. 직경은 전체 폭에서 형광의 절반 최대값으로 계산됩니다. 적혈구 속도는 라벨이 없는 적혈구로 만든 줄무늬에서 근사치되며, 각도는 라돈 변환으로 입력되어 속도를 계산합니다.
형광 포화도, 노이즈 비율에 대한 신호 불량 또는 이미징 필드의 움직임이있는 열악한 품질 kymographs는 데이터를 결정할 수없는 적색 십자가로 표시된 오류 지점으로 신뢰할 수없는 플롯을 만듭니다. 획득된 데이터의 품질은 좋은 결과에 중요하며 이 프로토콜에 설명된 단계를 따라 하면 좋은 결과를 얻을 수 있습니다. 이 비디오에서는 두 개의 광자 현미경 검사법에 의한 뇌 내포성 과혈 측정의 결합된 칼슘 이미징 절차를 설명합니다.
이러한 기술은 뇌 혈관 네트워크 내의 벽화 세포 생리학 및 국소화에 대한 질문을 해결하는 데 유용하지만 뇌 또는 다른 장기 시스템의 모든 세포 유형에서 칼슘 과도를 연구하도록 조정할 수 있습니다.
