중첩 된 RT-PCR은 승인 된 모든 16 ICTV 및 두 개의 새로운 Lysavirus 종을 포함하여 모든 Lysaviruses를 감지하기 위해 개발되었습니다. 이 방법의 검증은 중국에서 임상 광견병 진단 및 감시의 10 년에서 9000 개 이상의 동물 뇌 표본을 사용하여 입증되었습니다. 중첩 된 RT-PCR은 신선한 뇌 조직 샘플뿐만 아니라 저하 된 샘플에서도 신뢰할 수있는 결과를 생성 할 수 있습니다.
침수 방법은 뇌척수액, 타액 및 소변과 같은 생물학적 유체 표본을 분석하는 데 사용될 수 있으며, 이에 따라 이 방법은 최후통첩 진단에 적용될 수 있다. PCR 이월 오염을 최소화하기 위해서는 음수 및 양성 제어를 준비하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 각 RNA 추출에 대한 준비, PCR 설정 및 겔 전기전도는 물리적으로 분리된 영역에서 작동되어야 합니다.
또한 펩티드 사슬에 대한 광견병 오염을 방지하기 위해 RNA 추출 및 역전사에 나선형 테이프를 사용하는 것이 좋습니다. 얼음에 에이전트를 준비, 정기적으로 장갑을 변경, 리보누브리스 무료 재료의 사용과 같은 적절한 취급은 ribonuclease의 도입을 방지하고 RNA의 저하를 제거합니다. 이 절차를 시작하려면, 광견병 의심 조직에서 RNA를 추출, 피부 생검, 타액, 뇌척수액 또는 RABV 감염 된 세포 배양 텍스트 프로토콜에 설명 된 대로.
진행 준비를 마쳤을 때, 필요한 시약을 냉동고에서 제거하고 얼음 위에 보관했습니다. 사용하기 전에 각 시약을 해동하고 소용돌이치십시오. cDNA에 바이러스 RNA의 역전사를 위해 클린룸내 텍스트 프로토콜의 표 1에 설명된 바와 같이 얼음에 대한 각 샘플에 대한 12 마이크로 리터의 반응 혼합과 1.5 밀리리터 원심분리관을 준비한다.
파이펫팅 변형을 고려하여 필요한 것보다 적어도 하나의 반응 크기인 마스터 믹스의 볼륨을 준비한 다음 반응 혼합물을 0.2 밀리리터 PCR 튜브로 나눕니다. 템플릿 룸의 PCR 워크스테이션에서 샘플 또는 제어 중 하나의 8마이크로리터를 반응 믹스에 추가합니다. 양성 조절은 고정 RABV 균주 CVS11에 감염된 세포 배양에서 추출된 RNA이며, 음의 대조군은 Rnase 가 없는 이중 증류수를 함유하고 있다.
각 튜브의 내용을 먼저 소용돌이로 혼합한 다음 잠시 원심 분리하여 혼합합니다. 그 후 반응 튜브를 열순환기로 로드합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 cDNA 합성 프로그램을 설정하고 실행합니다.
먼저 필요한 시약을 검색하고 사용할 준비가 될 때까지 클린룸에서 얼음을 보관하십시오. 준비가 되면 시약을 해동하고 소용돌이시합니다. 다음으로, 텍스트 프로토콜의 표 2에 설명된 바와 같이 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브에서 각 샘플에 대해 48개의 마이크로리터를 준비하고 반응 혼합을 0.2 밀리리터 PCR 튜브로 나눕니다.
템플릿 룸의 PCR 워크스테이션에서 첫 번째 라운드 PCR 믹스에 cDNA의 마이크로리터 샘플 2개를 추가합니다. CVS11 cDNA의 마이크로리터 2개와 양수 조절으로 이중 증류수 2개의 마이크로리터를 음수 대조군으로 포함시게 한다. 그런 다음 텍스트 프로토콜의 표 3에 나열된 매개 변수를 사용하여 밀봉 된 튜브를 PCR 열순환기 및 사이클로 전송합니다.
시작하려면, 텍스트 프로토콜의 표 4에 설명된 바와 같이 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브에서 각 샘플에 대해 각 샘플에 대해 48마이크로리터를 준비하고 반응 혼합을 0.2 밀리리터 PCR 튜브로 나눕니다. 두 번째 라운드 PCR 믹스에 첫 번째 라운드 PCR 제품의 마이크로 리터 2개를 추가합니다. 이 PCR 라운드에 대한 음의 제어로 이중 증류수를 포함하십시오.
그런 다음 텍스트 프로토콜의 표 3에 나열된 매개 변수를 사용하여 PCR 써모사이클링을 수행합니다. 먼저 1.5그램의 아가로즈를 트리스 아세테이트 EDTA 100밀리리터에 넣고 전자레인지에 가열하여 철저히 녹입니다. 다음으로, 최종 농도0.01%의 최종 농도에서 에티듐 브로마이드를 추가하여 젤을 금형에 붓고 30분 이상 주변 온도에서 고화하게 둡니다.
각 PCR 제품의 5마이크로리터를 6배 로딩 버퍼 1개에 혼합하여 적재 샘플을 준비합니다. 별도로 샘플과 적합한 DNA 마커를 우물에 적재하고 염료 라인이 젤 아래로 약 75 ~ 80 %가 될 때까지 120 볼트에서 약 30 ~ 45 분 동안 젤을 실행합니다. 실행이 완료되면 전원을 끄고 전원에서 전극을 분리합니다.
그런 다음 젤 상자에서 젤을 조심스럽게 제거합니다. UV 젤 문서화 장치를 사용하여 DNA 조각을 시각화하고 촬영합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 중첩된 역전사 PCR을 특성화합니다.
18개의 리사바이러스 종을 검출하기 위해 대표적인 중첩 된 RT-PCR의 결과가 여기에 나와 있다. PCR 포지티브 컨트롤은 1라운드 증폭에서 845개의 베이스 페어와 2라운드 371개의 베이스 페어로 예상 대역을 보여줍니다. 음수 컨트롤에 대해 어떤 밴드도 볼 수 없습니다.
모든 18 Lyssaviruses는 중첩 된 RT-PCR모든 18 Lysaviruses를 검출했음을 나타내는 긍정적 인 제어와 동일한 두 개의 밴드를 생산하는 것으로 보입니다. 플라스미드 중 16개는 PCR 2라운드에서 효율적인 증폭을 가하지만, 그 중 2개, 아라반 바이러스및 이코마 바이러스는 각각 1라운드 또는 2라운드에서만 증폭된다. 이 방법의 감도는 마이크로리터 당 2.24에서 2, 240 분자에 이르는 값에서 다른 Lyssavirus 플라스미드의 검출에 따라 다릅니다.
이러한 차이는 바이러스 성 시퀀스 다양성으로 인해 프라이머와 템플릿 간의 불일치에 기인 할 수 있습니다. 중첩 PCR에 의해 테스트되는 임상 표본의 9, 624 뇌 조직을 비교한 결과, RT-PCR을 100%의 감도로 중첩하고 99.97%의 특이성으로 중첩된 것으로 나타났으며, 두 방법 사이의 특성은 99.07%의 다른 광견병 실험실이 99.07%의 다른 광견병 실험실을 통해 중첩된 RT-PCR의 유효성을 검사하도록 초대되었다. 모든 10개의 실험실은 중첩된 RT-PCR 결과, 가중된 RT-PCR이 높은 특이성과 재현성을 가지고 있음을 나타내는 거짓 네거티브 또는 거짓 긍정없이 FAT에 따라 100%인 중첩 된 RT-PCR 결과를 얻었다.
RT-PCR은 이제 광견병 기술을 사용하기 위해 OIE에서 권장합니다. 그리고 우리의 중첩 RT-PCR은 2018 년 중국에서 광견병 기술의 국가 표준으로 입증되었습니다.
